Production of antimicrobial compounds in Lactobacillus brevis cells

Full Text

Одной из распространенных форм взаимоотношений микроорганизмов в природе является антагонизм, при котором бактерии одного вида угнетают жизнедеятельность представителей других видов. При изучении антагонистической активности пробиотиков (Бухарин и соавт., 2010, 2014) и описании механизмов влияния ассоциативных микроорганизмов на антагонистическую активность бактерий (Семенов и соавт., 2011) установлено, что ассоцианты способны стимулировать антагонизм, влиять на него индифферентно, вызывать ингибирующий или инвертирующий эффекты. Микроорганизмы в составе филлосферы и эндосферы растений отвечают за антагонизм к большому спектру фитопатогенов Erysiphe graminis, Cladosporium fulvum, Phytophthora sp. и др. (Каблова и соавт., 2015), повышают продуктивность растения, контролируют реакции адаптации к стрессам и прямой стимуляции роста растений (Lamont et al., 2017). Лактобактерии, выделенные из микрофлоры растений, способны вырабатывать органические кислоты и ряд антимикробных соединений, что сделало их незаменимыми при консервировании продуктов растительного и животного происхождения (de Vuyst, Vandamme, 1994) и использования в качестве пробиотиков (Naidu et al., 1999).

Для реализации цели исследования, направленной на изучение особенностей продукции антимикробных соединений лактобактериями, использован штамм Lactobacillus brevis 2kGv 22-17, выделенный из эпифитной микрофлоры ежи сборной (Dactylis glomerata). Штамм Lactobacillus brevis 2kGv 22-17 предоставлен сотрудниками ООО “Микробиом” инновационного сектора Петрозаводского госуниверситета из фонда Коллекции молочнокислых бактерий лаборатории микробиологии. Кинетику роста лактобактерий и время достижения максимальной оптической плотности оценивали на жидкой среде MRS (Man et al., 1960) в статических температурных условиях персонального биореактора RTS-1С (“Biosan”, Латвия) с программным обеспечением и функцией контроля роста микроорганизмов в режиме реального времени.

Определение способности лактобактерий продуцировать антимикробные соединения выполняли на основе метода диффузии антибактериальных субстанций в агар [ОФС.1.2.4.0010.15.]. Для проведения эксперимента использовали ночную культуру молочнокислых бактерий, которую выращивали в среде MRS в течение 12 ч (Kurokawa, Ying, 2017). Для исследования продукции антимикробных соединений клетками L. brevis использовали плотную питательную среду, состоящую из ГМФ бульона (ООО “НИЦФ”, Россия) – 30 г/л, агар-агара бактериологического Bacto (“BD”, США) – 17 г/л и глюкозы – 10 г/л. Среду разливали в стерильные чашки Петри в два слоя. После застывания нижнего соя, в чашку Петри вносили верхний слой питательный среды, которую предварительно смешивали с суспензией, находящейся в стационарной фазе роста индикаторной культуры, в объеме 10 мл. В качестве индикаторных или тест-культур использовали Cytophaga psychrophila IM-87, Flexibacter columnaris IM-216 и Pseudomonas fluorescens IM-43, предоставленные сотрудниками лаборатории микробиологии НИЦ по аквакультуре Петрозаводского госуниверситета из фонда Коллекции ассоциативной микрофлоры рыб. В готовой среде на равном расстоянии друг от друга делали лунки диаметром около 5 мм. В лунки вносили по 0.1 мл микробной суспензии лактобактерий L. brevis 2kGv 22-17 (опыт 1), протопласты (опыт 2) и лизат клеток (опыт 3). Посевы выдерживали при температуре 21 ± 2°C в течение 1‒2 ч, чтобы обеспечить равномерное распределение и рост микроорганизмов. Затем посевы культивировали при температуре 37.0 ± 0.2°C в течение 16‒18 ч, после чего регистрировали зоны задержки роста бактериального газона вокруг лунок. Диаметры зон угнетения роста индикаторных микроорганизмов оценивали с точностью до 0.1 мм. Протопласты лактобактерий готовили из культуры, выращенной в MRS бульоне в течение 12 ч. Клетки осаждали на центрифуге SIGMA 1-15P при 3000 об./мин в течение 10 мин. Супернатанты обрабатывали лизоцимом (“AppliChem”, Германия) в концентрации 1.5 мг/л в присутствии стабилизатора осмотического давления 0.5% NaСl и фильтровали через мембранные фильтры “MF-Millipore” (диаметр пор 0.22 мкм) (Алешина и соавт., 2017). Для получения лизатов клеток использовали 70% изопропанол и 0.1% трифторуксусную кислоту, согласно методу определения антимикробной активности лизата клеток (Field et al., 2008; Миралимова и соавт., 2016).

Все эксперименты ставили в трехкратной повторности, статистическую обработку данных выполняли на основе программы Statistica 6.0.

В результате культивирования в статических условиях за 58 ч эксперимента получена характеристика роста культуры L. brevis 2kGv 22-17. На основе данных по культивированию лактобактерий с использованием биореактора RTS-1C построен типовой график роста лактобактерий. Данные обработаны с помощью программного обеспечения Grant Instruments “Labvise”, которое позволяет контролировать рост микроорганизмов в режиме реального времени. В процессе культивирования использовалось вихревое перемешивание ингредиентов (Vortextypemixing) с интервалом в 10 мин. Адаптация микроорганизма к условиям культивирования длилась в течение 11 ч. С 12 по 21 ч отмечалась стадия экспоненциального роста, с последующим переходом в стадию стационарного роста, что соответствовало 2.14 OD и значениям µ (h ̄¹) – 0.02 в 130 точке измерения. Установлено, что антагонистическая активность выявляется в культуре в период экспоненциальной фазы, которая длилась в течение 9 ч. Также антибактериальная активность сохраняется в среде и при переходе развития культуры в стационарную стадию роста и продолжается в течение 37 ч (рисунок).

Рисунок. Кривая непрерывного роста бактерий L. brevis 2kGv 22-17 в жидкой среде MRS при 37°С с периодическим вихревым перемешиванием в течение 58 ч с интервалом каждые 10 мин.

В присутствии суспензии лактобактерий L. brevis 2kGv 22-17 антимикробная активность проявлялась в виде незначительного подавления роста индикаторных микроорганизмов. Средние значения диаметра зоны задержки роста тест-культур C. psychrophila, F. columnaris и P. fluorescens находились в пределах от 9.30 ± 0.2 мм (для F. columnaris) до 11.4 ± 0.2 мм (для P. fluorescens). Присутствие лизатов исследуемых бактерий не привело к антибактериальному эффекту в отношении индикаторных видов бактерий, во всех вариантах опыта наблюдалось проявление роста культур. Наиболее выраженной антимикробной активностью обладали только протопласты штамма L. brevis 2kGv, о чем свидетельствовали большие зоны торможения роста для P. fluorescens (21.3 ± 0.6 мм), C. psychrophila (18.6 ± 0.8 мм) и F. columnaris (18.2 ± 0.4 мм). Наибольший бактерицидный эффект обнаружен в отношении псевдомонад. Зоны торможения роста тест-культур в присутствии микробной суспензии, протопластов и лизата клеток L. brevis 2kGv 22-17 представлены в таблице.

Таблица. Диаметр зоны задержки роста индикаторных тест-культур

В результате изучения продукции антимикробных соединений в клетках L. brevis 2kGv 22-17 установлено, что наиболее выраженной антимикробной активностью обладают протопласты исследуемых лактобактерий. Наибольший эффект подавления роста тест-культуры обнаружен в отношении P. fluorescens. В присутствии протопластов лактобактерий зона торможения роста индикаторного микроорганизма достигала 21 мм. Благодаря выполненному исследованию кинетики роста L. brevis 2kGv 22-17 установлено, что адаптация исследуемых бактерий к условиям культивирования длится 11 ч, экспоненциальная фаза – 9 ч и стабильная стационарная фаза роста – 37 ч. Учитывая особенность молочнокислых бактерий продуцировать антимикробные соединения в разные периоды роста микропопуляции, применение данного подхода позволяет с высокой точностью по большому количеству заданных параметров, таких как температура культивирования, оптическая плотность, удельная скорость роста, продолжительность лаг-фазы, фазы экспоненциального роста и стационарной фазы, проанализировать и предсказать физиологическое состояние микроорганизма для объективного мониторинга за его антагонистической активностью. Бактерии L. brevis 2kGv 22-17 способны продуцировать антимикробные соединения в процессе роста на питательной среде MRS при исходном рН 6.2 и постоянном контроле температуры биопроцесса 37°С. Продукция антибактериальных соединений начинается через 12 ч после начала культивирования в экспоненциальной фазе роста, что подтверждается данными других исследователей (Todorov, 2005). Наиболее выраженный антагонизм исследуемого штамма L. brevis 2kGv 22-17 выявлен в случае использования протопластов продуцента, в присутствии которых величина задержки роста индикаторных тест-культур изменялась от 1.2 до 21.3 см. Полученный эффект можно связать с тем, что антимикробным соединениям L. brevis 2kGv 22-17 не надо преодолевать барьер в виде клеточной стенки, за счет чего и возрастает обнаруженное бактерицидное действие.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 322-23 (Соглашение № 23-16-20026), проводимого совместно с Республикой Карелия с финансированием из Фонда венчурных инвестиций Республики Карелия (ФВИ РК).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

N. A. Sidorova

Author for correspondence.
Email: vanlis@petrsu.ru
Russian Federation, 185035, Petrozavodsk

A. I. Savushkin

Email: vanlis@petrsu.ru
Russian Federation, 185035, Petrozavodsk

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure: Continuous growth curve of L. brevis 2kGv 22-17 bacteria in liquid MRS medium at 37°C with periodic vortex mixing for 58 h at 10 min intervals.

Download (21KB)

Indexing metadata