Detection of new phylogenetic lineages in the korean field mouse in the south of Sikhote-Alin based on analysis of the cytochrome b gene variability

Толық мәтін

Восточноазиатская мышь Apodemus peninsulae Thomas, 1906 – типичный представитель лесной фауны на юге Дальнего Востока России. Являясь обитателем смешанных и широколиственных лесов, вид распространен от тихоокеанского побережья на востоке, включая острова Русский и Стенина в зал. Петра Великого (Японское море), о-в Сахалин, о-в Хоккайдо (Япония), до Центральной и Южной Сибири (правобережье р. Оби) на западе. По побережью и долинам рек глубоко проникает на север вплоть до Полярного круга. Филогеография этого очень многочисленного и широко распространенного вида ранее изучалась в ряде исследований, в результате которых было показано, что на севере ареала (северо-восток Китая, Корея, Монголия, Япония и Россия) присутствуют три филогенетические линии [1–4]. Две из них имеют широкое распространение, а третья обнаружена только у одной особи из провинции Хэйлунцзян в северо-восточной части Китая [2]. При этом на территории юга Дальнего Востока России была обнаружена только одна из широко распространенных линий, названная нами “Amur” (ранее “Primorye”) [4]. Следует отметить, что при этом было проанализировано 59 экз. с Дальнего Востока России (32 экз. с островов и 27 – с материка с малым размером выборок). Проведенный анализ восточноазиатских мышей из девяти локальных выборок с юга Корейского п-ова не только подтвердил данные предыдущих исследований [2] о более тесной связи с особями восточнокитайских или сибирских популяций, нежели с дальневосточными популяциями, но и показал отсутствие генетического обмена с соседними популяциями [5]. В дальнейшем при проведении анализа изменчивости участка гена цитохрома b у восточноазиатской мыши A. peninsulae из популяции Национального парка “Земля леопарда” на самом юге Приморского края нами впервые были обнаружены гаплотипы филогенетической линии “Korea” [6] с достаточно высокой частотой (38.46% – пять из 13 особей).

Таким образом, стало понятно, что распространение особей, имеющих гаплотипы филогенетической линии “Korea”, не ограничивается Корейским п-овом, как считали корейские авторы [5], а исследование небольшого числа очень малочисленных выборок явно недостаточно для понимания филогенетической структуры восточноазиатской мыши на столь обширной и географически сложной территории. Таким образом, для выявления полной картины генетического разнообразия вида необходимо увеличение не только географии выборок, но и их объема.

Цель настоящего исследования – на примере выборки из популяции Уссурийского заповедника как района экологического оптимума для восточноазиатской мыши охарактеризовать генетическое разнообразие на основе анализа изменчивости гена цитохрома b.

В настоящей работе проанализирована изменчивость гена цитохрома b у 11 экземпляров восточноазиатских мышей из Уссурийского заповедника, расположенного на южных отрогах Сихотэ-Алиня в горах Пржевальского. Образцы тканей взяты из коллекции УНУ “Биоресурсная коллекция ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН” (г. Владивосток).

ДНК выделяли методом солевой экстракции [7] из фиксированных в спирте тканей мышц. Схемы амплификации и использованные праймеры для получения фрагмента и подготовки проб к секвенированию были описаны ранее [4]. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе ABI Prizm 3130 (Applied Biosistems, США) на базе ЦКП «Биотехнология и генетическая инженерия» ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН (г. Владивосток). Выравнивание последовательностей проводили с использованием программы BioEdit 7.2.5.0 [8], а построение филогенетических деревьев выполнено в программе MEGA X [9]. При построении деревьев в анализ включены 38 нуклеотидных последовательностей, полученных ранее и помещенных в GenBank (NCBI) под номерами AB073788, AB073790, AB073791, AB073794–AB073798, AB073800–AB073805, AB073808, AB073810 [1], AF427335–AF427338 (Деконенко, Иванов не опуб.), JQ664596, JQ664597 [3], AY388999–AY389000, AY389002 [10], AM945780, AM945797 [2], MG748177, MG748179, MG748193, MG748201, MG748239 [11], KT364353, KT364362, KT364369, KT364378, KT364379 [5].

Для построения деревьев применяли метод максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) с использованием эволюционной модели HKY+I (модель Хасегава–Кишино–Яно) [12] со значением эволюционной нейтральности сайтов, равным 0.80, и максимальным логарифмом правдоподобия – 1875.064. Выбор эволюционной модели ML-анализа определяли по результатам модель-теста в программе MEGA X [9], по которым для модели HKY+I были получены минимальные значения байесовского информационного критерия (BIC = 4800.783). В качестве внешней группы использованы гаплотипы южных филогенетических линий вида (AM945797, MG748193 и MG748239), обнаруженные только у особей провинции Сычуань (Китай). Достоверность кластеризации оценивали с помощью бутстрэп-анализа (1000 повторностей). Сети гаплотипов построены при помощи программы Network 10.0.0.0 с использованием метода «Median-Joining» [13].

Для всех 11 новых образцов восточноазиатской мыши были получены последовательности длиной от 746 до 1476 пн, включающие участки гена цитохрома b и контрольного региона мтДНК, все они внесены в GenBank (NCBI) под номерами PP488384–PP488394. После выравнивания с гомологичными последовательностями из GenBank (NCBI) полученные последовательности участка гена цитохрома b были обрезаны до длины 744 пн. Всего обнаружено девять гаплотипов, из которых восемь были обнаружены впервые. Они содержали 28 вариабельных сайтов (3.76%), среди которых 18 были информативными. Из обнаруженных гаплотипов два были встречены у двух особей, а остальные семь (77.78%) были уникальными (встречены только у одной особи). Среднее число нуклеотидных различий между гаплотипами составило 8.58. Гаплотипическое разнообразие для выборки равно 0.964 ± 0.051, а нуклеотидное – 0.01153 ± 0.00309, что больше, чем было выявлено раньше для Дальнего Востока России (0.942 ± 0.048 и 0.00636 ± 0.00105 соответственно) [2] и Южной Кореи (0.98 ± 0.01 и 0.00844 ± 0.00042 соответственно) [5].

Все новые последовательности на ML-дендрограмме были распределены на три клады, которые соответствуют линиям “Amur”, “Korea” и “Manchuria” (рис. 1, а). Линии “Amur” и “Korea” на дереве сестринские, а линия “Manchuria” расположена базальнее, что указывает на ее большую древность. Большая часть последовательностей (72.73%) попала в кладу “Amur”, одна последовательность (9.09%) – в кладу “Korea”. Стоит отметить, что частота встречаемости особей с гаплотипами “Korea” на самом юге Приморского края в Хасанском районе несколько выше и составляет 38.46% [6]. Два гаплотипа 207-18 и 208-18 сгруппировались вместе с гаплотипом, обнаруженным ранее у особи из провинции Хэйлунцзян северо-востока Китая [2], сформировав кладу “Manchuria”.

 

Рис. 1. ML-дендрограмма (а) и филогенетическая сеть гаплотипов цитохрома b мтДНК (б) восточноазиатской мыши. В узлах ветвления указаны бутстреп-поддержки, рассчитанные для 1000 повторов. Номера образцов из Уссурийского заповедника обозначены на дереве жирным шрифтом. Размеры кружков пропорциональны количеству образцов с данным гаплотипом. Цифры и риски на ветвях сети соответствуют числу нуклеотидных замен больше двух.

 

С целью проведения более точной кластеризации гаплотипов восточноазиатской мыши была построена медианная сеть (рис. 1, б). В целом сеть подтверждает данные, полученные при ML-анализе, показывая разделение всех вновь исследованных гаплотипов на три линии. Линия “Amur” имела структуру, близкую к звездообразной, формирование которой, как правило, объясняют быстрой экспансией после сокращения численности (“бутылочного горлышка”). Центральный гаплотип этой линии был обнаружен у двух особей (203-18 и 214-18), а все остальные отличались от него на 1–2 нуклеотидные замены.

Линия “Korea” генетически более разнообразна, чем линия “Amur”. Ранее было показано, что внутри этой линии выделяются две подгруппы, которые приурочены к различным географическим регионам [4, 5]. Первая – к Корейскому п-ову, а вторая – к Монголии, Алтаю и Забайкалью. Гаплотип 225-18, обнаруженный в Уссурийском заповеднике, оказался наиболее близок к гаплотипу KT364353 из Южной Кореи (пос. Джинбу в уезде Пхенчхан в провинции Канвондо), отличаясь от него тремя транзициями. Учитывая тесную связь гаплотипов из Уссурийского заповедника и Южной Кореи, а также снижение частоты встречаемости особей с гаплотипами этой линии от южных (Хасанский р-н) к центральным (Уссурийский заповедник) районам Приморского края, можно предположить, что происходит расширение линии “Korea” и проникновение ее на север.

Гаплотипы особей, попавшие в кладу “Manchuria” (207-18 и 208-18), отличаются от гаплотипа особи из провинции Хэйлунцзян северо-востока Китая по трем заменам, а друг от друга по двум. Можно предположить, что особи с гаплотипами “Manchuria” проникают на территорию Уссурийского заповедника с северо-востока Китая. Тогда следует ожидать, что частота встречаемости особей с гаплотипами этой группы в западных районах Приморского края должна быть выше. Однако на сегодняшний момент это невозможно оценить, поскольку восточноазиатская мышь из этих районов остается неисследованной.

В результате проведенной работы были получены новые данные по изменчивости участка гена цитохрома b мтДНК восточноазиатской мыши A. peninsulae в Уссурийском заповеднике, расположенном на южных отрогах Сихотэ-Алиня в горах Пржевальского. Впервые показано обитание в этом районе особей с гаплотипами трех филогенетических линий “Amur”, “Korea” и “Manchuria”. При этом если филогенетическая линия “Korea” раньше уже отмечалась нами на территории края, то линия “Manchuria” обнаружена впервые. Высказано предположение, что особи с гаплотипами филогруппы “Korea” проникают на юг Сихотэ-Алиня из Южной Кореи, а с гаплотипами филогруппы “Manchuria” – из Северо-Восточного Китая.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-24-00158, https://rscf.ru/project/24-24-00158/

Исследование одобрено Этическим комитетом ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН (21 февраля 2023 г., протокол № 1).

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

V. Tsukanova

Federal Scientific Center of the East Asia Terrestrial Biodiversity, Far East Branch Russia Academy of Sciences

Email: sheremet76@yandex.ru
Ресей, Vladivostok, 690022

I. Sheremetyeva

Federal Scientific Center of the East Asia Terrestrial Biodiversity, Far East Branch Russia Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: sheremet76@yandex.ru
Ресей, Vladivostok, 690022

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар