Comparative Analysis of Mutation in the Buccal Epithelium and Blood in Patients with Lung Cancer and Healthy People

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация

Lung cancer is one of the leading causes of cancer death. Finding new methods for the early and accurate diagnosis of lung cancer is critical for effective treatment. We have shown that patients with lung cancer have more mutations in the FLT3, PDGFRA, KDR, PIK3CA, HRAS, FGFR3 genes in the buccal epithelium than people without diagnosed lung cancer. Thus, study of molecular alterations may be used as a method for the accurate diagnosis of lung cancer in the early stages of investigational procedure.

Негізгі сөздер

Толық мәтін

На сегодняшний день рак легкого занимает ведущую позицию (16.1%) в структуре онкозаболеваний по России. По данным на 2019 год в России у мужчин рак легкого опережает все остальные новообразования. Среди женского населения рак легкого занимает 10-е место (3.8%), уступая по частоте встречаемости раку кожи (кроме меланомы) (15.2%), раку молочной железы (21.2%), шейки матки (5%), тела матки (7.8%), яичников (4.1%), гемобластозам (4.7%), раку желудка (4.4%), ободочной кишки (7.3%), прямой кишки (4.4%) и прочим (9.8%). За 2019 г. заболеваемость раком легкого составила 47005 человек. Рак легких является одной из ведущих причин смертности от онкозаболеваний [1]. Абсолютное число умерших от данного заболевания по России в 2019 г. составило 50046 человек. Более 1/4 (25.5%) случаев смерти среди мужчин обусловлены раком легкого, бронхов и трахеи. Среди женщин смертность от рака легкого занимает 7.1%. Высокая смертность во многом обусловлена тем, что у 75% пациентов рак легких диагностируется на поздних стадиях, когда возможности лечения сильно ограничены [2]. Поиск новых методов ранней и точной диагностики рака легких имеет решающее значение для его эффективного лечения.

На данный момент наиболее распространены инвазивные технологии диагностики рака легкого, к которым относят в первую очередь бронхоскопические исследования (brush-биопсия, бронхоальвеолярный лаваж и эндобронхиальная ультразвуковая биопсия) [3]. Однако инвазивность и необходимость в привлечении высококвалифицированного врача не дает возможности использовать данные методы для популяционного скрининга [4]. Неинвазивными методами можно анализировать мокроту и буккальный эпителий. Для диагностики рака легкого в мокроте анализируются клеточные аберрации с использованием цитологических методов, профили метилирования генов, соматические мутации, анализируют микроРНК [5]. Но зачастую исследователи сталкиваются с трудностями во время сбора мокроты. Обычно эти трудности возникают при работе с некурящими пациентами и людьми без воспалительных заболеваний дыхательных путей [6]. Буккальный эпителий, который располагается в ротовой полости гораздо более доступный объект исследования. Пациенты с раком легкого подвергают легкие и полость рта воздействию одних и тех же повреждающих факторов, к которым в первую очередь относятся канцерогены, содержащиеся в табачном дыме [7].

Было показано, что изменения профиля метилирования в бронхиальных тканях, вызванные курением, коррелируют с изменениями в метилировании в ткани ротовой полости [8]. У пациентов с раком легкого увеличивается цитогенетическая нестабильность, что проявляется в увеличении числа клеток с микроядрами, увеличивается частота полиморфизмов в генах Р53 и murine double minute 2 (MDM2) [9].

Цель данного исследования – изучить мутационный профиль клеток буккального эпителия пациентов с раком легкого в сравнении с буккальным эпителием контрольной группы (лиц без диагностированных злокачественных новообразований), а также с герминативными мутациями в крови пациентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Участниками исследования являлись пациенты Воронежского областного клинического онкологического диспансера с диагностированным раком легкого, которые не подвергались лечению на момент сбора биологического материала для исследования. В контрольную группу входили пациенты онкологического диспансера без диагностированного рака легкого или иных заболеваний дыхательных путей. Подробное описание параметров экспериментальной и контрольной групп представлено в табл. 1. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом Воронежского государственного университета и соответствовал основным положениям Хельсинкской декларации. От всех участников было получено информированное письменное согласие на включение в исследование. Все участники были проинформированы о последующих генетических исследованиях, проводимых с их биологическим материалом.

 

Таблица 1. Подробное описание экспериментальной и контрольной групп

Параметр

Контроль (n = 9)

Рак легкого (n = 20)

Возраст (средний ± ст.отк.)

61.2 ± 8.7

46.7 ± 10.7

Пол (муж./жен.)

0/9

18/2

Статус курения (не курит/курил ранее/курит)

7/0/2

4/4/12

Количество пациентов с детектируемым H2O2 в КВВ

3

14

Средняя концентрация H2O2 в КВВ (нмоль)

49.2 ± 25.9

506.7 ± 96.5

Гистология

  

Мелкоклеточный рак легкого

−

2

Плоскоклеточный рак легкого

−

1

Крупноклеточная карцинома

−

2

Аденокарцинома

−

15

Стадия (I/II/IIIA/IIIB/IV)

−

0/3/6/8/3

Первичная опухоль (TX/T1/T2/T3/T4)

−

0/2/8/2/8

Региональные лимфатические узлы (NX/N0/N1/N2/N3)

−

1/2/5/10/2

Отдаленные метастазы (MX/M0/M1)

−

0/17/3

 

Сбор образцов буккального эпителия осуществлялся медицинским работником с помощью щетки FloqSwab и помещался в пробирку с консервирующим ДНК раствором (Helikon, Россия). Для сбора периферической крови медицинский работник использовал вакуумные пробирки, покрытые гепарином.

Геномная ДНК была выделена из клеток буккального эпителия и крови с использованием набора Quick-DNA Miniprep Plus Kit (Zymo Research, США) согласно прилагаемому протоколу. Качественный анализ изолированной ДНК осуществляли с помощью горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле в 1x ТАЕ-буфере с окрашиванием бромистым этидием. Измерение концентрации ДНК проводили при помощи флуориметрической системы Qubit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с прилагаемым протоколом.

Для последующего секвенирования проводилась таргетная амплификация с использованием панели праймеров AmpliSeq Cancer HotSpot Panel v2 (Thermo Fisher Scientific, США) на платформе Ion Torrent PGM. Библиотеки для секвенирования готовили, используя набор реактивов Ion AmpliSeq ™ Library Kit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Библиотеки были мультиплексированы с использованием уникальных баркодов из пула IonXpress.

Для идентификации полиморфизмов использовалось Ion Torrent Suite версии 5.10 и Torrent Variant Caller plugin версии 5.10.0.16. Все полиморфизмы с низким качеством прочтения и/или недостаточным покрытием были отфильтрованы. Аннотация полиморфизмов проводилась с использованием ENSEMBL Variant Effect Predictor версии 97. Для последующей обработки использовалось VCFtools версии 0.1.13.

Сравнение частот встречаемости мутантных вариантов гена и вариантов гена дикого типа проводили по критерию χ2 Пирсона. Правильность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилкса. Для оценки достоверности различий между группами использовался U критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мутационный профиль в крови

Наибольшее количество мутаций в крови было выявлено в гене FLT3 (66.7% среди здоровых и 65% среди людей с раком легкого), а именно мутация rs2491231. Ген FLT3 (fms-like tyrosine kinase 3) кодирует тирозинкиназу рецептора III класса, регулирующую кроветворение и играющую важную роль в выживании и пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников.

Мутационный профиль в крови и буккальном эпителии

Высокая мутабильность наблюдалась в гене PDGFRA (Platelet-derived growth factor receptor alpha) (55% у пациентов с раком легкого против 11.1% у здоровых людей, p < 0.05 по χ2 Пирсона). Наиболее часто в этом гене встречалась мутация rs1560480581. Данная мутация представляет собой однонуклеотидный полиморфизм. Ген PDGFRA кодирует рецептор тирозинкиназы клеточной поверхности для членов семейства факторов роста тромбоцитов. Эти факторы роста являются митогенами для клеток мезенхимального происхождения. Исследования показывают, что этот ген играет роль в развитии органов, заживлении ран и прогрессировании опухолей.

Также высокая мутабильность наблюдалась в гене KDR (50% у пациентов с раком легкого против 11.1% у здоровых людей, p < 0.05 по χ2 Пирсона). Ген KDR (kinase insert domain receptor) кодирует один из двух рецепторов VEGF (фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является основным фактором роста эндотелиальных клеток). Этот рецептор, известный как рецептор домена вставки киназы, представляет собой рецепторную тирозинкиназу типа III. Он функционирует как главный медиатор VEGF-индуцированной пролиферации эндотелия, выживания, миграции, морфогенеза канальцев и прорастания.

У здоровых людей в крови не было обнаружено мутаций в генах TP53 (tumor protein p53), RET (ret proto-oncogene), ERBB4 (erb-b2 receptor tyrosine kinase 4), SMAD4 (SMAD family member 4), HRAS (HRas proto-oncogene, GTPase), однако они были обнаружены у пациентов с раком легкого (50% для гена TP53, p < 0.05 по χ2 Пирсона; 25% для гена RET, p =0.09 по χ2 Пирсона; 20% для генов ERBB4, SMAD4, различий по χ2 Пирсона не было выявлено; 5% для гена HRAS, различий по χ2 Пирсона не было выявлено) (рис. 1).

 

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций в крови (а) и буккальном эпителии (б) здоровых людей и пациентов с раком легкого. * – p <0.05, различия частот встречаемости по χ2 Пирсона статистически достоверны

 

Было выявлено, что в буккальном эпителии мутации в гене FLT3, встречаются у 85% пациентов с раком легкого, в то время как у контрольной группы только в 55.6% случаев (p = 0.08 по χ2 Пирсона). Мутации в гене PDGFRA встречаются у 40% пациентов с раком легкого и 11.1% людей из контрольной группы (p < 0.05 по χ2 Пирсона). Мутации в гене KDR встречаются у 65% пациентов с раком легкого и 22.2% людей из контрольной группы (p < 0.05 по χ2 Пирсона). Мутации в гене PIK3CA встречаются у 50% пациентов с раком легкого и у 11.1% людей из контрольной группы (p < 0.05 по χ2 Пирсона). Мутации в гене HRAS встречаются у 25% пациентов с раком легкого и 11.1% людей из контрольной группы (p = 0.09 по χ2 Пирсона). У контрольной группы не было обнаружено мутаций в буккальном эпителии в гене FGFR3, в то время как 25% пациентов с раком легкого были выявлены мутации (p < 0.05 по χ2 Пирсона).

Мы не выявили различий в частотах встречаемости мутаций в крови и буккальном эпителии пациентов в зависимости от стадии рака (табл. 2, 3). Также мы показали, что курение не влияет на частоту встречаемости мутаций у пациентов с раком легкого (табл. 4).

 

Таблица 2. Сравнение частот встречаемости мутаций в буккальном эпителии пациентов с раком легкого на разных стадиях. Различия частот встречаемости по χ2 Пирсона

Ген

II

IIIА

IIIВ

IV

Критерий Пирсона

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

ERBB4

1 (33.3)

2 (66.7)

5 (83.3)

1 (16.7)

7 (87.5)

1 (12.5)

3 (100)

0 (0)

<0.16071

FLT3

0 (0)

3 (100)

1 (16.7)

5 (83.3)

1 (12.5)

7 (87.5)

1 (33.3)

2 (66.7)

<0.71198

JAK3

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

KDR

2 (66.7)

1 (33.3)

1 (16.7)

5 (83.3)

3 (37.5)

5 (62.5)

1 (33.3)

2 (66.7)

<0.52520

MET

2 (66.7)

1 (33.3)

4 (66.6)

2 (33.4)

6 (75)

2 (25)

3 (100)

0 (0)

<0.72123

PDGFRA

0 (0)

3 (100)

2 (33.4)

4 (66.6)

5 (62.5)

3 (37.5)

1 (33.3)

2 (66.7)

<0.27765

SMAD4

3 (100)

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.56595

TP53

0 (0)

3 (100)

2 (33.4)

4 (66.6)

3 (37.5)

5 (62.5)

1 (33.3)

2 (66.7)

<0.67132

CSF1R

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

FGFR1

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

C

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

PIK3CA

2 (66.7)

1 (33.3)

2 (33.4)

4 (66.6)

4 (50)

4 (50)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.72123

RET

1 (33.3)

2 (66.7)

5 (83.3)

1 (16.7)

7 (87.5)

1 (12.5)

3 (100)

0 (0)

<0.16071

HRAS

2 (66.7)

1 (33.3)

4 (66.6)

2 (33.4)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.77439

FGFR3

2 (66.7)

1 (33.3)

5 (83.3)

1 (16.7)

6 (75)

2 (25)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.93092

KIT

2 (66.7)

1 (33.3)

6 (100)

0 (0)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.51412

ATM

3 (100)

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.15873

RB1

3 (100)

0 (0)

6 (100)

0 (0)

7 (87.5)

1 (12.5)

3 (100)

0 (0)

<0.66417

NRAS

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

EZH2

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.4303

KRAS

2 (66.7)

1 (33.3)

6 (100)

0 (0)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.11333

STK11

3 (100)

0 (0)

6 (100)

0 (0)

8 (100)

0 (0)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.11333

IDH1

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

PTEN

3 (100)

0 (0)

6 (100)

0 (0)

7 (87.5)

1 (12.5)

3 (100)

0 (0)

<0.66417

EGFR

3 (100)

0 (0)

6 (100)

0 (0)

7 (87.5)

1 (12.5)

3 (100)

0 (0)

<0.66417

MLH1

3 (100)

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

FGFR2

3 (100)

0 (0)

6 (100)

0 (0)

6 (75)

2 (25)

3 (100)

0 (0)

<0.34303

 

Таблица 3. Сравнение частот встречаемости мутаций в крови пациентов с раком легкого на разных стадиях. Различия частот встречаемости по χ2 Пирсона

Ген

II

IIIА

IIIВ

IV

Критерий Пирсона

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

ERBB4

3 (100)

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.74104

FLT3

1 (33.3)

2 (66.7)

1 (16.7)

5 (83.3)

4 (50)

4 (50)

0 (0)

3 (100)

<0.24807

KDR

2 (66.7)

1 (33.3)

2 (33.4)

4 (66.6)

5 (62.5)

3 (37.5)

1 (33.3)

2 (66.7)

<0.60771

MET

3 (100)

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.51412

PDGFRA

1 (33.3)

2 (66.7)

2 (33.4)

4 (66.6)

5 (62.5)

3 (37.5)

1 (33.3)

2 (66.7)

<0.64814

SMAD4

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.05756

TP53

2 (66.7)

1 (33.3)

2 (33.4)

4 (66.6)

5 (62.5)

3 (37.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.47681

CSF1R

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.11333

PIK3CA

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.16071

RET

3 (100

0 (0)

3 (50)

3 (50)

7 (87.5)

1 (12.5)

2 (66.7)

1 (33.3)

<0.19790

HRAS

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

KIT

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.41205

ATM

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.41205

RB1

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.34303

NRAS

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.66417

HNF1A

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.11333

IDH1

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

PTEN

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.79677

GNAQ

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.11333

MLH1

3 (100

0 (0)

4 (66.6)

2 (33.4)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.11333

GNAS

3 (100

0 (0)

5 (83.3)

1 (16.7)

8 (100)

0 (0)

3 (100)

0 (0)

<0.48327

 

Таблица 4. Сравнение частот встречаемости мутаций в буккальном эпителии пациентов с раком легкого в зависимости от курения. Различия частот встречаемости по χ2 Пирсона

Ген

Не курит

Курил ранее

Курит

Критерий Пирсона

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

дикий тип (%)

мутант (%)

ERBB4

4 (100)

0 (0)

2 (50)

2 (50)

10 (83.3)

2 (16.7)

<0.18888

FLT3

1 (25)

3 (75)

1 (25)

3 (75)

1 (8.3)

11 (91.7)

<0.59281

JAK3

4 (100)

0 (0)

3 (75)

1 (25)

12 (100)

0 (0)

<0.12181

KDR

0 (0)

4 (100)

2 (50)

2 (50)

5 (41.6)

7 (58.4)

<0.24859

MET

3 (75)

1 (25)

2 (50)

2 (50)

10 (83.3)

2 (16.7)

<0.41111

PDGFRA

1 (25)

3 (75)

1 (25)

3 (75)

6 (50)

6 (50)

<0.53526

SMAD4

3 (75)

1 (25)

3 (75)

1 (25)

10 (83.3)

2 (16.7)

<0.90108

TP53

1 (25)

3 (75)

1 (25)

3 (75)

4 (33.4)

8 (64.6)

<0.92370

CSF1R

3 (75)

1 (25)

4 (100)

0 (0)

12 (100)

0 (0)

<0.12181

FGFR1

3 (75)

1 (25)

4 (100)

0 (0)

12 (100)

0 (0)

<0.12181

PIK3CA

2 (50)

2 (50)

3 (75)

1 (25)

5 (41.6)

7 (58.4)

<0.51342

RET

2 (50)

2 (50)

3 (75)

1 (25)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.18888

HRAS

3 (75)

1 (25)

3 (75)

1 (25)

9 (75)

3 (25)

<1.0000

FGFR3

3 (75)

1 (25)

3 (75)

1 (25)

9 (75)

3 (25)

<1.0000

KIT

3 (75)

1 (25)

3 (75)

1 (25)

10 (83.3)

2 (16.7)

<0.90108

ATM

3 (75)

1 (25)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.47676

RB1

3 (75)

1 (25)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

NRAS

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

12 (100)

0 (0)

<0.12181

EZH2

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

10 (83.3)

2 (16.7)

<0.47676

KRAS

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

STK11

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

IDH1

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

PTEN

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

EGFR

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

MLH1

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.70407

FGFR2

4 (100)

0 (0)

4 (100)

0 (0)

11 (91.7)

1 (8.3)

<0.47676

 

Сравнение типов мутаций в крови и буккальном эпителии у пациентов с раком легкого

В ходе анализа мутационного профиля в буккальном эпителии и крови у больных с диагностированным раком легкого мы выявили, что в клетках буккального эпителия содержится значительно больше мутаций в генах FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3) и PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha) по сравнению с кровью (p < 0.05). Также в гене HRAS было выявлено большее количество мутаций в буккальном эпителии (p = 0.07652). В гене FGFR3 была обнаружена мутация rs7688609. В гене PIK3CA наиболее частой мутацией была rs3729674. Этот однонуклеотидный полиморфизм расположен в интроне, ранее не был ассоциирован с раком легкого. В гене HRAS была выявлена мутация rs12628. Данный вариант расположен в кодоне 27 экзона 1.

В среднем у здоровых людей мутационная нагрузка в буккальном эпителии составила 22.2 мутации на одну мегабазу генома. У пациентов с диагностированным раком легких мутационная нагрузка в буккальном эпителии составила 36.5 мутаций на одну мегабазу генома. В крови здоровых людей мутационная нагрузка составила 15.6 мутаций на одну мегабазу генома, а у пациентов с раком легкого – 25.5 мутаций на одну мегабазу генома.

В 21.9% генов наблюдалось одинаковое количество мутаций в клетках буккального эпителия и крови у пациентов с диагностированным раком легкого. В 6.25% генов не было выявлено мутаций ни в буккальном эпителии, ни в крови у пациентов с диагностированным раком легкого (только у здоровых пациентов) (рис. 2).

 

Рис. 2. Частота встречаемости мутаций в крови и буккальном эпителии пациентов с раком легкого. * p <0.05, различия частот встречаемости по χ2 Пирсона статистически достоверны

 

В ходе секвенирования исследуемого материала было обнаружено 98 полиморфизмов в 32 генах. 38 из 98 несинонимичных мутаций были обнаружены более чем у 1% индивидуумов. Большая часть мутаций встречается редко – 61.22% были обнаружены не более одного раза во всей выборке. Мы обнаружили, что 35% всех мутаций не были описаны ранее (не встречаются в базах данных dbSNP, COSMIC актуальных ревизий). Анализ мутационного ландшафта вариантов выявил, что 27.6% всех вариантов относятся к однонуклеотидным полиморфизмам, 37.7% – к инсерциям, 22.4% – к сдвигу рамки считывания, 7.14% – к делециям, 6.6% – к многонуклеотидным полиморфизмам. Подробное описание всех типов выявленных мутаций представлено в табл. 5.

 

Таблица 5. Подробное описание выявленных мутаций

Ген

Вариант мутации

Локализация

Аллель

Последствия

Аберрация

ERBB4

rs839541

chr2:212812097_T/C

C

Замена интрона

Однонуклеотидный полиморфизм

Новая мутация

chr2:212576812_T/TC

chr2:212576812_T/TC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

rs1356577968

chr2:212578395_GT/AG

AG

Замена интрона

Замена

FLT3

rs75580865

chr13:28602292_T/C

C

»

Однонуклеотидный полиморфизм

rs2491231

chr13:28610183_A/G

G

Замена области сплайсинга,

замена интрона

»

Новая мутация

chr13:28602279_C/CT

chr13:28602279_C/CT

T

Замена интрона

Инсерция

Новая мутация

chr13:28610146_A/AG

chr13:28610146_A/AG

G

Мутация сдвига

рамки считывания

»

Новая мутация

chr13:28608256_A/AG

chr13:28608256_A/AG

G

»

»

JAK3

Новая мутация

chr19:17945670_A/AG

chr19:17945670_A/AG

G

»

»

rs3213409

chr19:17945696_C/T

T

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs373418967

chr19:17945674_A/AC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

KDR

Новая мутация

chr4:55953804_T/TA

chr4:55953804_T/TA

A

»

»

rs7692791

chr4:55980239_C/T

T

Замена интрона

Однонуклеотидный полиморфизм

rs1870377

chr4:55972974_T/A

A

Миссенс-мутация

»

rs1578131263

chr4:55962545_T/TG

G

Замена интрона

Инсерция

Новая мутация

chr4:55979617_A/AC

chr4:55979617_A/AC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

»

rs10006115

chr4:55946354_G/T

T

Замена интрона

Однонуклеотидный полиморфизм

rs1342902707

chr4:55979575_G/GA

A

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

Новая мутация

chr4:55946134_TC/T

chr4:55946134_TC/T

−

»

Делеция

MET

rs55985569

chr7:116339642_G/T

T

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs35775721

chr7:116339672_C/T

T

Синонимичная мутация

»

rs33917957

chr7:116340262_A/G

G

Миссенс-мутация

»

Новая мутация

chr7:116403177_TCCCCCTGA/TCCCCTG

chr7:116403177_TCCCCCTGA/TCCCCTG

CCCCTG

Мутация сдвга рамки считывания, мутация преждевременного

завершения трансляции

Инсерция

rs1208881531

chr7:116403215_A/AC

C

Мутация сдвига рамки считывания

замена

rs56391007

chr7:116411990_C/T

T

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

Новая мутация

chr7:116403220_TTCCA/TCC

chr7:116403220_TTCCA/TCC

CC

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

rs1794847963

chr7:116411966_T/TA

A

»

»

PDGFRA

rs1560480581

chr4:55141051_G/T

G

Делеция внутри

рамки считывания

»

rs2228230

chr4:55152040_C/T

T

Синонимичная мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs1723633126

chr4:55141050_AGCCCAGATGGACATGA/AA

 

Делеция внутри

рамки считывания

Инсерция

SMAD4

rs948588

chr18:48586344_C/T

T

Замена интрона

Однонуклеотидный полиморфизм

rs374687785

chr18:48584629_TAAAAAATCT/TAAAAAATCTT

AAAAAATCTT

»

Инсерция

TP53

rs1042522

chr17:7579472_G/C

C

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs745751553

chr17:7573940_T/TC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

rs587782423

chr17:7579470_GG/CGC

CG

»

»

rs530941076

chr17:7578191_AGGGCAC/AGGCAC

AGGCAC0

»

»

CSF1R

rs2066934

chr5:149433596_TG/GA

GA

»

Изменение последовательности

FGFR1

Новая мутация

chr8:38282247_C/CG

chr8:38282247_C/CG

G

Замена интрона

Инсерция

PIK3CA

rs3729674

chr3:178917005_A/G

G

»

Однонуклеотидный полиморфизм

rs761258531

chr3:178927952

TATTTTTATTTGT

»

Инсерция

rs2230461

chr3:178927410_A/G

G

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs141098973

chr3:178916856_AT/AA

-

Мутация сдвига

рамки считывания

Изменение последовательности

rs200868796

chr3:178916780 ACCCCCT/ACCCCT

CCCCT

»

Инсерция

Новая мутация

chr3:178927954_ATTTTTCTTTGT/ATTTTTATTTGT

chr3:178927954_ATTTTTCTTTGT/ATTTTTATTTGT

TTTTTATTTGT

Замена интрона

»

Новая мутация

chr3:178947872_G/GC

chr3:178947872_G/GC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

»

Новая мутация

chr3:178938918_A/C

chr3:178938918_A/C

C

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs1553825421

chr3:178947853_AT/AGT

GT

Мутация сдвига

рамки считывания

Изменение последовательности

rs761258531

chr3:178927952_ATATTTTTCTTTGT/ATATTTTTATTTGT

TATTTTTATTTGT

Замена интрона

Инсерция

RET

rs1800861

chr10:43613843_G/T

T

Синонимичная мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs1800863

chr10:43615633_C/G

G

»

»

HRAS

rs12628

chr11:534242_A/G

G

»

»

FGFR3

rs7688609

chr4:1807894_G/A

A

»

»

KIT

rs3822214

chr4:55593464_A/C

C

Миссенс-мутация

»

Новая мутация

chr4:55594270_G/A

chr4:55594270_G/A

A

»

»

rs55986963

chr4:55593481_A/G

G

Синонимичная мутация

»

Новая мутация

chr4:55597448_T/TC

chr4:55597448_T/TC

C

Замена интрона

Инсерция

ATM

Новая мутация

chr11:108119881_ATTTTTC/ATTTTC

chr11:108119881_ATTTTTC/ATTTTC

TTTTC

»

»

rs1555068605

chr11:108117845_CTGT/CT

T

Мутация сдвига рамки считывания

»

rs2227922

chr11:108123551_C/T

T

Миссенс-мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

Новая мутация

chr11:108123524_CTTTTTG/CTTTTTGT

chr11:108123524_CTTTTTG/CTTTTTGT

TTTTTTGT

Замена интрона

Инсерция

rs199885813

chr11:108173695_C/CT

T

Мутация сдвига рамки считывания

»

RB1

rs1593455740

chr13:48953841_C/T

T

Замена интрона

Однонуклеотидный полиморфизм

Новая мутация

chr13:49037882_A/AG

chr13:49037882_A/AG

G

Мутация сдвига рамки считывания

Инсерция

rs1593529859

chr13:49027123_A/AG

G

Замена интрона, мутация преждевременного завершения трансляции

»

Новая мутация

chr13:48942624_A/AAT

chr13:48942624_A/AAT

AT

Замена интрона

»

Новая мутация

chr13:48942657_A/AC

chr13:48942657_A/AC

C

Замена интрона, мутация преждевременного завершения трансляции

»

rs1952727001

chr13:48942697_C/CG

G

Мутация сдвига рамки считывания

»

NRAS

Новая мутация

chr1:115256514_G/GT

chr1:115256514_G/GT

T

»

»

rs1246727247

chr1:115256546_T/TG

G

»

»

rs1357368437

chr1:115258732_CT/C

−

»

Делеция

Новая мутация

chr1:115252261_T/TG

chr1:115252261_T/TG

G

»

Инсерция

EZH2

rs757534855

chr7:148508767_TAAAAATC/TAAAAT

AAAAT

»

»

Новая мутация

chr7:148508744_AT/A

chr7:148508744_AT/A

A

»

»

HNF1A

Новая мутация

chr12:121431456_G/GA

chr12:121431456_G/GA

A

»

»

KRAS

Новая мутация

chr12:25378635_A/AC

chr12:25378635_A/AC

C

»

»

STK11

rs1034888250

chr19:1223052_A/AT

T

»

»

FGFR3

Новая мутация

chr10:123257991_GT/G

chr10:123257991_GT/G

-

Замена интрона

Делеция

rs755350933

chr10:123258032_A/AT

T

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

PTEN

rs121909231

chr10:89720851_CCG/C

G/T/C

Мутация

преждевременного завершения трансляции

»

rs542808377

chr10:89717542_GT/G

−

Замена интрона

Изменение последовательности

rs1589663424

chr10:89717710_GC/AG

G

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

rs786203847

chr10:89685269_GGTTTTTGGATTCAAAGCATAAAAACCATTACAAGATATACAATCT/AGTTTTTGGATTCAAAGCATAAAAACCATTACAAGATATACAATCT

AGTTTTTGGATTCAAAGCATAAAAACCATTACAAGATATACAATCT

Мутация кодирующей последовательности, мутация акцептора сплайсинга

»

Новая мутация

chr10:89717584_A/AC

chr10:89717584_A/AC

C

Замена интрона

»

rs746280047

chr10:89711920_T/TC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

»

CDH1

rs1284989530

chr16:68835612_ATTTTTC/ATTTTC

TTTTC

»

»

Новая мутация

chr16:68835648_A/AG

chr16:68835648_A/AG

G

»

»

IDH1

rs11554137

chr2:209113192_G/A

A

Синонимичная мутация

Однонуклеотидный полиморфизм

rs780642190

chr2:209113151_CG/C

C

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

GNAS

rs113203829

chr20:57484635_G/GC

C

Мутация донора сплайсинга

»

SMARCB1

Новая мутация

chr22:24133993_CT/TC

chr22:24133993_CT/TC

TC

Миссенс-мутация

Изменение последовательности

MLH1

Новая мутация

chr3:37067294_AAC/A

chr3:37067294_AAC/A

−

Мутация сдвига

рамки считывания

Делеция

Новая мутация

chr3:37067310_GC/G

chr3:37067310_GC/G

−

»

Изменение последовательности

GNAQ

Новая мутация

chr9:80409384_T/TC

chr9:80409384_T/TC

C

»

Инсерция

rs1587919422

chr9:80409384_T/TC

G

»

»

EGFR

rs201720393

chr7:55249192_CGGGGAG/CGGGA

GGGA

Замена интрона

»

rs1281578598

chr7:55233008_T/TC

C

Мутация сдвига

рамки считывания

»

FGFR2

Новая мутация

chr10:123257991_GT/G

chr10:123257991_GT/G

−

Замена интрона

Делеция

rs755350933

chr10:123258032_A/AT

T

Мутация сдвига

рамки считывания

Инсерция

 

Было выявлено, что в буккальном эпителии содержится больше мутаций сдвига рамки считывания на 67.4% и синонимичных мутаций на 63.4%, чем в крови. Мутации типа миссенс, замена интрона, мутации региона сплайсинга и другие встречались одинаковое число раз в буккальном эпителии и крови у пациентов с диагностированным раком легкого. В группу “Другие” входили мутации типа мутации акцептора сплайсинга, мутация кодирующей последовательности/мутация донора спайсинга/точечная мутация, мутация 3’-нетранслируемой области, мутации внутри рамки считывания (рис. 3).

 

Рис. 3. Количество различных типов мутаций у пациентов с раком легкого в буккальном эпителии и крови

 

ОБСУЖДЕНИЯ

Молекулярный механизм патогенеза рака легкого – сложный процесс, в котором участвует множество молекул и вовлекаются все основные сигнальные пути, участвующие в канцерогенезе [10]. Ранее было показано, что мутации в 18 генах приводят к развитию аденокарциномы легкого. Наиболее часто мутировал ген TP53 (46%). Мутации KRAS (33%) были взаимоисключающими с мутациями EGFR (14%). Другая группа генов, часто мутирующих, представлена BRAF (10%), PIK3CA (7%), MET (7%), RT1, и малыми ГТФазами (2%). Группа генов-супрессоров опухолей, включая STK11 (17%), KEAP1 (17%), NF1 (11%), RB1 (4%) и CDKN2A (4%), также часто мутировала. Другая группа частых мутаций включает набор генов, модифицирующих хроматин, таких как SETD2 (9%), ARID1A (7%) и SMARCA4 (6%), а также два гена сплайсинга РНК RBM10 (8%) и U2AF1 (3%). Мутации гена MGA наблюдаются у 8% пациентов [11]. Также наблюдалось изменение числа копий генов NKX2-1, TERT, MDM2, KRAS, EGFR, MET, CCNE1, CCND1, TERC и MECOM [12]. Анализ аберрантных транскриптов РНК обнаружил слияния с участием ALK, ROS1 и RET. Пропуск экзона 14 МЕТ в РНК приводит к стабилизации белка МЕТ и активации. Общий обзор мутационного статуса 230 пациентов с аденокарциномой показал, что 62% из них демонстрируют активирующие мутации в известных онкогенах-драйверах (такие как мутации EGFR, KRES, BRAF, ALK, ROS1 и слияния RET), у остальных 38% пациентов не было видимой мутации онкогена RTK / RAS / RAF. Однако тщательный анализ показал, что мутации TP53, KEAP1, NF1 и RIT1 обогащены онкоген-негативной группой аденокарцином легких. Ключевым изменениям при аденокарциноме легких подвергались следующие биохимические пути: путь RTK / RAS / RAF (76%), путь PI3K-mTOR (25%), путь p53 (63%), клеточный цикл (64%), сплайсинг хроматина и РНК (22%) [13]. Важно отметить, что показатель активации MAPK выше среди аденокарцином легких с мутантным KRAS, но он также присутствует среди аденокарцином KRAS WT. Путь mTOR может быть активирован в аденокарциномах легких посредством трех различных молекулярных механизмов: мутации PI3KCA, мутации STK11, связанной или не связанной с низкими уровнями LKB1 [14].

Важно отметить, что наблюдались некоторые заметные различия в частоте возникновения некоторых онкогенных мутаций в аденокарциномах легких у пациентов разного этнического происхождения [15]. Таким образом, жители Восточной Азии демонстрируют более высокий уровень мутаций EGFR и более низкий уровень мутаций KRAS, чем европейские популяции. Эти различия существенно влияют на ведение аденокарциномы легких на уровне региональных онкологических центров и на дизайн клинических испытаний в разных странах. Среди пациентов из Восточной Азии наиболее часто мутировали гены EGFR (46.7%), TP53 (21.2%), ALK (12.1%, из которых 8.8% мутации и 3.3% реаранжировки), KRAS (9.8%), EZH2 (9.4%), ERBB2 (5.5%), STK11 (3.1%), PDGFRA (2.7%), NF1 (2.7%) и ERBB4 (2.4%) [16].

В 2013 г. было проведено всестороннее исследование генетических аномалий, встречающихся в плоскоклеточном раке легкого, в контексте проекта Атлас генома рака, обеспечивающего фундаментальное комплексное исследование аномалий числа копий ДНК, соматических экзонных мутаций, секвенирования мРНК, экспрессии мРНК и метилирования промотора, анализа микроРНК и секвенирования всего генома. Результаты этого комплексного анализа предоставили всестороннюю картину геномных и эпигеномных изменений при плоскоклеточном раке легкого [17]. Наиболее заметными результатами этого анализа были следующие: 1) было обнаружено, что 10 генов часто мутировали, и они включают TP53 (мутировавший примерно в 90% случаев), CDKN2A (15%), PTEN (8%), PIK3CA ( 16%), KEAP1 (12%), MLL2 (20%), HLA-A (3%, мутации с потерей функции), NFE2L2 (15%), NOTCH1 (8%, усекающие мутации, по-видимому связанные с потерей функции), RB1 (7%); 2) многие из частых соматических мутаций, обнаруживаемых в плоскоклеточном раке легкого, являются движущими силами важных путей, участвующих в инициации опухоли или в прогрессии опухоли. Реакция на окислительный стресс изменяется в 34% случаев через мутации KEAP1, CUL3 и NFE2L2; гены дифференцировки клеток (SOX2, NOTCH1, NOTCH2, TP63, FOXP1) изменены в 44% образцов; гены клеточного цикла, такие как CDKN2A и RB1, в – 72% опухолей [18], гены пути PI3K в – 47% опухолей. Также были опубликованы данные о мутационном спектре плоскоклеточного рака легкого у пациентов из Восточной Азии, демонстрирующем паттерн, аналогичный наблюдаемому в европейских популяциях. Наблюдались следующие частоты повторных мутаций генов: TP53 (73%), MLL2 (24%), NFEL2 (17%), RB1 (15%), PTEN (11%), KEAP1 (16%), PI3KCA (9%), CD117 (13%), NF1 (12%), SWI / SNF (15%), NOTCH (15%). Частые изменения числа копий наблюдались на уровне: SOX2 (79%), PI3KCA (77%), TP63 (75%), FGFR1 (31%), CDKN2A (38%), PDGFRA (18%), PTEN (31%) [19].

Ранее был установлен ряд мутаций, возникающих при немелкоклеточном раке легкого. Основными молекулярными особенностями этих опухолей являлись мутации в генах EGFR (31.6%), KRAS (10.5%), AKT1 (2–6%), мутации вставки ERBB2 (1.3%), мутации PI3KCA (1.3%), слияния генов ALK (5.3%) и слияния KIF5B–RETR (4%); BRAF-мутации не обнаружены. Мутационные профили и клинико-патологические особенности немелкоклеточного рака легкого очень похожи на таковые у низкодифференцированных аденокарцином [20].

При мелкоклеточном раке легкого основную роль играют инактивирующие мутации TP53 и RB1. Другая группа повторяющихся мутаций встречается на уровне трех генов: CREBBP, EP300 и MLL, которые кодируют модификаторы гистонов: учитывая глобальную частоту геномных изменений этих трех гистон-модифицирующих ферментов, становится очевидным, что они представляют второй по частоте мутации класс генов при мелкоклеточном раке легкого. Другая группа мутаций касается трех генов-супрессоров опухолей: PTEN, SLIT2 и EPHA7. Мутации MYC часто встречаются при мелкоклеточном раке легкого. Эти мутации включают несколько генов семейства MYC, таких как MYC, MYCL1 и MYCN [21].

В проведенном настоящем исследовании мы выяснили, что мутационный профиль в крови и клетках буккального эпителия схож с азиатской популяцией (разница в том, что в азиатской популяции при раке легкого преобладают мутации гена EGFR, а в нашем исследовании – KDR), и практически полностью отличается от европейской за исключением основных протоонкогенов, например ТР53) [22].

Нами было установлено, что у пациентов с раком легкого в буккальном эпителии больше мутаций в генах FLT3, PDGFRA, KDR, PIK3CA, HRAS, FGFR3, чем у лиц без диагностированного рака легкого. Более того, мы показали, что у пациентов с раком легкого мутаций в буккальном эпителии на 44% больше, чем в крови. В 50% генов, в которых были обнаружены мутации, их количество в буккальном эпителии было выше, чем в крови. При этом статистически достоверные различия были показаны для генов FGFR3 и PIK3CA (p < 0.05). Для гена HRAS p = 0.07652. В 25% генов наблюдалось одинаковое количество мутаций в клетках буккального эпителия и крови у пациентов с диагностированным раком легкого. Также в 25% генов было обнаружено больше мутаций в крови, чем в буккальном эпителии, но данные варианты встречались единично – одна мутация была выявлена у одного пациента.

Наибольшее количество мутаций наблюдается в генах, кодирующих рецепторные тирозинкиназы: KDR, FLT3, FGFR3, PDGFRA. Установлено, что рецепторные тирозинкиназы являются ключевыми регуляторами нормальных клеточных процессов и играют критическую роль в развитии и прогрессировании многих типов злокачественных опухолей. Мутации в генах, кодирующих рецепторные тирозинкиназы, приводят к активации сигнальных каскадов, вызывая изменение экспрессии белка и пролиферацию клеток. [23].

Ген FLT3 (fms-like tyrosine kinase 3) кодирует тирозинкиназу рецептора III класса, регулирующую кроветворение, и играет важную роль в выживании и пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников. Ранее не было показано, что мутации в этом гене ассоциированы с развитием рака легкого, однако установлено, что они могут приводить к конститутивной активации этого рецептора тирозинкиназы и развитию острого миелоидного и лимфобластного лейкозов [24]. Мутация rs2491231, обнаруженная нами в этом гене, также ранее не была ассоциирована с раком легкого, но она была обнаружена при тройном негативном раке молочной железы [25].

Были обнаружены мутации в гене PDGFRA, который кодирует рецептор тирозинкиназы клеточной поверхности для членов семейства факторов роста тромбоцитов. Исследования показывают, что этот ген играет роль в развитии органов, заживлении ран и прогрессировании опухолей. Мутации в этом гене связаны с идиопатическим гиперэозинофильным синдромом, соматическими и семейными опухолями стромы желудочно-кишечного тракта и множеством других видов рака, в том числе и рака легкого [26]. Однако обнаруженная нами мутация rs1560480581 ранее не была ассоциирована с раком легкого.

Высокая мутабильность наблюдалась в гене KDR, который кодирует один из двух рецепторов VEGF. Мутации этого гена вовлечены в инфантильные капиллярные гемангиомы [27]. Мутация rs7692791, которую мы обнаружили у пациентов с раком легкого, встречается при раке желудка [28], почечно-клеточной карциноме [29] и некоторых других патологиях [30], но ранее эта мутация не была ассоциирована с раком легкого. В гене FGFR3 была обнаружена мутация rs7688609. Данный однонуклеотидный полиморфизм расположен в экзоне 13 гена FGFR3 и не был ранее ассоциирован с раком легкого, однако он был обнаружен при некоторых других онкозаболеваниях, таких как адамантиноматозная краниофарингиома [31], опухоль яичек [32] и плоскоклеточный рак пищевода [33]. В гене PIK3CA наиболее частой мутацией была rs3729674. Этот однонуклеотидный полиморфизм расположен в интроне, ранее он не был ассоциирован с раком легкого. В гене HRAS была выявлена мутация rs12628. Данный вариант расположен в кодоне 27 экзона 1. Ранее он не был ассоциирован с раком легкого, но был обнаружен при таких видах рака как меланома [34] и папиллярная карцинома щитовидной железы [35].

Считается, что мутации в гене TP53 являются причиной рака легкого [36]. Ген-супрессор опухоли TP53 в целом часто мутирует при раке человека. Аномалия гена TP53 является одним из наиболее значимых событий при раке легких и играет важную роль в онкогенезе эпителиальных клеток легких [37]. Действительно, мы не выявили у здоровых людей в крови мутаций в гене TP53, однако они были обнаружены у пациентов с раком легкого (50%, p < 0.05 по χ2 Пирсона). Статистически значимых различий по частоте встречаемости мутаций в гене TP53 в буккальном эпителии не было выявлено. Однако у пациентов с раком легкого мутации в гене TP53 в буккальном эпителии встречаются чаще, чем в крови (но различия статистически недостоверны, p = 0.1, различия частот встречаемости по χ2 Пирсона) (рис. 2).

Наиболее подвержен мутациям в буккальном эпителии ген PIK3CA. В крови пациентов с раком легкого мутации в гене PIK3CA встречаются даже реже, чем у здоровых людей (20% против 33%). При этом в буккальном эпителии мутации в гене PIK3CA встречаются у 50% пациентов с раком легкого и у 11.1% людей из контрольной группы (p < 0.05 по χ2 Пирсона). В некоторых исследованиях была установлена взаимосвязь между плоскоклеточным раком легкого и мутациями в гене PIK3CA [38]. Установлено, что мутации в гене PIK3CA также обнаружены при таких типах рака легкого как сквамозно-клеточная карцинома (8.9%) и аденокарцинома (2.9%). Наиболее частой мутацией PIK3CA был экзон 9 E545K. Рак легких с мутацией PIK3CA часто развивается у пациентов с предшествующими злокачественными новообразованиями [39].

Мы не обнаружили мутаций в гене FGFR3 в крови здоровых людей и пациентов с раком легкого (рис. 1). Также не было обнаружено мутаций в гене FGFR3 в буккальном эпителии здоровых людей, но они были обнаружены у 25% пациентов с раком легкого (p < 0.05 по χ2 Пирсона). Ранее было установлено, что мутации в гене FGFR3 способствуют росту клеток при раке легкого. Это связано с тем, что гены семейства FGFR участвуют в регуляции множества биологических процессов, включая восстановление тканей, ангиогенез, пролиферацию, дифференцировку, миграцию и выживание клеток [40]. Повышенная экспрессия FGFR3 указывает на неблагоприятный прогноз для людей с аденокарциномой легких и способствует увеличению метастатического потенциала клеток аденокарциномы легких [41].

В настоящей работе мы показали, что у пациентов с раком легкого увеличивается количество мутаций сдвига рамки считывания в буккальном эпителии, которые возникают, как правило, при увеличении уровня окислительного стресса. Мутации сдвига рамки считывания являются наиболее опасными мутациями, которые приводят к неправильной трансляции белка, а следственно, к аномальному синтезу белковых продуктов с неправильной аминокислотной последовательностью [42]. Наибольшее количество соматическихмутаций в буккальном эпителии пациентов с раком легкого наблюдается в генах PIK3CA и FGFR3. Наиболее мутабельными оказались гены, которые кодируют рецепторные тирозинкиназы. В совокупности эти данные подтверждают предположение о том, что ротовая полость является “молекулярным зеркалом рака легкого” [7].

Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Государственного задания университетам в сфере научной деятельности на 2020–2022 гг. (проект FZGU-2020-0044).

Исследование одобрено Этическим комитетом Воронежского государственного университета (протокол 42-03 от 8 октября 2020 г.).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Все обследованные – совершеннолетние.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Авторлар туралы

O. Serzhantova

Voronezh Regional Clinical Oncological Dispensary; Voronezh State University

Email: gureev@bio.vsu.ru
Ресей, Voronezh; Voronezh

A. Novikova

Voronezh Regional Clinical Oncological Dispensary; Voronezh State University

Email: gureev@bio.vsu.ru
Ресей, Voronezh; Voronezh

A. Mikhailov

Voronezh Regional Clinical Oncological Dispensary

Email: gureev@bio.vsu.ru
Ресей, Voronezh

I. Moshurov

Voronezh Regional Clinical Oncological Dispensary

Email: gureev@bio.vsu.ru
Ресей, Voronezh

A. Gureev

Voronezh State University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: gureev@bio.vsu.ru
Ресей, Voronezh

Әдебиет тізімі

  1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Шахзадова А.О. Злокачественные новообразования в России в 2019 году (заболеваемость и смертность). М.: МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ “НМИЦ радиологии” Минздрава России 2020. 252 с.
  2. Wadowska K., Bil-Lula I., Trembecki Ł., Śliwińska-Mossoń M. Genetic Markers in Lung Cancer Diagnosis: A Review // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 13. https://doi.org/10.3390/ijms21134569
  3. Rodionov E.O., Tuzikov S.A., Miller S.V. et al. Methods for early detection of lung cancer (review) // Sib. J. Oncology. 2020. V. 19. № 4. P. 112–122. https://doi.org/10.21294/1814-4861-2020-19-4-112-122
  4. Nanavaty P., Alvarez M.S., Alberts W.M. Lung cancer screening: advantages, controversies, and applications // Cancer Control. 2014. V. 21. № 1. P. 9–14. https://doi.org/10.1177/107327481402100102
  5. Hubers A.J., Prinsen C.F., Sozzi G. et al. Molecular sputum analysis for the diagnosis of lung cancer // Br. J. Cancer. 2013. V. 109. № 3. P. 530–537. https://doi.org/10.1038/bjc.2013.393
  6. Ganeev A.A., Gubal A.R., Lukyano G.N. et al. Analysis of exhaled air for early-stage diagnosis of lung cancer: opportunities and challenges // Russ. Chemical Reviews. 2017. V. 87. № 9. P. 904–921. https://doi.org/10.1070/RCR4831
  7. Sidransky D. The oral cavity as a molecular mirror of lung carcinogenesis // Cancer Prev. Res. (Phila). 2008 V. 1. № 1. P. 12–14. https://doi.org/10.1158/1940-6207.CAPR-08-0093
  8. Bhutani N., Burns D.M., Blay H.M. DNA Demethylation dynamics // Cell. 2011. V.146. № 6. P. 866–872. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.08.042
  9. Kömerik N., Yüce E., Calapoğlu N.S. et al. Oral mucosa and lung cancer: Are genetic changes in the oral epithelium associated with lung cancer? // Nigerian J. Clin. Practice. 2017. V. 20. № 1. P. 12–18. https://doi.org/10.4103/1119-3077.181396
  10. Shtivelman E., Hensing T., Simon G.R. et al. Molecular pathways and therapeutic targets in lung cancer // Oncotarget. 2014. V. 5. № 6. P. 1392–1433. https://doi.org/10.18632/oncotarget.1891
  11. Collisson E.A., Campbell J.D., Brooks A.N. et al. The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma // Nature. 2014. V. 511. P. 543–550. https://doi.org/10.1038/nature13385
  12. Imielinski M., Berger A.H., Hammerman P.S. et al. Mapping the hallmarks of lung adenocarcinoma with massively parallel sequencing // Cell. 2012. V. 150. № 6. P. 1107–1120. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.08.029
  13. Rodgers K. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma // Nature. 2018. V. 559. № 7715. https://doi.org/10.1038/s41586018-0228-6
  14. Levy M.A., Lovly C.M., Pao W. Translating genomic information into clinical medicine: lung cancer as a paradigm // Genome Res. 2012. V. 22. № 11. P. 2101–2108. https://doi.org/10.1101/gr.131128.111
  15. Drilon A., Wang L., Arcila M.E. et al. Broad, hybrid capture-based next-generation sequencing identifies actionable genomic alterations in lung adenocarcinomas otherwise negative for such alterations by other genomic testing approaches // Clin. Cancer Res. 2015. V. 21. № 16. P. 3631–3639. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-14-2683
  16. Liu L., Liu J., Shao D. et al. Comprehensive genomic profiling of lung cancer using a validated panel to explore therapeutic targets in East Asian patients // Cancer Sci. 2017. V. 108. № 12. P. 2487–2494. https://doi.org/10.1111/cas.13410
  17. Rooney M., Devarakonda S., Govindan R. Genomics of squamous cell lung cancer // Oncologist. 2013. V. 18. № 6. P. 707–716. https://doi.org/10.1634/theoncologist.2013-0063
  18. Rodgers K. Cancer genome atlas research network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers // Nature. 2012. V. 489. № 7417. P. 519–525. https://doi.org/10.1038/nature11404
  19. Kim Y., Hammerman P.S., Kim J. et al. Integrative and comparative genomic analysis of lung squamous cell carcinomas in East Asian patients // J. Clin. Oncol. 2014. V. 32. № 2. P. 121–128. https://doi.org/10.1200/JCO.2013.50.8556
  20. Wang R., Pan Y., Li C. et al. Analysis of major known driver mutations and prognosis in resected adenosquamous lung carcinomas // J. Thorac. Oncol. 2014. V. 9. № 6. P. 760–768. https://doi.org/10.1097/JTO.0b013e3182a406d1
  21. Voortman J., Lee J.H., Killian J.K. et al. Array comparative genomic hybridization-based characterization of genetic alterations in pulmonary neuroendocrine tumors // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2010. V. 107. № 29. P. 13040–13045. https://doi.org/10.1073/pnas.1008132107
  22. Imielinski M., Berger A.H., Hammerman P.S. et al. Mapping the hallmarks of lung adenocarcinoma with massively parallel sequencing // Cell. 2012. V. 150. № 6. P. 1107–1120. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.08.029
  23. Zwick E., Bange J., Ullrich A. Receptor tyrosine kinase signalling as a target for cancer intervention strategies // Endocrine-Related Cancer J. 2001. V. 8. № 3. P. 161–173. https://doi.org/10.1677/erc.0.0080161
  24. Small D. FLT3 mutations: biology and treatment // Hematology. 2006. V. 1. P. 178–184. https://doi.org/10.1182/asheducation-2006.1.178
  25. Uscanga-Perales G.I., Santuario-Facio S.K., Sanchez-Dominguez C.N. et al. Genetic alterations of triple negative breast cancer (TNBC) in women from Northeastern Mexico // Oncol. Lett. 2019. V. 17. № 3. P. 3581–3588. https://doi.org/10.3892/ol.2019.9984
  26. Guo M., Tomoshige K., Meister M. et al. Gene signature driving invasive mucinous adenocarcinoma of the lung // EMBO Mol. Med. 2017. V. 9. № 4. P. 462–481. https://doi.org/10.15252/emmm.201606711
  27. Qiu Z., Ye B., Wang K. et al. Unique genetic characteristics and clinical prognosis of female patients with lung cancer harboring RET fusion gene // Sci. Rep. 2020. V. 10. № 10387. https://doi.org/10.1038/s41598-020-66883-0
  28. Zhuo Y.J., Shi Y., Wu T. NRP-1 and KDR polymorphisms are associated with survival time in patients with advanced gastric cancer // Oncol. Lett. 2019. V. 18. № 5. P. 4629–4638. https://doi.org/10.3892/ol.2019.10842
  29. Cebrián A., Gómez Del Pulgar T., Méndez-Vidal M.J. et al. Functional PTGS2 polymorphism-based models as novel predictive markers in metastatic renal cell carcinoma patients receiving first-line sunitinib // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 41371. https://doi.org/10.1038/srep41371
  30. O’Brien T.J., Harralson A.F., Tran T. et al. Kinase insert domain receptor/vascular endothelial growth factor receptor 2 (KDR) genetic variation is associated with ovarian hyperstimulation syndrome // Reprod. Biol. Endocrinol. 2014. V. 12. № 36. https://doi.org/10.1186/1477-7827-12-36
  31. Jastania R.A., Saeed M., Al-Khalidi H. et al. Adamantinomatous craniopharyngioma in an adult: A case report with NGS analysis // Int. Med. Case Rep. J. 2020. V. 13. P. 123–137. https://doi.org/10.2147/IMCRJ.S243405
  32. Goriely A., Hansen R.M., Taylor I.B. et al. Activating mutations in FGFR3 and HRAS reveal a shared genetic origin for congenital disorders and testicular tumors // Nat. Genet. 2009. V. 41. № 11. P. 1247–1252. https://doi.org/10.1038/ng.470
  33. Рахимова С.Е., Саматкызы Д., Кожамкулов У.А. и др. Опыт применения панели для секвенирования следующего поколения AmpliSeq Cancer HotSpot v.2 у казахстанских пациентов с плоскоклеточным раком пищевода // Вестник Казахского Нац. Мед. Ун-та. 2020. № 3. С. 76–80.
  34. Tomei S., Adams S., Uccellini L. et al. Association between HRAS rs12628 and rs112587690 polymorphisms with the risk of melanoma in the North American population // Med. Oncol. 2012. V. 29. № 5. P. 3456–3461. https://doi.org/10.1007/s12032-012-0255-3
  35. Jin M., Li Z., Sun Y. et al. Association analysis between the interaction of RAS family genes mutations and papillary thyroid carcinoma in the Han Chinese population // Int. J. Med. Sci. 2021. V. 18. № 2. P. 441–447. https://doi.org/10.7150/ijms.50026
  36. Testa U., Castelli G., Pelosi E. Lung cancers: Molecular characterization, clonal heterogeneity and evolution, and cancer stem cells // Cancers (Basel). 2018. V. 10. № 8. https://doi.org/10.3390/cancers10080248
  37. Mogi A., Kuwano H. TP53 Mutations in nonsmall cell lung cancer // J. Biomedicine and Biotechnology. 2011. V. 2011. № 583929. https://doi.org/10.1155/2011/583929
  38. Tao D., Han X., Zhang N. et al. Genetic alteration profiling of patients with resected squamous cell lung carcinomas // Oncotarget. 2016. V. 7. № 24. P. 36590–36601. https://doi.org/10.18632/oncotarget.9096
  39. Scheffler M., Bos M., Gardizi M. et al. PIK3CA mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC): Genetic heterogeneity, prognostic impact and incidence of prior malignancies // Oncotarget. 2015. V. 6. № 2. P. 1315–1326. https://doi.org/10.18632/oncotarget.2834
  40. Beenken A., Mohammadi M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy // Nat. Reviews. Drug Discovery. 2013. V. 8. № 3. P. 235–253. https://doi.org/10.1038/nrd2792
  41. Jing P., Zhao N., Xie N. et al. miR-24-3p/FGFR3 signaling as a novel axis Is involved in epithelial-mesenchymal transition and regulates lung adenocarcinoma progression // J. Immunol. Res. 2018. V. 2018. № 2834109. https://doi.org/10.1155/2018/2834109
  42. Gasche C., Chang C.L., Rhees J. et al. Oxidative stress increases frameshift mutations in human colorectal cancer cells // Cancer Research. 2001. V. 61. P. 7444–7448.

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Fig. 1. Frequency of mutations in blood (a) and buccal epithelium (b) of healthy individuals and patients with lung cancer. * - p < 0.05, differences in frequency of occurrence according to Pearson's χ2 are statistically reliable

Жүктеу (209KB)
Метадеректер
3. Fig. 2. Frequency of mutations in blood and buccal epithelium of patients with lung cancer. * p < 0.05, differences in frequency of occurrence according to Pearson's χ2 are statistically reliable

Жүктеу (109KB)
Метадеректер
4. Fig. 3. Number of different types of mutations in buccal epithelium and blood in patients with lung cancer

Жүктеу (299KB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».