Влияние излучения терагерцового диапазона на транспортные свойства альбумина: связывание с ионами металлов

Полный текст

Введение

В терагерцовом диапазоне частот (0.1–10 ТГц) кванты электромагнитного излучения не обладают энергией достаточной для того, чтобы вызывать разрывы валентных и даже слабых водородных связей. Известно, что к этой области спектра относятся частоты коллективных колебательно-вращательных переходов в молекулах многих биополимеров. Поэтому можно предполагать, что влияние излучения терагерцового диапазона (далее — ТГц-излучение) на биологические системы, многочисленные примеры которого описаны в литературе на уровне клеточных культур [1] и целых организмов [2, 3], на молекулярном уровне основано именно на инициировании конформационных изменений, связанных с такими колебательно-вращательными переходами [4]. Могут ли эти конформационные изменения иметь какие-либо химические последствия? Фундаментального запрета в этом случае нет: например, известно, что энергии магнитного поля недостаточно для разрыва химических связей, хотя под его влиянием становятся возможными некоторые взаимодействия, которые в отсутствие магнитного поля невозможны вследствие спиновых запретов.

Для непосредственного наблюдения химических последствий конформационных переходов под действием ТГц-излучения могла бы подойти, например, система, в которой химическим процессам предшествует стерически затрудненное адсорбционное взаимодействие, так что индуцируемое излучением изменение конформаций приводит к усилению или ослаблению стерических затруднений с соответствующим ускорением или замедлением процесса в целом. Экспериментальные трудности в исследовании таких систем связаны с необходимостью доказательства нетермической природы воздействия или, наоборот, выявления термического фактора, что часто бывает сопряжено с невысокой статистической достоверностью. О проблемах воспроизводимости, достоверности результатов в этой области и возможных путях решения этих проблем недавно высказались в обзорной статье авторы работы [5].

Необходимость применения в биомедицинских исследованиях не постоянного, а импульсного ТГц-излучения, причем в форме ультракоротких импульсов (до пикосекунд), связана с возможностью избежать в этом случае термических эффектов. Например, авторы работы [6] описали нетермические эффекты, связанные с экстремально большими амплитудами электрического поля, при исследовании воздействия высокоинтенсивного ТГц-излучения на фибробласты человеческой кожи. Доказательства нетермической природы эффектов, наблюдавшихся в исследовании действия ТГц-излучения на биологические объекты, в том числе на культуры клеток человека, представлены также в работах [7, 8].

Между тем исследования в области медицинских применений ТГц-излучения, в частности в диагностике рака [9–11], детектировании биомолекул [12, 13], распознавании вирусов [14] продолжают развиваться независимо от исследований молекулярной природы наблюдаемых эффектов. Параллельно с биомедицинскими исследованиями идет изучение структурных изменений в биомолекулах под действием ТГц-излучения, например, недавно авторами работы [15] были описаны изменения структуры растворов белков, в работе [16] изучено влияние облучения на связывание белков, авторы работы [17] исследовали водородные связи при помощи спектроскопии в терагерцовом диапазоне. Ранее при исследовании молекулярных механизмов взаимодействия ТГц-излучения с биополимерами на примере альбумина нами было обнаружено, что под действием излучения происходит усиление адсорбции молекулярного кислорода и ослабление адсорбции оксида азота NO на молекулах бычьего сывороточного альбумина (БСА) [18]. Биологическое значение адсорбции разнообразных веществ на молекулах альбумина заключается в том, что этот механизм обеспечивает одну из важнейших функций альбумина в организме — транспортную. Цели нового исследования — выявить влияние ТГц-излучения на возможность образования кластеров молекулами БСА, разработать методические подходы к исследованию изменения связывания ионов металлов с БСА под действием ТГц-излучения, изучить влияние облучения на транспортные свойства альбумина по отношению к ионам металлов.

Материалы и методы

В исследовании применялись реагенты квалификации “х.ч.”: метанол и ацетонитрил (элюенты для хроматографии), трифторуксусная кислота (реагент для ион-парной хроматографии), нитраты кобальта и никеля, нитрат кадмия (соли перед приготовлением растворов дополнительно очищали методом перекристаллизации).

