Photonics of bilirubin – biologically important molecule (Review)

全文:

1. ВВЕДЕНИЕ

Среди молекулярных компонентов организма важную роль играет билирубин (БР) — пигмент желчи человека и животных, окрашенный в желтый цвет и проявляющий фотохимическую активность (рис. 1). Билирубин является конечным продуктом метаболизма гем-содержащих белковых молекул — гемоглобина, миоглобина, некоторых ферментов; он практически не растворим в воде. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы c участием гемоксигеназы-1 (НО-1) гем расщепляется до СО, Fe²⁺ и биливердина. Под действием биливердинредуктазы биливердин восстанавливается до БР (так называемый неконъюгированный или непрямой БР). Билирубин обладает высокой токсичностью и, поступая в кровеносное русло, образует комплекс с сывороточным альбумином, что делает его нетоксичным. Этот комплекс транспортируется в клетки печени, где БР связывается с глюкуроновой кислотой с образованием растворимого прямого (или конъюгированного) БР. Затем прямой БР из печени поступает в желчные капилляры и через кишечник выводится из организма [1–6].

 

Рис. 1. Структура молекулы БР.

 

Особое значение имеет изучение фотоники (фотофизики и фотохимии) БР. Молекула БР способна участвовать в сверхбыстрых процессах фотоизомеризации и других важных фотопроцессах; кроме того, она содержит два дипиррометеноновых хромофора, которые могут взаимодействовать между собой посредством экситонной связи, зависящей от геометрии молекулы [7–10]. Практический интерес к фотохимии БР вызван широким распространением метода фототерапии желтухи новорожденных, основанном на фотохимических реакциях БР при освещении кожных покровов новорожденных, страдающих неонатальной гипербилирубинемией (высоким уровнем БР в организме) [9–11]. В настоящем обзоре рассмотрены элементарные фотофизические и фотохимические процессы с участием БР, а также фотохимические реакции БР в фототерапии неонатальной гипербилирубинемии (ФНГ).

2. ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ И ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИЛИРУБИНА

Данные литературы указывают на то, что БР в растворе обладает изогнутой конформацией, имеющей Z-конфигурацию относительно двойных связей 4–5 и 15–16 (4Z, 15Z-изомер, обозначаемый как 4Z, 15Z-билирубин-IXα), стабилизированную внутримолекулярными водород-ными связями (рис. 2). Такую конформацию БР имеет и в комплексе с сывороточным альбумином человека (САЧ) [8, 11, 12].

 

Рис. 2. Структура Z,Z-конформации БР – 4Z,15Z-билирубина-IXα. Штриховыми линиями показаны внутримолекулярные водородные связи, стабилизирующие Z,Z-конформацию. Стрелки указывают на двойные связи 4–5 и 15–16, относительно которых происходит фотоизомеризация БР.

 

Спектр поглощения БР в комплексе с САЧ представляет собой широкую полосу, простирающуюся от 350 до 530 нм с максимумом около 460 нм; в отсутствие САЧ (в буфере) спектр (с максимумом при 443 нм) несколько уширяется [11–13]. Квантовый выход флуоресценции БР в комплексе с САЧ Φ_f = 0.003; в отсутствие САЧ он резко уменьшается (Φ_f < 2 × 10^–5). Положение максимума флуоресценции комплекса БР–САЧ несколько зависит от длины волны возбуждения и лежит в области 520–526 нм при возбуждении длины волны λ = 420–470 нм. Квантовый выход интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние для БР в комплексе с САЧ Φ_T < 0.01 [7]. Низкие выходы флуоресценции указывают на сверхбыструю безызлучательную дезактивацию электронно-возбужденного состояния БР, к которой относится фотоизомеризация в результате поворота относительно одной из двойных связей молекулы БР – 4–5 или 15–16 (Z → E-изомеризация, схема):

$\begin{array}{c}4Z\mathrm{,15}Z-\text{БР\hspace{0.33em}}\underset{h}{\overset{h}{\rightleftarrows }}\\ \underset{h}{\overset{h}{\rightleftarrows }}4Z\mathrm{,15}E-\text{БР }\mathit{\text{или}}4E\mathrm{,15}Z-\mathrm{БР}.\end{array}$ (1)

При этом САЧ стабилизирует 4Z,15E–изомер в комплексе с БР. Квантовый выход 4Z,15E-изомера для комплекса БР–САЧ Φ_i = 0.20 при фотовозбуждении светом с λ = 465 нм [14] (по более поздним данным, Φ_i = 0.10 при λ = 458 нм, причем с ростом длины волны света Φ_i уменьшается, а соотношение [4E,15Z]/[4Z,15E] возрастает [10]). Наряду с фотоизомеризацией, происходит быстрая диссипация энергии возбуждения путем безызлучательного перехода (внутренней конверсии) в исходный изомер БР [7]. Квантовый выход других продуктов фотопревращения БР – люмирубина (рис. 3), а также продуктов фотоокисления – гораздо ниже, чем 4Z,15E-изомера (суммарно < 0.008 [7], ~0.001 для люмирубина [15]). Хотя ряд конечных фотопродуктов имеют низкие квантовые выходы, их образование может быть существенно при проведении ФНГ [10].

 

Рис. 3. Структура люмирубина (циклобилирубина).

 

Первичные сверхбыстрые процессы безызлучательной дезактивации энергии электронного возбуждения в молекуле БР изучались методами с фемтосекундным временным разрешением [16–19]. В кинетике затухания флуоресценции было обнаружено наличие быстрого компонента со временем, равным ~120 фс, который был отнесен к процессу локализации экситона на одном из хромофоров – половинок молекулы. Более медленные компоненты в несколько сотен фемтосекунд и несколько пикосекунд отнесены к релаксации в “скрученный” промежуточный продукт, который далее переходил за время, равное ~15 пс в исходное состояние молекулы [15].

В работе [20] было показано, что дезактивация фотовозбужденного БР происходит через образование нефлуоресцирующего (dark) состояния, переходящего затем в течение 15 пс в исходное состояние. Предполагалось экситонное взаимодействие S₁-состояний экзо- и эндо-половинок молекулы БР, приводящее к расщеплению электронных уровней. При этом было обнаружено двухфотонное стимулирование второстепенного канала Z → E-изомеризации, которое, возможно, осуществляется через долгоживущий интермедиат.

Различные интермедиаты сверхбыстрой деградации фотовозбужденного БР были охарактеризованы с использованием вычислительных методов. Результаты расчетов хорошо согласуются с экспериментальными данными из литературных источников [21].

В недавней работе с использованием фемтосекундной спектроскопии комбинационного рассеяния и квантово-химических расчетов была изучена динамика сверхбыстрой фотоизомеризации БР [22]. Результаты исследования показали, что при фотовозбуждении вначале происходит сверхбыстрая конфигурационная изомеризация с сохранением объема (механизм “hula-twist”) за время, равное ~300 фс, после чего следует искажение внутримолекулярных водородных связей и крупномасштабный поворот двух дипирриноновых половин изомера Z,Z-БР за несколько пикосекунд. После этого большая часть молекул возвращается обратно в Z,Z-БР, и только очень небольшая доля превращается в стабильные изомеры БР путем изомеризации.

Наряду с фотоизомеризацией, БР может также участвовать в реакциях фотосенсибилизированного окисления с участием триплетных молекул БР, сенсибилизирующих образование синглетного кислорода [23]. Реализация этих процессов была доказана экспериментально путем лазерного возбуждения БР и регистрации люминесценции синглетного кислорода [24]. Однако в связи с низким квантовым выходом БР в триплетное состояние выход продуктов фотоокисления БР мал по сравнению с выходом фотоизомеров [25].

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ БИЛИРУБИНА ПРИ ФОТОТЕРАПИИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ГИПЕРБИЛИРУБИНЕМИИ

Суть метода ФНГ заключается в воздействии на кожные покровы новорожденных с гипербилирубинемией (окрашивание кожи в желтый цвет из-за высокого уровня БР) светом различных длин волн (обычно синей или сине-зеленой области спектра), приводящим к уменьшению желтизны и выведению БР из организма [26]. Основные фотохимические реакции БР (исходный изомер обозначен как 4Z,15Z-БР-IXα), происходящие при ФНГ, показаны ниже:

$\begin{array}{c}4Z\mathrm{,15}E\text{-БР-IX}\alpha \underset{h\nu }{\overset{h\nu }{\rightleftarrows }}4Z\mathrm{,15}Z\text{-БР-IX}\alpha \underset{h\nu }{\overset{h\nu }{\rightleftarrows }}\\ \underset{h\nu }{\overset{h\nu }{\rightleftarrows }}4E\mathrm{,15}Z\text{-БР-}IX\alpha \stackrel{h\nu }{\to }4E\mathrm{,15}Z\text{-ЦБР-IX}\alpha ,\end{array}$

где ЦБР – циклобилирубин (люмирубин).

4E,15Z-ЦБР-IXα может также фотоизомеризоваться в 4E,15E-ЦБР-IXα [27].

Изомер билирубина 4Z,15E-билирубин-IXα является основным продуктом обратимых фотохимических реакций геометрической изомеризации, а 4E,15Z-циклобилирубин-IXα (4E,15Z-ЦБР-IXα, или Z-люмирубин, см. рис. 3) – основным продуктом необратимой реакции структурной фотоизомеризации (фотоциклизации). Образующиеся фотоизомеры растворимы в воде и легко выводятся из организма (в основном через печень и желчь). В то же время Z-люмирубин может в некоторых случаях полимеризоваться в темно-коричневое вещество, вызывающее синдром “бронзового ребенка” (повышенное производство бронзовых пигментов) – вредную побочную реакцию при фототерапии [3, 27].

Наряду с продуктами фотоизомеризации, при ФНГ обнаруживается образование продуктов фотоокисления БР (в частности, водорастворимых окисленных моно- и дипирролов, которые выводятся из организма главным образом через почки) [4]. В то же время есть мнение, что фотоокисление БР не вносит существенного вклада в фотопроцессы, происходящие при ФНГ, а продукты окисления БР образуются путем темновых реакций БР с активными формами кислорода, присутствующими в организме (в случае реакции переноса электрона – с образованием биливердина), что обусловливает его антиоксидантную активность [3].

Фототерапии неонатальной гипербилирубинемии посвящено большое число работ, и здесь мы остановимся только на некоторых из них. В ряде работ изучалось влияние параметров источника света (типа источника, длины волн, интенсивности и др.) на фототерапию. В работе [28] проводили сравнение действия фильтрованного солнечного света (λ = 400–900 нм) и интенсивного светодиодного облучения (λ = 420–530 нм) при фототерапии новорожденных с выраженной (от средней до высокой) степенью гипербилирубинемии. Авторами установлено, что не наблюдалось существенных различий в эффектах, вызванных действием солнечного света и светодиодного облучения. В то же время использование светодиодов позволяет, в частности, уменьшить тепловой эффект при достаточно высокой интенсивности облучения.

В некоторых исследованиях показано, что светодиодное излучение с длиной волны λ_max= 410 нм наиболее эффективно для фотоизомеризации 4Z,15Z-БР → 4Z,15E-БР. В то же время зеленый свет с λ_max ~ 510 нм производит больше люмирубина и меньше 4Z,15E-БР и идеален для ФНГ, поскольку коротковолновый свет в диапазоне длин волн 350–450 нм может оказывать вредное воздействие (в частности, иметь мутагенный эффект) [29–31].

В ряде работ сопоставлялась эффективность фототерапии светодиодными источниками синего и сине-зеленого света [32–36]. На животных моделях было обнаружено, что фототерапия смешанным фильтрованным синим (440–520 нм) и зеленым (490–590 нм) светом (50% синего и 50% зеленого света) примерно так же эффективна, как и фототерапия синим светом, но вызывает более низкий окислительный стресс [32]. Исследование на новорожденных показало, что светодиодный сине-зеленый свет диапазона 470–490 нм (λ_max = = 478 нм) на 31% более эффективен, чем синий свет диапазона 450–470 нм (λ_max = 459 нм) [35]. В настоящее время имеются рекомендации (в частности, в работе [37]), а также указание Американской академии педиатрии [38] использовать в ФНГ именно смешанный сине-зеленый свет.

В недавней работе [27] подробно анализируются результаты перехода от синего к сине-зеленому свету при светодиодной ФНГ. К положительным эффектам авторы относят уменьшение фотоокисления, гено/цитотоксичности, снижение риска развития рака и смертности у новорожденных с низкой массой тела. В то же время в организме под действием сине-зеленого света может снижаться уровень витамина B2 (рибофлавина) за счет фотоокисления. К тому же из-за усиленного образования люмирубина при сине-зеленом освещении может наблюдаться синдром “бронзового” ребенка у предрасположенных к этому новорожденных. Дальнейшее развитие метода ФНГ должно заключаться в оптимизации условий осуществления процесса (длины волны облучения, интенсивности света, времени и периодичности облучения и др.) с целью повышения эффективности выведения БР из организма при минимизации побочных эффектов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Билирубин представляет собой биомолекулу, играющую важную роль в процессах жизнедеятельности организма (в частности, являющуюся мощным антиоксидантом). Фотоника БР в настоящее время вызывает значительный научный и практический интерес. Исследование сверхбыстрых маршрутов фотопревращений БР позволяет выявить новые важные закономерности этих процессов, а изучение экситонного взаимодействия двух хромофоров в молекуле БР – его влияние на фотохимические свойства молекулы (в частности, объясняет зависимость флуоресценции от длины волны возбуждения). Фотохимические реакции БР используются в ФНГ, основанной на геометрической и структурной фотоизомеризации БР, а также его фотоокислении. Фототерапия неонатальной гипербилирубинемии дает возможность выведения избытка БР из организма путем воздействия на кожные покровы новорожденных, страдающих гипербилирубинемией. В настоящее время при ФНГ рекомендовано использовать светодиодное облучение сине-зеленого диапазона. Развитие метода ФНГ должно заключаться в дальнейшей оптимизации условий осуществления процесса с целью повышения эффективности выведения БР из организма при минимизации побочных эффектов.

Работа выполнена в рамках госзадания ИБХФ РАН (тема № 001201253314).

作者简介

A. Tatikolov

Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: tatikolov@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

I. Panova

International Scientific and Practical Center of Tissue Proliferation

Email: tatikolov@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件