Structural and functional characteristics of the microbial community emerging upon its contact with extruded polystyrene waste

全文:

Со времен промышленной революции антропогенная нагрузка на окружающую среду неуклонно растет. Среди важных факторов следует выделить загрязнение отходами и отдельный его вид – загрязнение полимерными ксенобиотиками. В течение 2019‒2020 гг. в мире было произведено в среднем от 368 до 415 млн. тонн пластика (с ожидаемым приростом 4% в ближайшие годы), что привело к возрастающим масштабам поступления пластиковых отходов в окружающую среду (Billard, Boucher, 2019; Plastics Europe, 2021). Создатели пластиков исходили из того, что изделия будут инертны для окружающей среды. Однако оказалось, что под воздействием абиотических факторов – ультрафиолета, колебаний температуры и влажности, ветровой эрозии – пластик разрушается на свалках и распадается на микропластик, который мигрирует со сточными и грунтовыми водами, загрязняя почву, водные ресурсы и заканчивая свой путь в океане. Показано, что микропластик отрицательно влияет на структуру почвы, ухудшая ее водоудерживающую способность и аэрацию, а также оказывает негативное влияние на круговорот органического углерода и азота в почве, микробную активность почвы и перенос питательных веществ (Cao et al., 2017; Liu et al., 2017; Rillig, 2018; Ruimin et al., 2020).

Микропластик попадает в пищевые цепи, обнаруживается в крови и легких человека, проникает через плацентарный барьер, приводит к риску воспаления сосудов (Ragusa et al., 2021; Vethaak, Legler, 2021; Vlacil et al., 2021; Field et al., 2022).

Значительная доля объемов мирового производства пластика приходится на полистирол (ПС), так как это легкий, дешевый, термостойкий материал, широко используемый в строительстве, упаковке, изделиях бытового назначения, электротехнике, лабораторном оборудовании. ПС получают полимеризацией стирола. Молекула содержит фенильную группу (рис. 1).

 

Рис. 1. Структурная формула ПС (Малкин и соавт., 1975).

 

В производстве изделий из ПС используются красители, пластификаторы, стабилизаторы (Бакирова, Зенитова, 2009). Для переработки ПС во вспененный полистирол (ВПС) широко применяют метод экструзии, заключающийся в продавливании насыщенного газом расплава полимера через формующую головку (Ярцев и соавт., 2010). Производство также включает стадию отстаивания для удаления вспенивающего агента и замещения его воздухом. Таким образом достигается объемное соотношение газовой и полимерной фаз от 30 : 1 до 1 : 10. Для утилизации полистирола используют сжигание, термодеструкцию и термоокислительную деструкцию, однако минусом данных методов является образование токсичных продуктов (паров стирола, бензола, этилбензола, толуола, оксида углерода). Перспективной альтернативой является вторичная переработка, однако легкость и дешевизна материала делают сбор отходов из полистирола экономически нецелесообразным, и зачастую компании отдают приоритет переработке других видов пластиков (Клинков и соавт., 2010). Поэтому отходы из вспененного ПС постоянно присутствуют на свалках, в компостируемых массах и в природных местообитаниях.

Биодеградация ПС может быть перспективным решением, однако она осложняется следующими структурными особенностями материала, такими как: молекулярная масса, достигающая 100000–400000 г/моль; гидрофобность; случайное расположение фенильных групп по обеим сторонам полимерной цепи, что обусловливает аморфность полимера; сложность деполимеризации, связанная с тем, что вновь образованная σ-связь “углерод‒углерод” прочнее, чем π-связь винильной группы.

В литературе приводятся различные и противоречивые данные о микробной деградации ПС (Котова и соавт., 2021). Большинство исследователей отмечают крайне медленную скорость этого процесса (Плакунов и соавт., 2020). Так, известный деструктор органических соединений Rhodococcus ruber в аэробных условиях показал снижение массы ПС 0.8% за 8 нед. культивирования, штаммы Exiguobacterium sibiricum и E. undae достигли убыли 0.4% массы ПС за 30 сут (Mor, Sivan, 2008; Chauhan et al., 2018).

Процесс микробного разложения ПС природными сообществами проходил быстрее: в образцах с мусорной свалки Саримукти в Индонезии убыль массы ВПС за 7 нед. инкубации в присутствии кислорода составила 18.23% (Hidayat et al., 2020).

В литературе имеется значительно меньше данных об изменениях в составе и функционировании микробных сообществ при контакте с ПС, хотя именно они могут свидетельствовать о существенных экологических сдвигах в отдельных местообитаниях и в биосфере в целом. Например, в опыте Zhang et al. (2020) показана сукцессия сообщества активного ила в анаэробных условиях в присутствии микропластика ПС размером 80 нм и 5 мкм в количестве 0.25 г/л c сопутствующим снижением продукции метана на 19.3‒17.9% соответственно. Wei et al. (2020) продемонстрировали, что наночастицы полистирола в количестве 20 и 50 мкг/л также угнетают процесс анаэробного сбраживания сточных вод и снижают выработку метана на 19.0‒28.6% в анаэробном реакторе с восходящим потоком. Изучение воздействия частиц ПС различного размера на микробное сообщество в образцах почвы показало значительное снижение микробной биомассы, уменьшение скорости нитрификации и рост относительной численности микроорганизмов филума Proteobacteria (Ko et al., 2023).

Физико-химические свойства материала во многом определяют методы анализа, применимые для обнаружения признаков деструкции материала в процессе биодеградации. ВПС отличается хрупкостью, пористостью, низкой устойчивостью к растворителям и высоким температурам, по объему содержит до 98% газа, что значительно сужает спектр применимых методик для анализа его состояния.

Целью нашего исследования является изучение изменений состава и функциональных характеристик анаэробного микробного сообщества в присутствии отходов ВПС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологический материал. В работе использовали метаногенное сообщество EPa, выделенное из ила очистных сооружений (EGSB-реактора) стоков пивоваренного завода “Efes Pilsener” (Москва) и адаптированное к полной минерализации 2-аминобензойной кислоты (2-АБК) (Линькова и соавт., 2011).

Образец вспененного полистирола. В экспериментах применяли бытовой ВПС темно-серого цвета, используемый для изготовления подложек для овощей и кондитерских изделий (лоток подложка, 175 × 85 × 20 мм; артикул 1363). Подложку нарезали на пластинки размером 1.5 × 4 см (масса 71.7 ± 7.0 мг), взвешивали, стерилизовали в течение 1 ч в 70% этиловом спирте и сушили в чашках Петри в течение 24 ч.

Среды и условия культивирования. Инкубацию осуществляли в герметичных стеклянных флаконах объемом 100 мл с резиновыми пробками, зажатыми алюминиевыми колпачками, и аргоном в качестве газовой фазы с 50 мл минеральной среды (мг/л): NH₄Cl – 280, CaCl₂ · 2H₂O – 10, K₂HPO₄ – 250, MgSO₄ · 7H₂O – 100, ЭДТА – 1, NaHCO₃ – 5000, H₃BO₃ – 0.05, FeCl₃ · 4H₂O – 2, ZnCl₂ – 0.05, MnCl₂ · 4H₂O – 0.05, CuCl₂ · 2H₂O – 0.03, AlCl₃ · 6H₂O – 2, NiCl₂ · 6H₂O – 0.05, Na₂SeO₃ · 5H₂0 – 0.1; дрожжевой экстракт – 100; начальный pH 7.0 (Sklyar, 2000). Инкубацию проводили при температуре 30°С в статичных условиях в темноте.

В качестве дополнительных акцепторов электронов в среду вносили растворы солей натрия до конечной концентрации 10 мМ: для создания нитратредуцирующих (НР) условий ‒ NaNO₃, для создания сульфатредуцирующих (СР) условий – Na₂SO₄. Для метаногенных (МГ) условий внешние акцепторы не добавляли. Вносили следующие источники углерода и энергии: 2-АБК 1 мМ (в МГ условиях), пируват 1 г/л (в МГ и НР условиях) и лактат натрия 2 г/л (в СР условиях). Субстраты и другие добавки хранили в виде концентрированных анаэробных растворов и вносили во флаконы стерильным шприцем до нужной концентрации. В качестве инокулята использовали суспензию клеток микробного сообщества (ОП₆₀₀ 1.0), предварительно выращенного на минеральной среде с 2-АБК и пируватом в течение 9 сут. Посевной материал составлял 10% от объема среды. В качестве контролей использовали минеральную среду без и с дополнительными акцепторами электронов, в которую был помещен ВПС, без микробных клеток (химический контроль), и минеральную среду без ВПС, содержащую микробное сообщество (биологический контроль, контроль роста клеток).

Методы анализа. В культуральной жидкости отслеживали изменения рН, содержания общего белка и летучих жирных кислот (ЛЖК), а в газовой фазе следили за соотношением основных газов. Для регистрации возможной деструкции ВПС отслеживали визуальные изменения поверхности и целостности пластика, определяли присутствие микропластика в культуральной жидкости и фиксировали убыль массы образцов ВПС. Морфологические особенности микроорганизмов исследовали микроскопически, а изменения в составе микробного сообщества ‒ с помощью высокопроизводительного секвенирования участков гена 16S рРНК.

Измерение рН культуральной жидкости проводили с помощью тест-полосок (“Johnson”, Великобритания).

Определение белка. Измерение общего белка в культуральной жидкости проводили по Бредфорд (Bradford, 1976). Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием при 15000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант в объеме 50 мкл помещали в микропробирки, смешивали с 950 мкл красителя Кумасси, избегая образования пены. Измеряли оптические плотности испытуемого раствора и растворов сравнения с известным содержанием белка на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 (“Shimadzu”, Япония) при длине волны 595 нм, с использованием в качестве контрольного раствора смеси 50 мкл дистиллированной воды и 950 мкл красителя Кумасси.

Определение содержания летучих жирных кислот. Содержание ЛЖК в культуральной жидкости определяли с помощью газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Кристалл 5000М (“Хроматэк”, Россия), используя капиллярную колонку 50 м × 0.32 мм, HP-FFAP, 0.5 мкм, пламенно-ионизационный детектор. Пробу предварительно осаждали центрифугированием при 15000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант объемом 1 мкл вводили в прибор. Определение концентрации компонентов смеси осуществляли на основе вычисления отношения площадей пиков компонентов к соответствующим площадям пиков веществ в стандартных растворах.

Определение содержания газов. Каждые 30‒40 сут шприцем отбирали 1 мл пробы газовой фазы флакона и определяли содержание метана, углекислого газа и сопутствующих газов на газовом хроматографе ЛХМ 8 МД ‒ модель 3 с катарометром (“Хроматограф”, Россия), газ-носитель ‒ аргон, скорость газа-носителя ‒ 20 мл/мин. Колонки длиной 2 м были заполнены порапаком QS. Количественное определение компонентов проводили на основе вычисления площади под хроматографическим пиком. Избыточное давление во флаконах измеряли с помощью манометра 332.30 (“WIKA”, Германия) и учитывали эти данные при расчете конечных концентраций газовых метаболитов. Для преобразования численного значения объемной концентрации газа, выраженной в процентах, в молярную концентрацию (мМ) применяли следующую формулу:

$Y=\frac{(P_1\times P_{общ.}\times T_0\times V_{г.ф.})}{\left(P_0\times 22.4\times T_1\times V_{ж.ф.}\right)}\times \mathrm{1000,}$

где Р₁ – парциальное давление газа, (%/100); V_ж.ф. – объем жидкой фазы во флаконе, мл; V_г.ф. – объем газовой фазы во флаконе, мл; Т₀ – температура при нормальных условиях, 273°К; Т₁ – рабочая температура, °К; Р₀ – давление при нормальных условиях, 1 атм.; Р_общ ‒ общее давление во флаконе, атм.; 22.4 – объем 1 моль газа при 273°К, л∙моль^-1. При этом делали допущение, что весь газ, образовавшийся в культуральной жидкости, выходит в газовую фазу флакона.

Гравиметрия. Образцы пластика извлекали из флаконов, трижды промывали дистиллированной водой, помещали в 2% раствор додецилсульфата натрия на 1 ч на ротационный шейкер со 160 об./мин при 30°С, после чего снова трижды промывали водой и сушили 24 ч в открытых чашках Петри в термостате при температуре 55°С. Отмытые и высушенные образцы взвешивали на электронных весах ER-60A (“A&D”, Япония).

Световая микроскопия. Морфологию микроорганизмов исследовали путем приготовления препаратов живых и фиксированных окрашенных фуксином клеток (ФОП) и их просмотра в световом микроскопе Биолам 2 (“ЛОМО”, Россия). Количество частиц микропластика определяли подсчетом в камере Горяева‒Тома при просмотре в том же световом микроскопе при увеличении ×40 с последующим пересчетом на объем культуральной жидкости.

Сканирующая электронная микроскопия. Препараты клеток для сканирующей электронной микроскопии подвергали фиксации 2.5% глутаровым альдегидом на фосфатном буфере в течение 30 мин, затем дегидрировали в этиловом спирте с постепенным увеличением концентрации (30, 50, 70, 80 и 99.5%) и последующим погружением в смеси абсолютного спирта и ацетона в пропорциях 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3. Препараты выдерживали в абсолютном ацетоне на протяжении 12 ч, затем высушивали в критической точке с использованием оборудования HCP-2 Critical Point Dryer (“Hitachi”, Япония) и покрывали смесью Au‒Pd в ионно-распылительной установке Eiko IB-3 Ion Coater (“Hitachi”, Япония).

Образцы ВПС подвергали напылению смесью Au‒Pd без процедуры сушки, в связи с неустойчивостью материала к используемым в методике растворителям. Анализ образцов проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-6380LA (“Jeol”, Япония) в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме регистрации вторичных электронов.

Определение состава микробного сообщества. Состав микробного сообщества анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования участков гена 16S рРНК. Следуя инструкциям производителя, выделяли из проб тотальную ДНК (набор FastDNA Spin Kit for Soil; “MP Biomedicals”, США) и оценивали концентрацию и чистоту препаратов ДНК спектрофотометрически на приборе NanoDrop 2000C (“Thermo Fisher Scientific”, США) при λ 260 и 280 нм. Амплификацию фрагментов генов 16S рРНК проводили с помощью ПЦР, используя “универсальные” праймеры для участка V4 по методике Fadrosh et al. (2014). Применяли систему праймеров 515F (5'- GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3') (Hugerth et al., 2014) и Pro-mod-805R (5'-GACTACNVGGGTMTCTAATCC-3') (Merkel et al., 2019). Полученные ПЦР-фрагменты секвенировали на платформе MiSeq (“Illumina”, США) с использованием набора реактивов для считывания 150 нуклеотидов с каждого конца. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили при помощи программного пакета QIIME2 (Bolyen et al., 2019). Относительное количество прочтений, входящих в ту или иную ОТЕ, соответствует относительной представленности данного таксона микроорганизмов в исследуемом микробном сообществе. Статистические подсчеты осуществляли с помощью Microsoft Excel. Тепловые карты для сравнительного анализа филогенетического состава микробных сообществ генерировали с помощью платформы ClustVis ‒ https://biit.cs.ut.ee/clustvis/ (Metsalu, Vilo, 2015).

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Для каждой точки вычисляли среднее значение, которое сравнивали по показателям стандартного отклонения и доверительного интервала при P ≤ 0.005. На графиках представлены значения в виде “среднее ± среднее отклонение”. Вычисления проводили в программе Microsoft Excel 2007 (“Microsoft”, США) и STATISTICA (StarSoft Россия, 2015).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех донорно-акцепторных условиях в вариантах с ВПС наблюдали помутнение среды (доп. материалы, рис. S1), тогда как в контрольных вариантах без пластика среда оставалась прозрачной.

В МГ условиях во флаконах с ВПС формировался мелкий рыхлый черный осадок, в то время как без ВПС образовавшийся осадок в виде плотных агрегатов клеток имел светло-бежевый цвет.

В НР условиях в присутствии ВПС наблюдали образование мелкого плотного бежевого осадка и его последующее превращение в черный рыхлый осадок, в то время как в контрольном варианте без пластика осадок в виде плотных агрегатов сначала имел яркий рыжий цвет, а затем стал бежевым.

В СР условиях в присутствии ВПС образование мелкого черного рыхлого осадка происходило в большем количестве, чем в контрольном варианте без пластика.

В вариантах микробного сообщества, инкубируемых без пластика, значение pH составляло 7.7‒8.2 и существенно не изменялось на протяжении всего времени эксперимента. В вариантах с добавлением ВПС во всех донорно-акцепторных условиях на 99-е сут происходило некоторое снижение pH (до 6.3‒7.0), вероятно, связанное с образованием ЛЖК. Схожее снижение pH с 7.0 до 6.8 было показано Naz et al. (2013) при культивировании активного ила очистных сооружений с фрагментами упаковочного материала на основе ПС в стеклянных флаконах объемом 2892 мл в анаэробных условиях в течение 9 нед., что авторы также связывают с накоплением кислых продуктов.

Содержание белка в вариантах с ВПС на протяжении эксперимента немного превышало содержание в вариантах без ВПС, к 267 сут в вариантах с СР и МГ условиями разница резко увеличилась, в случае НР условий разница увеличилась к 307 сут эксперимента (рис. 2).

 

Рис. 2. Содержание белка в сообществе EPа в МГ (черный цвет), НР (светло-серый цвет) и СР условиях (темно-серый цвет); сплошная линия – опыт в присутствии ВПС; пунктирная линия – биологический контроль.

 

Сходный характер кривой содержания белка получен в исследовании процесса формирования биопленки аэробным штаммом Bacillus megaterium на поверхности ПС. К третьему дню культивирования в опыте содержание белка достигло пика в 91.1 мкг/мл, но к десятому дню резко снизилось до минимального значения в 46.4 мкг/мл. Последующее культивирование в течение 40 сут показало устойчивый медленный рост содержания белка до 64.7 мкг/мл. Авторы связывают колебания в содержании белка с быстрой пролиферацией клеток при прикреплении к поверхности пластика, гибелью клеток в процессе адаптации к ПС в качестве единственного источника углерода и медленным ростом адаптированных клеток (Tan et al., 2021).

Определение промежуточных летучих продуктов в анаэробных микробных сообществах, контактирующих с ВПС, показало, что в МГ условиях с ВПС образуется на 120.3% больше формиата по сравнению с аналогичным микробным сообществом без добавления пластика. В НР и СР условиях с ВПС разница в образовании формиата составила до 39.8 и 13.8% соответственно (доп. материалы, рис. S2). Образование ацетата в присутствии ВПС превышало показатели по сравнению с аналогичным микробным сообществом без добавления пластика в МГ условиях на 18.7%, в НР ‒ до 23.5%, в СР ‒ до 21.6% (доп. материалы, рис. S3). Продукция пропионата в контакте с ВПС отличалась на 10.2% в МГ условиях, до 8.1% в НР и до 61.3% в СР условиях (доп. материалы, рис. S4). Разница в образовании валерата в присутствии ВПС по сравнению с аналогичным микробным сообществом без добавления пластика составляла до 113.6% в МГ, до 49.4% в НР и до 43.2% в СР условиях (доп. материалы, рис. S5). Также во всех донорно-акцепторных условиях сообщества, контактировавшие с ВПС, в отличие от контрольных образцов показали наличие следов изобутирата и бутирата.

Можно отметить, что присутствие ВПС вызывает значимые отклонения в содержании и соотношении ЛЖК по сравнению с контрольными образцами без пластика. На 340 сут в опытных образцах наблюдали большее количество формиата, ацетата, пропионата и валерата. Это соответствует результатам измерения pH, показывающим закисление среды. Сходная тенденция показана в работе Zhang et al. (2021b) по изучению влияния пластмасс на производительность реактора и микробные сообщества при ацидогенной ферментации пищевых отходов. В опыте длительностью 25 сут добавление полиэтилена высокого давления и ВПС увеличили общий выход ЛЖК на 28 и 47% соответственно, в то время как добавление полипропилена и полиэтилентерефталата снижало общую продукцию ЛЖК на 6 и 2%. Наибольший выход в присутствии ВПС авторы связывают с высокопористой структурой материала, обеспечивающей эффект иммобилизации клеток микроорганизмов. Также существуют работы, демонстрирующие индуцирующее влияние наночастиц ПС на продукцию ЛЖК в анаэробных реакторах на величины порядка 22.6% с сопутствующим падением выхода биогаза на 67.1% (Wei et al., 2020). В работе Wang et al. (2022) показаны обратные результаты, согласно которым присутствие микро- и наночастиц ПС в реакторе приводит к снижению суммарной продукции ЛЖК до 38.3% и снижению уровня метана на 67.1%.

Обнаружено, что в присутствии ВПС у анаэробного микробного сообщества изменяется количество образованных конечных газообразных продуктов. Показано, что микробное сообщество в МГ условиях в контакте с пластиком продуцирует в 9 раз больше CH₄ и в 2.3 раза – CO₂, чем в контрольных флаконах. Наибольшую разницу наблюдали на 146 сут культивирования, однако впоследствии она сократилась (рис. 3).

 

Рис. 3. Динамика образования газов во флаконах с сообществом EPа в МГ условиях: белые столбики – опыт в присутствии ВПС, серые – биологический контроль.

 

В НР условиях разница в продукции CH₄ для сообщества с ВПС составила до 100 раз, а CO₂ ‒ до 8.8 раза. Наибольшая разница в содержании метана возникла на 349 сут культивирования и составила 50 мМ этого газа. Также в вариантах с пластиком был обнаружен предположительно N₂O в количестве до 0.6 мМ. Содержание N₂O росло до 146-х сут, затем стало падать, и с 267 сут этот газ перестал определяться в пробах из-за исчерпания нитрата в среде (рис. 4).

 

Рис. 4. Динамика образования газов во флаконах с сообществом EPа в НР условиях: белые столбики – опыт в присутствии ВПС, серые – биологический контроль.

 

В СР условиях в первые 2 мес. количество CH₄ во флаконах с ВПС было в 1.6 раза меньше по сравнению с его количеством в контрольных флаконах, однако в конце опыта наблюдали образование CH₄ на 70% выше, чем в контроле (рис. 5).

 

Рис. 5. Динамика образования газов во флаконах с сообществом EPа в СР условиях: белые столбики – опыт в присутствии ВПС, серые – биологический контроль.

 

Наибольшая разница возникла на 349-е сут культивирования и составила 22.9 мМ метана. Продукция CO₂ в СР условиях с ВПС превышала данные показатели для вариантов без пластика на 10% и это соотношение сохранялось на протяжении всего опыта. Сероводород появился в пробах только после 70 сут культивирования, и его количество во флаконах с ВПС продолжало расти за время опыта. В среднем содержание сероводорода в образцах с пластиком было в 2.5‒3 раза выше, чем в контрольных вариантах.

Выход биогаза используется в качестве аналитического параметра для определения конечной биоразлагаемости полимеров в международных стандартах. На количественный выход биогаза влияет множество факторов, таких как время культивирования, закисление среды вследствие накопления ЛЖК, избыточное содержание белка, приводящее к ингибированию метаногенов аммонием (Ножевникова и соавт., 2016). Воздействие ПС и ВПС на продукцию биогаза изучено недостаточно. Большее внимание уделяется влиянию микро- и нанопластиков, однако существующие литературные данные противоречивы. Воздействие микрочастиц ПС размером 80 нм и 5 мкм в концентрации 0.2 г/л и менее не влияло на кумулятивную продукцию CH₄, но концентрации выше 0.25 г/л снижали выход метана на 19.3 и 17.9% соответственно (Zhang et al., 2020). При этом анализ влияния наночастиц ПС показал подавление ацидогенеза в микробном сообществе путем ингибирования активности ацетаткиназы с последующим уменьшением выработки CH₄ (Wang et al., 2022). Выдвигаются предположения о дозозависимом эффекте ПС, например, добавление 20‒40 микрочастиц ПС на 1 г веса сухого анаэробного ила увеличило выход метана на 3.38‒8.22%, но в дозе 80‒160 микрочастиц привело к снижению продукции метана на 4.78‒11.04% (Zhao et al., 2023).

В нашей работе показано, что присутствие ВПС в микробном сообществе не оказывает негативного влияния на процесс метанообразования. Напротив, наблюдающееся увеличение количества газов, как конечных продуктов в вариантах с добавлением пластика по сравнению с вариантами без него, в разных донорно-акцепторных условиях может свидетельствовать о частичной деструкции ВПС и возможности его минерализации до СН₄ и СО₂. Также это говорит о функциональных изменениях анаэробного микробного сообщества при контакте с данными пластиковыми отходами.

По результатам гравиметрии убыль массы образца ВПС составила 2.3% в НР условиях на 349 сут эксперимента. Для вариантов в СР и МГ условиях показатели были нестабильными, в связи с чем невозможно достоверно подтвердить убыль массы данных образцов. Это вызвано такой особенностью гравиметрического метода, как низкая чувствительность при маленьких значениях измерений. Исследователи также отмечают сложность достижения необходимой степени очистки образца, особенно для таких пористых материалов, как ВПС (Muller, 2005). Также потеря массы может быть связана с исчезновением летучих и растворимых примесей (Lucas et al., 2008). Следует отметить, что гравиметрия затрагивает только ранние стадии процесса биоразложения, но не дает информации о степени минерализации (Zee, 2005). По литературным данным для ПС характерна малая скорость разложения. Syranidou et al. (2017) показали убыль массы ПС на 0.19‒4.7% спустя 12 мес. инкубации с различными морскими микробными сообществами и пленками ПС в качестве единственного источника углерода и энергии. В реакторе с анаэробным микробным сообществом удалось достичь биодеструкции ВПС до 6.3% за 25 сут (Zhang et al., 2021b).

Для первоначальной оценки биоразложения также используют визуальное наблюдение за структурой поверхности полимера (появление шероховатости, образование отверстий и трещин, изменение цвета) и методы микроскопии – сканирующей электронной, атомно-силовой, поляризационной (Ba Ho, 2018). В эксперименте с микробным сообществом EPa показано, что поверхность пластика во всех опытных вариантах стала более рыхлой, рельефной, появились неровности, трещины и отверстия (рис. 6).

 

Рис. 6. Сканирующая электронная микроскопия поверхности ВПС: а ‒ химический контроль (среда без клеток); б – МГ условия; в – НР условия; г ‒ СР условия. Увеличение ×30.

 

Различия на поверхности полимеров также обнаружены при сравнении необработанных и обработанных микроорганизмами морского сообщества пленок ПС (Syranidou et al., 2017). Образцы, выветренные естественным путем, имели более гладкую поверхность без трещин и отверстий, в то время как инкубация с морскими консорциумами привела к увеличению шероховатости и появлению множества трещин. Naz et al. (2013) показали образование биопленки сообществом активного ила на поверхности ПС спустя 9 нед. инкубации как в аэробных, так и в анаэробных условиях, сопровождаемое структурными изменениями поверхности материала. Отмечено, что на частицах ПС образуется более толстая микробная биопленка, чем на других пластиках, таких как полиэтилен и полипропилен. Авторы связывают это с пористостью материала и большим количеством складок (Shi et al., 2022).

В культуральной жидкости вариантов с ВПС присутствовало довольно большое количество микрочастиц черного цвета и разного размера (рис. 7): в НР условиях – 2.4 × 10⁶/мл, в СР условиях – 1.2 × 10⁶/мл и в МГ условиях – 0.4 × 10⁶/мл. В большинстве случаев они обнаруживались в составе скоплений клеток, но иногда встречались и в свободном состоянии. В контрольных вариантах (без клеток) микрочастицы обнаружены не были.

 

Рис. 7. Световая микроскопия культуральной жидкости микробного сообщества в присутствии ВПС: а ‒ химический контроль; б – МГ условия; в – НР условия; г – СР условия. Увеличение ×400.

 

Известно, что микро- и наночастицы пластика образуются в результате фрагментации пластикового мусора, происходящей под действием абиотических и биотических факторов (Zhang et al., 2021a). Однако свидетельства образования микропластика в процессе микробной биодеградации недостаточно представлены в литературе. Мы полагаем, что под действием анаэробного микробного сообщества происходит медленная частичная деструкция пластинки ВПС путем фрагментации с образованием микрочастиц данных отходов, что еще раз показывает экологическую опасность пластикового загрязнения. Поскольку на начальных стадиях процесса производства вспененного полистирола образуется гомогенная масса, состоящая из стирола и различных красителей и добавок, которая затем подвергается полимеризации и отвердению, то обнаруженные твердые микрочастицы могут содержать все эти вещества и/или интермедиаты их деструкции. Для определения химического состава микрочастиц требуются дальнейшие исследования, однако, так как в химическом контроле (варианте без клеток) микрочастиц не обнаружено, то их наличие в опытных вариантах свидетельствует, что такая фрагментация пластинки ВПС – это результат деятельности микроорганизмов.

В процессе культивирования микробного сообщества в контакте с ВПС наблюдали его морфологические изменения. Так, по данным световой и сканирующей электронной микроскопии исходное сообщество было представлено различными типами палочек и кокков, объединенных в агрегаты темного цвета, с преобладанием крупных прямых палочек с обрубленными концами в виде коротких цепочек и коккобацилл, лежащих попарно (доп. материалы, рис. S6). В МГ условиях в присутствии пластика отмечено исчезновение крупных прямых палочек с обрубленными концами в виде коротких цепочек, появление значительного количества крупных кокков в скоплениях и по отдельности, а также крупных, среднего размера и коротких палочек (доп. материалы, рис. S7). В НР условиях с ВПС в микробном сообществе также отмечено исчезновение крупных прямых палочек с обрубленными концами в виде коротких цепочек. Обнаружено большое количество изогнутых палочек, кокки среднего и маленького размера, отдельные короткие палочки (доп. материалы, рис. S8). В варианте, инкубировавшемся в СР условиях с пластиком, было отмечено наличие изогнутых клеток, а также крупных палочек, крупных и мелких кокков, расположенных отдельно и в скоплениях (доп. материалы, рис. S9). Рост разнообразия в микробном сообществе, представленный увеличением числа микробных морфотипов, коррелирует с результатами профилирования по гену 16S рРНК.

Анализ филогенетического разнообразия микробных сообществ до и после контакта с ВПС, проведенный с помощью высокопроизводительного секвенирования, показал, что в исходном метаногенном сообществе, адаптированном к 2-АБК, значительно преобладают представители родов Lysinibacillus (48.0%), Brevibacillus (19.9%), Clostridium (5.6%), и Sedimentibacter (5.2%) (рис. 8).

 

Рис. 8. Тепловая карта распределения 38 доминантных таксономических единиц бактерий и архей по 4 библиотекам, представляющим микробные сообщества до и после контакта с ВПС. Представленность родов рассчитана как отношение количества ридов, принадлежащих представителям данного рода, к общему количеству ридов в соответствующей библиотеке.

 

Домен Bacteria при пороге отсечения 1% представлен 20-ю таксономическими группами. Представители домена Archaea совокупно составляют 0.025%. При внесении ВПС во всех вариантах (НР, МГ, СР) повысилась степень разнообразия сообщества, при этом доля домена Archaea выросла до 1.7‒6.0%, а бактерий родов Lysinibacillus и Brevibacillus ‒ упала до 0.1‒0.3%. В сообществе в МГ, НР и СР условиях выявлено 29, 35 и 35 групп соответственно. В МГ условиях преобладающими стали Sedimentibacter (15.6%), в НР – Lentimicrobium (19.3%), в СР – новая группа Desulfovibrio (36.1%). Кроме того, зафиксировано появление новых групп: рода Syntrophomonas (10.2%) и сем. Spirochaetaceae (8.0%) в МГ условиях, рода Desulfitobacterium (6.9%), сем. Spirochaetaceae (5.8%), Geobacteraceae (7.5%) и Rikenellaceae (8.0%) в НР условиях и сем. Rikenellaceae (5.3%) в СР условиях.

В архейном компоненте сообщества в возрастании доли метаногенов до 2-6% ключевую роль сыграли представители родов Methanobacterium и Methanosarcina (рис. 9).

 

Рис. 9. Тепловая карта распределения 10 доминантных таксономических единиц архей по 4 библиотекам, представляющим архейный компонент микробных сообществ до и после контакта с ВПС. Представленность родов рассчитана как отношение количества ридов, принадлежащих представителям данного рода, к общему количеству ридов в соответствующей библиотеке.

 

Представители преобладающих таксонов известны как деструкторы ряда сложных органических веществ и ксенобиотиков. Например, Sedimentibacter является деструктором хлорорганических и полициклических соединений (Berdugo-Clavijo et al., 2012; Gomes et al., 2014), Syntrophomonas известен способностью к деградации бутирата (Crable et al., 2016; Wang et al., 2023), для Lentimicrobium показана микробная биодеградация битума, а также антибиотиков сульфаметоксазола и триметоприма (Liang et al., 2019; Pannekens et al., 2021; Song et al., 2021). Хорошо изученным является род сульфатредуцирующих бактерий Desulfovibrio, способный к биоразложению фенантрена и пирена, нитроцеллюлозы, различных фракций сырой нефти (Kim et al., 1995; Giacomucci et al., 2012; Dhar et al., 2023).

Кроме того, известно, что по сравнению с отдельными штаммами микробные сообщества, благодаря синтрофным взаимодействиям, способны более эффективно усваивать сложные субстраты, в том числе химически стабильные и инертные вещества. В процессе анаэробного разложения выделяют следующие стадии: гидролиз, ацидогенез, ацетогенез и метаногенез (Logan et al., 2019; Литти и соавт., 2022). Среди доминирующих в исследуемом сообществе групп гидролитическими и ацидогенными являются представители родов Lentimicrobium и Sedimentibacter. К представителям синтрофных микроорганизмов, осуществляющих ацетогенную стадию разложения продуктов брожения до ацетата, относятся синтрофные бактерии родов Syntrophomonas, Desulfovibrio и Geobacter. Накопленные ацетат, молекулярный водород и углекислоту метаболизируют в метан археи родов Methanobacterium и Methanosarcina.

Ряд работ также регистрирует значительные сдвиги в составе микробных сообществ анаэробного ила, морской воды, почвы, полигона твердых бытовых отходов в присутствии ВПС, ПС или микрочастиц ПС, выражающиеся в смене доминирующих видов и росте таксономического разнообразия (Naz et al., 2013; Syranidou et al., 2017; Tourova et al., 2020; Choi et al., 2021; Vaksmaa et al., 2021; Zhang et al., 2021b). Аналогичные изменения в микробном компоненте экосистем вызывают и другие синтетические полимерные материалы (Журина и соавт., 2022). Таким образом, наши исследования показывают, что отходы ВПС не являются инертными для микробного сообщества, и контакт с ними приводит к существенным перестройкам его структуры.

Микробные сообщества, благодаря лабильному метаболизму, представляют собой ключевой элемент механизма эффективного самоочищения окружающей среды от ксенобиотиков, представленных сложными органическими веществами. Деструкция может выражаться в трансформации, фрагментации и полной минерализации загрязнителя. Внесение полимерных загрязнителей-ксенобиотиков и попадание интермедиатов их деструкции в окружающую среду может приводить к сдвигам в составе и функционировании микробных сообществ, что отразится на экосистеме в целом. Показано, что присутствие отходов ВПС не является безразличным для анаэробного микробного сообщества. В разных донорно-акцепторных условиях наличие отходов из этого пластика приводит к увеличению выделения газов, образования белка и летучих жирных кислот, снижению рН среды и сукцессии сообщества со сменой доминирующих групп и увеличением доли метаногенных архей. Обнаруженные изменения поверхности образца ВПС, появление микрочастиц и различия в составе промежуточных и конечных продуктов метаболизма сообщества могут свидетельствовать о медленной частичной деструкции этого вида отходов. Однако поскольку для опытов были взяты отходы бытового ВПС, то есть вероятность, что наряду с полимером полистирола деградации подвергаются и входящие в его состав наполнители (пластификаторы, красители и т.д.). Способность микроорганизмов к деструкции самого полистирола требует дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследования методом СЭМ были проведены с использованием оборудования ЦКП “Электронная микроскопия в науках о жизни” МГУ им. М.В. Ломоносова (УНУ “Трехмерная электронная микроскопия и спектроскопия”).

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование выполнено в рамках научного проекта государственного задания МГУ № 121032300094-7.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

L. Shirinkina

Moscow State University

编辑信件的主要联系方式.
Email: pro100tilka@gmail.com
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

Y. Taktarova

Moscow State University

Email: pro100tilka@gmail.com
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

M. Gladchenko

Moscow State University

Email: pro100tilka@gmail.com
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

A. Merkel

Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: pro100tilka@gmail.com

Winogradsky Institute of Microbiology

俄罗斯联邦, 119071, Moscow

I. Kotova

Moscow State University

Email: pro100tilka@gmail.com
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

参考

补充文件