Исследование проводили с лиофилизированными препаратами БСА (Sigma-Aldrich, USA). В качестве образцов для облучения использовали пленочные препараты, которые готовили из раствора БСА в дистиллированной воде с концентрацией 1 мг/мл. На подложки из кристаллического кварца наносили каплю (50 мкл). Затем с помощью покровного стекла равномерно распределяли нанесенную каплю по поверхности подложки и высушивали образец в потоке воздуха при комнатной температуре в течение 1 ч и влажности не выше 40%. Для каждого измерения готовили два идентичных образца: облучаемый и контрольный (необлучаемый). Образцы хранили в эксикаторе над безводным силикагелем.

Облучение приготовленных образцов проводили с использованием установки, показанной на рис. 1 и описанной ранее в работе [18]. Подложку с экспериментальным образцом помещали в фокус ТГц-излучения, как показано на рис. 1, при этом контрольный образец находился в открытом контейнере рядом, но вне зоны облучения. Облучение проводилось в диапазоне частот 0.3–1.5 ТГц в импульсном режиме (частота следования импульсов — 80 МГц, пиковая мощность <20 мВт, длительность импульса — 3 пс). Температура образца во время облучения составляла 21 ±1 °С, время облучения — 60 мин.

 

Рис. 1. Схема установки для облучения пленочных образцов БСА. Для генерации и детектирования ТГц-излучения используются импульсы второй гармоники волоконного эрбиевого лазера (длина волны излучения — 775 нм, длительность импульса — 130 фс, частота следования импульсов — 77 МГц, средняя мощность — 80 мВт). Для преобразования лазерного излучения в ТГц-излучение используется фотопроводящая антенна с арсенидом галлия. Система регистрации состоит из кристалла-детектора ZnTe ориентации (110) толщиной 1 мм, четвертьволновой пластинки, призмы Волластона, фотодиодов, операционного усилителя (ОУ) и синхронного детектора.

 

Спектры ЭПР записывали в стандартной плоской кварцевой ампуле для водных растворов на спектрометре серии EMX (Bruker, Germany): амплитуда модуляции Germany — 1 Гс, микроволновая мощность — не более 10 мВт, постоянная времени — 0.2 с, усиление — до 5.6 · 10⁵, скорость развертки — 100 Гс/200 с. Точность определения констант сверхтонкого расщепления составляла 0.03 Гс, g-фактор измеряли с точностью до 10^–4. Количественные оценки содержания парамагнитных частиц в растворе проводили с помощью внешнего стандарта интенсивности (кристалл дифенилпикрилгидразида, прикрепленный снаружи к плоской кварцевой ампуле).

Хроматографическое исследование проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа модели Милихром А-02 (Эконова, Новосибирск) с детектором по УФ-поглощению в интервале длин волн 200–360 нм. Детектирование осуществляли в режиме записи спектра поглощения на вершине хроматографического пика с целью одновременного получения спектрофотометрической информации. Использовалась стандартная хроматографическая колонка длиной 75 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом ProntoSil C18 (5 мкм). Колонку термостатировали при 35 °С. Хроматограммы записывали в градиентном режиме (вода с метанолом — от 0 до 20%) и в режиме ион-парной хроматографии в элюенте ацетонитрил/вода (1 : 3 по объему) с трифторуксусной кислотой (0.1 мас. %). Градиентный режим использовался для идентификации кластеров БСА, в котором молекулы удерживались вместе за счет межмолекулярного связывания через азотсодержащие группы. Условия проведения хроматографического исследования: объем пробы, вводимой в хроматограф, — 20 мкл, скорость элюирования — 150 мкл/мин, детектирование — на длинах волн 210 и 276 нм. Хроматограммы обрабатывали с помощью программы АльфаСпектр (Эконова, Новосибирск). Структуру реакционных центров БСА при взаимодействии с ионами металлов и энергетические выигрыши при образовании комплексов с ионами металлов рассчитывали с использованием полуэмпирических методов MNDO, PM3, AM1, и метода молекулярной механики ММ2 с помощью программы CS Chem 3D Pro версия 5.0 (Cambridge Soft Corp., UK).

Результаты и их обсуждение

ЭПР-спектроскопия

Ранее нами было показано, что молекулярный кислород взаимодействует с адсорбционными центрами молекулы БСА, причем степень адсорбции различна для облученных и необлученных образцов [18]. Чтобы установить другие возможные взаимодействия, протекающие в водном растворе БСА, было проведено исследование этого раствора методами ЭПР и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образование кластеров молекул БСА соответствовало появлению в ЭПР-спектрах сигнала малой интенсивности в виде триплета с константой сверхтонкого взаимодействия (СТВ) а_N = 0.94 мТл, причем этот сигнал виден на фоне более интенсивного сигнала триплетной формы с а_N = 1.47 мТл, который характеризует парамагнитные центры в молекуле БСА в данных условиях. Поскольку значение константы СТВ в сигнале малой интенсивности существенно меньше, чем значение СТВ основного интенсивного сигнала, можно предположить, что структурные изменения при образовании кластера затрагивают атомы азота, так как появление сигнала триплетной формы в ЭПР-спектре связано с взаимодействием неспаренного электрона с ядром атома азота.

В ЭПР-спектре образца БСА ширина линии интенсивного триплета больше у облученного образца по сравнению с необлученным, а ширина линии сигнала малой интенсивности, наоборот, меньше у облученного образца. Известно, что в ЭПР-спектрах ширина линии увеличивается с уменьшением подвижности парамагнитного центра, а с увеличением подвижности, наоборот, ширина линии уменьшается за счет более эффективного усреднения. Таким образом, результаты ЭПР-исследования показывают, что подвижность парамагнитных центров, отвечающих за сильный и слабый сигналы, соответственно уменьшается и увеличивается под действием облучения в терагерцовом диапазоне частот.

Поскольку кислород эффективно связывается с адсорбционными центрами в молекуле БСА, было проведено исследование зависимости процесса образования димеров от содержания кислорода в растворе. Кислород удаляли, пропуская аргон через раствор БСА в течение 30 мин. В определенные моменты времени по мере удаления кислорода его содержание в растворе определяли методом иодометрического титрования. Интенсивности ЭПР-сигналов, относящихся к образованию димеров, сопоставляли с содержанием кислорода в растворе для облученных и необлученных образцов БСА. Зависимость интегральной интенсивности триплетного сигнала малой интенсивности от содержания кислорода показана на рис. 2. Из этого рисунка видно, что при низком содержании кислорода интегральная интенсивность этого сигнала у облученных образцов в 2.4 раза выше, чем у необлученных, а при высоком содержании кислорода, наоборот, у облученных образцов интенсивность триплетного сигнала малой интенсивности ниже, чем у необлученных.

 

Рис. 2. Зависимость интегральной интенсивности триплетного сигнала малой интенсивности, связанного с кластерами БСА, от содержания кислорода в растворе по данным ЭПР-спектроскопии: кружки — облученный образец, квадраты — необлученный.

 

Хроматография

Для проверки предположения о том, что сигнал малой интенсивности связан с образованием кластеров молекул БСА, было проведено хроматографическое исследование растворов БСА в зависимости от содержания кислорода в них. На хроматограммах присутствовали два пика, отличающиеся интенсивностью и временами удерживания, но характеризующиеся одинаковыми спектрами поглощения. При разбавлении раствора наблюдалось возрастание интенсивности первого пика (время удерживания — 16.6 мин) и убывание интенсивности второго (время удерживания — 24.2 мин). Этот факт косвенно подтверждает предположение о существовании в растворе БСА димеров, основанное на данных ЭПР-спектроскопии. Кривая зависимости содержания димеров от концентрации кислорода по данным хроматографических исследований облученного и необлученного образцов БСА представлена на рис. 3. Сравнение с кривыми, приведенными на рис. 2, показывает, что результаты, полученные методом ВЭЖХ, качественно соответствуют данным ЭПР-спектроскопии.

 

Рис. 3. Зависимость содержания димеров БСА (относительно их содержания в необлученном растворе с максимальным содержанием кислорода) от концентрации кислорода в растворе по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии: кружки — облученный образец, квадраты — необлученный.

 

Образование комплексов с ионами металлов

В функции альбумина в организме входит транспорт ферментов, содержащих ионы металлов, а также перенос ионов прежде всего кальция магния, меди. В последнее время интерес исследователей к процессам переноса металлов альбуминами связан в основном с медицинскими применениями таких систем. Например, связывание альбумина с некоторыми металлами, используемыми в терапевтических целях, исследовано в работе [19]. Было показано, что присутствие ионов металлов в системе оказывает существенное влияние на транспортные возможности альбумина по отношению к лекарственным веществам [20, 21]. Роли металлов в процессах агрегации молекул человеческого сывороточного альбумина посвящена работа [22]. В литературе пока нет данных о том, влияет ли облучение альбумина в терагерцовом диапазоне частот на изменение связывания этого белка с ионами металлов, хотя ответ на этот вопрос мог бы открыть еще один путь к пониманию природы конформационного перехода, вызываемого в молекуле БСА ТГц-излучением.

Для разработки методического подхода к изучению изменений в прочности связывания ионов металлов с белковыми молекулами нами были выбраны высокотоксичный кадмий и биологически значимые металлы — кобальт и никель, комплексы которых можно изучать как методом хроматографии, так и с помощью спектроскопии ЭПР. Как показано выше, сопоставление результатов, полученных для одной и той же системы независимо двумя разными методами, позволяет делать более обоснованные выводы, чем в случае применения только одного из этих методов. Растворы, содержащие нитраты металлов в концентрации 5 ммоль/л, использовали для комплексообразования с облученными и необлученными образцами БСА. В качестве раствора сравнения применяли раствор нитрата натрия, что позволило учесть эффект присутствия аниона NO₃^–, исключив при этом мешающее влияние катиона, так как натрий не участвует в комплексообразовании с БСА из-за отсутствия d-орбиталей. Растворы готовили для исследования, удаляя из них растворенный кислород с помощью продувки аргоном.

Степень связывания ионов кобальта и никеля с БСА определяли по изменениям параметров спектров ЭПР этих ионов (количество линий, их ширина, величина g-фактора). Для подтверждения полученных результатов проводили хроматографическое исследование в режиме спектрофотометрии на вершинах пиков. В случае кадмия, который не детектируется методом ЭПР, проведено только хроматографическое изучение. Было обнаружено, что для Ni²⁺ и Co²⁺ степени связывания ионов металлов с облученным образцом БСА заметно выше, чем с необлученным, тогда как степень связывания иона кадмия практически не изменилась. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Для сравнения в таблице также приведены значения ионных радиусов, взятых из работы [23]. Результаты не показывают ни прямой, ни обратной корреляции степени связывания с ионным радиусом: кобальт, занимая промежуточное положение между никелем и кадмием по величине ионного радиуса, связывается с БСА в наибольшей степени, тогда как степень связывания меньшего по размеру иона никеля существенно ниже, чем у кобальта. Самая низкая степень связывания у кадмия, обладающего наибольшим ионным радиусом. Для никеля и кобальта степени связывания с облученным образцом БСА достоверно выше, чем с необлученным, тогда как для кадмия в обоих случаях получены примерно одинаковые значения. Таким образом, различия в связывании ионов никеля, кобальта и кадмия с БСА не удается однозначно объяснить разницей их геометрических параметров.

 

Таблица 1. Степени связывания (α, %) ионов металлов с облученным и необлученным образцами БСА

Параметр	Значения параметров
	Co2+	Ni2+	Cd2+
Ионный радиус, нм*	0.074	0.069	0.095
a, с облученным образцом БСА	17.5 ± 0.4	12.6 ± 0.4	1.8 ± 0.3
a, с необлученным образцом БСА	11.3 ± 0.3	9.8 ± 0.2	1.7 ± 0.2

* Данные взяты из работы [23].

 

Моделирование взаимодействия ионов никеля, кобальта и кадмия с функциональными группами БСА

Для выяснения механизмов, лежащих в основе зарегистрированных изменений степени связывания ионов металлов с облученным и необлученным образцами БСА проведено моделирование с использованием полуэмпирических методов и метода молекулярной механики. Рассчитывали величину изменения энергии при сближении иона металла с функциональной группой. В расчете учитывались не более 18 ближайших атомов фрагмента БСА. Результаты расчета показали, что ионы никеля и кобальта связываются с молекулой БСА посредством связей –С=О карбоксильных групп БСА, а также гидроксильных (–ОН) и тиольных (–SH) групп, тогда как связывание кадмия обеспечивают в основном карбонильные группы –С=О в b-положении к кольцевым структурам. Также анализ полученных результатов позволяет предполагать, что ионы металлов не являются прямыми конкурентами за адсорбционные центры с молекулярным кислородом, который, как было показано ранее [18], адсорбируется в основном на тиольных и дисульфидных группах, а также на пролиновом фрагменте. Ионы металлов также не конкурируют за позиции в процессе образования кластеров БСА (расчет проводили только для димеризации).

Согласно результатам расчетов, в присутствии кислорода образование димера происходит за счет связей двух тиольных групп разных молекул БСА через молекулу кислорода (–SH---O₂---HS–), а при низком содержании кислорода в растворе две молекулы БСА удерживаются в димере в основном дисульфидными связями, при этом небольшой вклад (около 15% по энергии) вносят взаимодействия атома азота гетероцикла одной из молекул БСА с гидроксильным атомом другой молекулы. Таким образом, можно предположить на основании результатов расчета, что конформационный переход под действием облучения в терагерцовой области снимает стерическое затруднение для адсорбции кислорода, а удаление кислорода из раствора освобождает адсорбционные центры для межмолекулярного взаимодействия, благодаря которому образуются димеры. Для изучения роли ионов металлов в агрегации молекул БСА и для выявления влияния облучения в терагерцовом диапазоне частот на конформационные изменения молекул требуются дальнейшие исследования, в том числе получение концентрационных зависимостей процессов, изученных в данной работе.

Заключение

Облучение пленочных препаратов бычьего сывороточного альбумина в терагерцовом диапазоне частот приводит к изменениям транспортных свойств белка: увеличивается подвижность парамагнитных центров, участвующих в межмолекулярных взаимодействиях с образованием димеров БСА, и возрастает содержание димеров. При низком содержании кислорода концентрация димеров в необлученных образцах возрастает на 30% по сравнению с образцами, содержащими кислород, а в облученных образцах концентрация димеров возрастает более чем в три раза. Впервые с использованием методов ЭПР-спектроскопии и ВЭЖХ обнаружены различия в степени связывания ионов кобальта и никеля с молекулами БСА, но для кадмия различий не обнаружено. Моделирование взаимодействий полуэмпирическими методами и методом молекулярной механики показало, что ионы Ni²⁺ и Co²⁺ связываются с молекулой БСА через ее –С=О связи в карбоксильных группах, а также через –ОН и –SH-группы, тогда как связывание кадмия обеспечивают в основном карбонильные группы –С=О в b-положении к кольцевым структурам.

Авторы благодарят Н.А. Николаева и Центр коллективного пользования “Спектроскопия и оптика” Института автоматики и электрометрии СО РАН за предоставленный источник ТГц-излучения.

Исследования выполнены при частичной поддержке Министерством науки и высшего образования РФ в рамках госзадания ИЛФ СО РАН (тема № АААА-А17-117030310290-5).

Об авторах

Е. Ф. Немова

Институт лазерной физики Сибирского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: endy.endy@gmail.com
Россия, Новосибирск

Т. В. Кобзева

Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук

Email: endy.endy@gmail.com
Россия, Новосибирск

Г. Г. Дульцева

Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук

Email: endy.endy@gmail.com
Россия, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы