Multiple mechanisms of allosteric regulation of the luteninizing hormone receptor

Texto integral

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОРОВ ГОНАДОТРОПИНОВ, КАК ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СУПЕРСЕМЕЙСТВА GPCR

Лютеинизирующий гормон (ЛГ) и хорионический гонадотропин (ХГ), которые вырабатываются аденогипофизом (ЛГ, гипофизарный ХГ) или эмбрионом и плацентой на ранних этапах беременности (ХГ), являются важнейшими компонентами ЛГ-зависимой сигнальной системы, вовлеченной в регуляцию репродуктивных функций. Они активируют рецептор ЛГ/ХГ (ЛГ/ХГ-Р), который относится к семейству G-белок-сопряженных рецепторов (GPCR) класса А, связываясь с его ортостерическим сайтом, локализованным в значительном по размеру эктодомене. Ортостерический сайт GPCR является мишенью для основного эндогенного лиганда этого рецептора и обычно характеризуется высокой аффинностью к нему. ЛГ и ХГ связываются с ЛГ/ХГ-Р с высокой аффинностью, вызывая широкий спектр физиологических ответов. Однако эффективность и специфичность активации внутриклеточных каскадов, а соответственно и вызываемый ЛГ и ХГ конечный ответ, могут существенно различаться [4, 22, 68, 80, 104, 105], и это имеет вполне определенный биологический смысл, учитывая различную физиологическую роль ЛГ и ХГ в организме человека и других млекопитающих. Каждый из гонадотропинов имеет большое число изоформ, что определяется особенностями их гликозилирования и приводит к разнообразному паттерну специфической активности, влияя на предвзятость сигнальной трансдукции [19, 28, 49, 50, 73, 133]. Клеточный ответ на ЛГ и ХГ может регулироваться на уровне ЛГ/ХГ-Р путем посттрансляционных модификаций рецептора и вследствие образования гомо- и гетероди (олиго)мерных рецепторных комплексов [23, 27, 41, 47, 70, 71, 75]. Гликозилирование ЛГ и ХГ и образование ЛГ/ХГ-Р-содержащих комплексов являются важнейшими процессами аллостерической регуляции активности ЛГ/ХГ-Р и всей ЛГ/ХГ-опосредуемой сигнальной трансдукции. При этом нельзя исключить и аллостерического влияния на нее липидного состава мембран, ионного и аминокислотного состава во внутри- и межклеточной средах, доступности и функциональной активности адаптерных белков, образующих комплексы с ЛГ/ХГ-Р. Так мембранные липиды – холестерин и фосфолипиды, некоторые ионы (Na⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Cl^- и другие), аминокислоты и их производные (Tyr, Phy, Trp, Leu, Ile, гомоцистеин, агматин и др.) и некоторые адаптерные белки могут функционировать как аллостерические регуляторы GPCR [110]. Однако прямые доказательства их участия в контроле активности ЛГ/ХГ-Р в настоящее время отсутствуют. Кроме того, в качестве эндогенных аллостерических регуляторов ЛГ/ХГ-Р могут выступать аутоантитела к гонадотропинам с ЛГ-активностью и к ЛГ/ХГ-Р [72].

Существуют различные аллостерические механизмы регуляции ЛГ/ХГ-Р, что указывает на возможность тонкой настройки эффективности и селективности ЛГ/ХГ-индуцированной сигнальной трансдукции. Эта настройка зависит от физиологического статуса клетки, паттерна гликоформ ЛГ и ХГ, состава и соотношения ЛГ/ХГ-Р-содержащих комплексов, активности других сигнальных каскадов, модулирующих активность ЛГ/ХГ-Р, а также от выработки аутоантител к гонадотропинам и ЛГ/ХГ-Р. Такое многообразие аллостерических влияний предопределено существованием большого числа аллостерических сайтов в ЛГ/ХГ-Р, как это показано и для других GPCR класса А. Эти сайты могут быть локализованы во внеклеточных петлях и внешнем входе в трансмембранный тоннель, во внутренней полости этого тоннеля, на внешней поверхности трансмембранного домена (ТМД), граничащей с липидным бислоем мембраны, в цитоплазматических петлях и в области внутриклеточного входа в трансмембранный тоннель [110]. Аллостерические сайты, как правило, не столь специфичны к лигандам, как ортостерический сайт, и имеют более низкую аффинность к ним. Наряду с этим связывание с ними лигандов направлено в основном на модуляцию конститутивной или активированной ортостерическим агонистом активности GPCR, в то время как собственные эффекты таких лигандов выражены слабо и отчетливо выявляются только при использовании специально разработанных синтетических регуляторов с повышенным сродством к аллостерическим сайтам GPCR.

Соответственно, появляется возможность разработки сайт-специфичных аллостерических лигандов, которые будут наделены различным профилем фармакологической активности. В случае ЛГ/ХГ-Р они могут выступать в качестве модуляторов эффектов гонадотропина или иметь собственную агонистическую или антагонистическую активность. Как известно, аллостерические регуляторы могут снижать (негативный аллостерический модулятор, NAM) или повышать (положительный аллостерический модулятор, PAM) сродство и эффективность ортостерического агониста, модулировать другие аллостерические эффекты (“молчащий” аллостерический модулятор, SAM), проявлять собственную активность полного или инверсионного агониста и нейтрального антагониста в отсутствие ортостерического агониста, совмещать активность полного агониста и антагониста с активностью PAM (аго-PAM, PAM-антагонист) или NAM (аго-NAM) [110, 143, 145]. Поскольку аллостерические сайты взаимодействуют не только с ортостерическим сайтом, но и между собой, то профиль активности аллостерического лиганда может быть сложным и не описываться в терминах предложенной классификации, что справедливо и для некоторых аллостерических регуляторов ЛГ/ХГ-Р. В дополнение к этому, с учетом множественности сигнальных каскадов, активируемых ортостерическими агонистами, некоторые аллостерические модуляторы могут избирательно усиливать или, напротив, ослаблять только один такой каскад, что приводит к предпочтительной активации определенного сигнального пути и обеспечивает предвзятый агонизм ортостерического агониста, используемого в комбинации с таким модулятором. Такие аллостерические лиганды относят к группе предвзятых или «смещенных» аллостерических модуляторов (BAM) [115, 145].

Настоящий обзор посвящен анализу и обсуждению роли в сигнальной трансдукции гликозилирования ЛГ и ХГ, комплексообразования ЛГ/ХГ-Р, в том числе его гетеродимеризации с рецептором фолликулостимулирующего гормона (ФСГ-Р), вкладу этих процессов в контроль активности ЛГ/ХГ-Р и в развитие репродуктивных дисфункций. В обзоре рассмотрены современные достижения в разработке низкомолекулярных аллостерических регуляторов ЛГ/ХГ-Р, взаимодействующих с трансмембранными и цитоплазматическими сайтами рецептора. Перед рассмотрением аллостерических механизмов дана краткая характеристика ЛГ и ХГ, ЛГ/ХГ-Р и их сигнальных систем.

СТРУКТУРА ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩЕГО ГОРМОНА И ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

ЛГ и ХГ представляют собой αβ-гетеродимеры с молекулярной массой около 30 кДа. Секреция ЛГ осуществляется гонадотрофами аденогипофиза и контролируется гипоталамическим рилизинг-фактором гонадолиберином и опосредованно множеством полипептидных факторов, стероидными гормонами, цитокинами [44, 117]. Для ХГ человека (чХГ) известны гипофизарная форма, которая, подобно ЛГ, продуцируется гонадотрофами, плацентарная форма, секретируемая эмбрионом и плацентой в первом триместре беременности, и гипергликозилированная форма, экспрессируемая на ранних стадиях развития эмбриона и существенно отличающаяся от ЛГ и других чХГ [31, 95].

α-Субъединица кодируется одним геном и является общей для всех гонадотропинов. Она представляет собой полипептид длиной 116–120 аминокислотных остатков (АКО) и характеризуется высокой степенью гомологии первичной структуры. β-Субъединицы сильно различаются по первичной структуре и определяют типовую принадлежность гонадотропина. Высоко консервативными в β-субъединицах являются остатки цистеина, определяющие их пространственную организацию и ответственные за образование функционально активных αβ-гетерокомплексов. В 1990-е гг. была расшифрована 3D-структура гетеродимерной молекулы чХГ [74]. Важным структурообразующим компонентом α- и β-субъединиц гонадотропинов являются внутримолекулярные дисульфидные связи, которые соединяют удаленные друг от друга сегменты α- и β-субъединиц, благодаря чему те перекрещиваются между собой и формируют жесткую узловую структуру (cystine-knot). Цистиновые узлы локализованы в центральной части α- и β-субъединиц и стабилизируют исходящие из нее петли – L1, L2 и L3 [101]. В гетеродимере α- и β-субъединицы расположены симметрично по отношению друг к другу, имеют вытянутую форму и большое отношение площади поверхности к объему молекулы. Полипептид, соответствующий С-концевой области β-субъединицы, выходит за пределы скрепленной цистиновыми узлами центральной части молекулы и функционирует как “ремень безопасности”, оборачиваясь вокруг антипараллельных спиралей, формирующих L2-петлю α-субъединицы. Пространственная структура “ремня безопасности” стабилизируется внутримолекулярной S–S-связью, формируемой остатками цистеина, один из которых локализован в L1-петле β-субъединицы, другой – ближе к ее С-концу (в β-чХГ – Cys²⁶ и Cys¹¹⁰). Сегмент, формирующий центральную часть “ремня безопасности” β-субъединицы, определяет специфичность взаимодействия гонадотропина с ЛГ/ХГ-Р. В β-ЛГ и β-чХГ этот сегмент имеет суммарный положительный заряд, что предопределяет его взаимодействие с отрицательно заряженными сайтами ЛГ/ХГ-Р [101].

α- и β-Субъединицы подвергаются N-гликозилированию, поскольку содержат Asn-содержащие сайты, мишени N-гликозилтрансфераз, со структурой Lys-Asn-(Val/Ile) или (Glu/Tyr)-Asn-His [50]. В α-субъединице локализованы два таких сайта (Asn⁵², Asn⁷⁸), в β-субъединице – один (β-ЛГ, Asn³⁰) или два (β-чХГ, Asn¹³ и Asn³⁰) сайта. В β-субъединице ФСГ, как и в β-чХГ, также имеются два сайта для N-гликозилирования (рис. 1). С-концевое расширение β-чХГ включает четыре сайта для O-гликозилирования, где мишенями O-гликозилтрансфераз являются остатки Ser¹²¹, Ser¹²⁷, Ser¹³² и Ser¹³⁸ [49, 50]. Степень гликозилирования, локализация и структура N-гликанов (разветвленность, заряд) в α- и β-субъединицах вносят значительный вклад в специфичность образования ими гетеродимерных комплексов и в их устойчивость, а также определяют связывающие характеристики и эффективность гонадотропинов, предвзятость их сигналинга, влияют на их фармакокинетику [15, 49, 50].

 

Рис. 1. N- и O-гликозилирование субъединиц ЛГ и ХГ человека, а также представленного для сравнения ФСГ. Для α-ЛГ, α-ФСГ и α-ХГ представлены гликоформы α-субъединиц, характерные для молекул ЛГ, ФСГ и плацентарного чХГ. Во всех субъединицах показаны сайты для N-гликозилирования, а в β-субъединицах чХГ – также локализованные в С-концевой части молекул сайты для O-гликозилирования. Приведены наиболее типичные структуры N-гликанов, характерные для представленных гонадотропинов. В α- и β-субъединицах ЛГ и ХГ преобладают слаборазветвленные (гибридные и двухантенные) N-гликаны, причем в секретируемом гипофизом ЛГ больше сульфатированного N-ацетилгалактозамина (GalNAc), а в секретируемом плодом и плацентой чХГ превалируют остатки сиаловой кислоты. В α- и β-субъединицах ФСГ имеется значительное число более разветвленных (трех- и четырехантенных) N-гликанов, обогащенных сиаловой кислотой. Концевые остатки сиаловой кислоты обозначены незакрашенными квадратиками, концевые остатки сульфатированного GalNAc обозначены закрашенными кружочками.

 

Представителем необычной группы гонадотропинов с ЛГ-активностью является ХГ лошади (лХГ), который сочетает свойства ЛГ и ФСГ [76]. В отличие от чХГ β-субъединица лХГ имеет один сайт для N-гликозилирования (Asn¹³), но в С-концевой области содержит до 11-12 сайтов для O-гликозилирования, причем мишенями O-гликозилтранфераз являются остатки как серина (Ser¹¹⁸, Ser¹²³, Ser¹²⁸, Ser¹³⁰, Ser¹³⁷, Ser¹⁴⁰, Ser¹⁴¹ и Ser¹⁴⁹), так и треонина (Thr¹²⁷, Thr¹²⁹, Thr¹³¹ и Thr¹³³) [14]. Наряду с β-лХГ у лошади имеется β-субъединица ЛГ (лЛГ), которая также обладает двойной специфичностью, активируя ЛГ/ХГ-Р и ФСГР. Как и β-лХГ, β-лЛГ имеет до 11 сайтов для O-гликозилирования [20].

СТРУКТУРА РЕЦЕПТОРА ЛГ/ХГ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО СВЯЗЫВАНИЯ С ГОНАДОТРОПИНАМИ

ЛГ/ХГ-Р относится к классу А суперсемейства рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCR), и включен в группу δ родопсинового семейства, вместе с ФСГ-Р и рецептором тиреотропного гормона (ТТГ-Р). Гонадотропины связываются с высокоаффинным ортостерическим сайтом ЛГ/ХГ-Р, который сформирован значительным по размеру внеклеточным доменом, подобно тому, как это наблюдается в других рецепторах группы δ.

Экдомен ЛГ/ХГ-Р включает до 360 АКО и содержит два структурных субдомена. Первый включает девять повторяющихся участков, обогащенных лейцином (leucine-rich repeat, LRR), второй представляет собой шарнирную область, соединяющую LRR-субдомен с ТМД. Основными структурными элементами ТМД являются семь трансмембранных спиралей (ТМ), образующих трансмембранный тоннель. На N- и C-концах шарнирной области располагаются еще два LRR-сегмента, LRR10 и LRR11, между которыми локализованы α-спираль Pro²⁷²–Asn²⁸⁰ и протяженная петлеобразная структура [41]. На С-конце шарнирной области, в месте перехода эктодомена в ТМД, локализован участок P10 (Phe³⁵⁰–Tyr³⁵⁹). Шарнирная область осуществляет тонкую регуляцию связывания гонадотропинов с эктодоменом и обеспечивает передачу генерируемого ими сигнала к ТМД [41].

Поверхность чХГ содержит кластеры, обогащенные положительно заряженными АКО, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными АКО, формирующими лиганд-связывающую поверхность эктодомена ЛГ/ХГ-Р. Во взаимодействие с ЛГ/ХГ-Р вовлечены обе субъединицы чХГ. С-концевой сегмент 92–106 β-чХГ взаимодействует с остатками Arg⁵³, Ser⁵⁵, Ala⁵⁷ и Tyr⁵⁸ повтора LRR1 и с остатком Glu²⁰⁶ повтора LRR7, а остатки Val⁴⁶ и Gln⁴⁸ β-чХГ образуют контакты с остатками Gln²⁴⁶ и Arg²⁴⁷ повтора LRR10. Остатки Tyr⁸⁸, Tyr⁸⁹ и Ser⁹² α-субъединицы взаимодействуют с Tyr¹²⁷, Ile¹⁵², Lys¹⁸⁰ и Tyr¹⁸², локализованными в повторах LRR4–LRR6 ЛГ/ХГ-Р [41]. При связывании чХГ с рецептором конформационные изменения наблюдаются в четырех сегментах – в локализованном в β-чХГ участке, называемом “ремнем безопасности”, который отвечает за стабилизацию αβ-гетеродимера чХГ, а также в β-складчатых структурах, локализованных в β-чХГ (L2, L3) и α-чХГ (L3) [41, 138]. Несмотря на сходство “ремня безопасности” в β-чХГ и β-ЛГ, между их β-складчатыми структурами имеются существенные отличия, что влечет за собой различия в эффективности их взаимодействия с ЛГ/ХГ-Р и в способности активировать внутриклеточные каскады [41, 53].

Как и в других GPCR класса А, при активации ЛГ/ХГ-Р в ТМД меняется суперпозиция ТМ6 и взаимодействующих с ней ТМ5 и ТМ7. Изменение расположения TM и конфигурации внутренней полости ТМД является триггером конформационных изменений в G-белке, ассоциированном с цитоплазматическими петлями рецептора. Эти изменения способствуют ГДФ/ГТФ-обмену в Gα-субъединице G-белка и ослабляют ее ассоциацию с Gβγ-димером, что приводит к активации зависимых от G-белков внутриклеточных каскадов. При связывании чХГ с ЛГ/ХГ-Р наблюдается перемещение С-концевого сегмента спирали ТМ6 наружу, и это сопровождается небольшим смещением наружу спирали ТМ5 и сдвигу внутрь спирали ТМ7 [41]. Оценка расстояния между сегментами ТМ6 и ТМ7 показала, что при связывании ЛГ/ХГ-Р с чХГ расстояние между ними увеличивается как в области внешнего вестибюля ТМД, так и в центральной его части, и это сопровождается увеличением объема внутренней полости ТМД [57]. Расширение входа в трансмембранный тоннель происходит и при связывании небольших лигандов с ТМД большого числа GPCR [118]. Результатом увеличения объема внутренней полости ТМД и изменения суперпозиции образующих его ТМ является изменение конформации проксимальных к мембране цитоплазматических участков второй и третьей цитоплазматических петель (ICL2, ICL3) и цитоплазматического C-концевого домена рецептора. Эти участки содержат основные детерминанты, ответственные за взаимодействие с G-белками и β-аррестинами, играющими ключевую роль в ЛГ/ХГ-Р-опосредуемой сигнальной трансдукции.

В основе изменений суперпозиции TM при активации ЛГ/ХГ-Р гонадотропином лежит изменение взаимодействия между LRR-субдоменом и шарнирной областью эктодомена, с одной стороны, и ТМД, в первую очередь внеклеточными петлями (ECL), формирующими внешний вестибюль трансмембранного тоннеля с другой [57]. В отсутствие гормональной активации взаимодействие между LRR-субдоменом и ТМД обеспечивает нахождение последнего в неактивном состоянии. После связывания с гонадотропином взаимодействие LRR-субдомена с ТМД ослабляется, на что указывает увеличение расстояния между ними. LRR-субдомен переходит в вертикальное по отношению к ТМД положение. Шарнирная область, напротив, в результате ее вращения сближается с внеклеточным вестибюлем ТМД, одновременно удаляясь от LRR-субдомена [65]. При активации ЛГ/ХГ-Р расстояние между LRR-субдоменом и ТМД повышается с 60 до 88 ангстрем, в то время как расстояние между шарнирной областью и ТМД сокращается с 79 до 48 ангстрем [65]. Ключевую роль в ассоциации эктодомена и ТМД ЛГ/ХГ-Р играют взаимодействия между спиралью шарнирной области и спиралью, образуемой средней частью ECL1, а также взаимодействия между C-концевым сегментом P10 шарнирной области и внешним вестибюлем трансмембранного тоннеля, образованного внеклеточными окончаниями TM1, TM2 и TM7 [41, 57, 107]. Изменение характера этих взаимодействий при связывании ЛГ/ХГ-Р с гонадотропином влияет на взаимное расположение спиралей ТМ5, ТМ6 и ТМ7 и конформацию ТМД, что активирует внутриклеточный сигналинг.

Среди расположенных в эктодомене ЛГ/ХГ-Р детерминант, опосредующих его активацию ЛГ и ХГ, важную роль играет остаток Tyr³³¹, который подвергается сульфатированию и приобретает отрицательный заряд. Он расположен в середине шарнирной области и окружен отрицательно заряженными АКО, образуя кластер с высокой плотностью отрицательного заряда. Tyr³³¹ и соседние с ним Asp³³⁰ и Glu³³² электростатически взаимодействуют с положительно заряженными кластерами чХГ, контролируя взаимное расположение шарнирной области и ТМД. Их замены на другие АКО, нарушающие целостность анионного кластера, препятствуют взаимодействию с гонадотропином [33]. Другой важной детерминантой является Ser²⁷⁷, участвующий в формировании спирали Pro²⁷²–Asn²⁸⁰, локализованной в N-концевой части шарнирной области. Он опосредует взаимодействие этой спирали с ECL1 и модулирует устойчивость комплекса между эктодоменом и ТМД. Гидроксильная группа Ser²⁷⁷ способна образовывать водородную связь с Asn³⁵¹, расположенным в высококонсервативном участке P10 [41], который рассматривают как внутренний агонист ЛГ/ХГ-Р [17].

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ КАСКАДЫ, МИШЕНИ ЛГ И ЧХГ

Специфическое связывание αβ-гетеродимеров ЛГ и чХГ с внеклеточным доменом ЛГ/ХГ-Р индуцирует в нем изменения, результатом чего являются перестройки, затрагивающие шарнирную область и контактирующие с ней ECL2 и ECL3. Взаимное расположение и конформационная подвижность ECL2 и ECL3 непосредственно влияют на структуру ТМД и на взаимодействие ICL2, в особенности ICL3 c G-белками и β-аррестинами. Используя многоступенчатый механизм конформационных перестроек, гонадотропины регулируют внутриклеточные каскады как посредством активации G-белков, так и путем рекрутирования в комплекс с рецептором адаптерных и регуляторных белков, в первую очередь β-аррестинов. Встроенные в мембрану ЛГ/ХГ-Р способны образовывать как гомодимерные (гомоолигомерные), так и гетеродимерные (гетероолигомерные) комплексы с другими GPCR, в том числе с ФСГР, что оказыват существенное влияние на механизмы и избирательность сигнальной трансдукции. Важную роль играет трансактивация ЛГ/ХГ-Р, когда гормон связывается с одним из протомеров комплекса, а трансдукция сигнала к внутриклеточным белкам осуществляется через другой протомер, причем последний может быть протомером другого GPCR, например ФСГР.

Определяющую роль в реализации гонадотропинового сигналинга, реализуемого через ЛГ/ХГ-Р, играют два пути [27, 68, 104]: цАМФ-зависимый – ЛГ/ХГ-Р–G_s-белок–аденилатциклаза–цАМФ–протеинкиназа А (PKA)/факторы Epac-семейства, и фосфолипазный – ЛГ/ХГ-Р–G_q/11-белок–фосфолипаза Сβ (PLCβ)–диацилглицерин (DAG)/инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3)–протеинкиназа С (PKC)/кальциевый сигналинг. В клетках репродуктивной системы они участвуют в гонадотропин-индуцированной регуляции стероидогенеза, контроле пролиферации, ангиогенеза, апоптоза и других клеточных процессов. Cущественную роль играют и β-аррестиновые пути, через которые стимулируется каскад митогенактивируемых протеинкиназ (MAPK) и модулируется цАМФ-сигналинг. Предпочтительность выбора сигнального пути определяется соотношением активных конформаций рецептора, в которых он образует более прочный комплекс с определенным типом G-белка или β-аррестина. Различаются и молекулярные детерминанты, вовлеченные в формирование таких комплексов [26, 28, 101, 113]. Так, в рецепторе ЛГ/ХГ-Р за взаимодействие с G_s-белком в большей степени отвечает С-концевой участок третьей цитоплазматической петли, за взаимодействие с G_q/11-белком – его вторая цитоплазматическая петля, за взаимодействие с β-аррестинами – проксимальные к мембране участки С-хвостового домена, хотя в каждом случае связывающая поверхность может включать и другие сегменты цитоплазматических петель и их интерфейсов с ТМД. Немаловажную роль для селективности выбора G-белка играет образование рецепторных комплексов, в том числе гетерокомплексов ЛГ/ХГ-Р с ФСГ-Р [25] (рис. 2).

 

Рис. 2. Сигнальные пути, реализуемые через ЛГ/ХГ-Р, а также эндосомальный сигналинг, осуществляемый с участием гонадотропин-связанного ЛГ/ХГ-Р. Обозначения: ЛГ/ХГ-Р – рецептор ЛГ и чХГ; АЦ – аденилатциклаза; цАМФ – 3’-5’-циклический аденозинмонофосфат; PKA – протеинкиназа А; PDE4,7,8 – цАМФ-активируемые фосфодиэстеразы типов 4, 7 и 8; Epac1/2 – обменные белки типов 1 и 2, активируемые циклическим АМФ; G_s, G_i, G_q/11 – αβγ-гетеротримерные белки, стимулирующие (G_s) или ингибирующие (G_i) АЦ и активирующие кальциевый сигналинг (G_q/11); β-Арр – β-аррестин; ERK1/2 – киназы типов 1 и 2, регулируемые внеклеточными сигналами; PLCβ – фосфоинозитид-специфическая фосфолипаза Cβ; DAG – диацилглицерин; IP3 – инозитол-3,4,5-трифосфат; [Ca²⁺]_i – внутриклеточная концентрация Ca²⁺; PKC – форболчувствительные изоформы протеинкиназы С.

 

В случае цАМФ-зависимого пути G_s-опосредуемая активация АЦ гонадотропином приводит к синтезу цАМФ, вторичного посредника, который взаимодействует со специфичными к нему эффекторными белками, в первую очередь с PKA и факторами Epac-семейства. Основной мишенью PKA являются цАМФ-регулируемые транскрипционные факторы, в том числе фактор CREB, контролирующий экспрессию множества генов. Мишенями факторов Epac-семейства является как CREB [141], так и другие эффекторные белки, в том числе Ca²⁺-кальмодулин-зависимая протеинкиназа II (CaMKII) [96], фосфатидилинозитол-3-киназа [87], компоненты каскада MAPK [63]. Все это расширяет спектр их физиологических эффектов в ответ на стимуляцию цАМФ. Помимо эффекторных компонентов цАМФ-сигналинга, важную, а в ряде случаев и определяющую роль в его регуляции играют фосфодиэстеразы (PDE), вызывающие деградацию цАМФ, тем самым терминирующие передачу цАМФ-сигнала внутрь клетки, а также scaffold-белки, формирующие микродомены, обеспечивающие тесное взаимодействие между компонентами цАМФ-путей. При этом активность PDE может определяться многими факторами, среди которых степень активации АЦ и вызванное этим повышение уровня цАМФ в клетке (короткая отрицательная обратная связь), изменение кальциевого сигналинга и стимуляция форбол-чувствительных изоформ PKC, а также изменение паттерна и активности MAPK, в том числе индуцированных гонадотропинами. В клетках мужской и женской репродуктивной системы присутствуют PDE4, PDE7 и PDE8, которые высоко селективны по отношению к цАМФ и осуществляют гидролиз цАМФ до АМФ. В яичниках изоформы PDE8A и PDE8B в значительных количествах обнаруживаются в клетках теки и ооцитах, PDE4A – в ооцитах и соединительной ткани, PDE4C и PDE4D – в фолликулах, PDE7A и PDE7B – в ооцитах, PDE4B – в наружном слое клеток теки [100]. В клетках Лейдига показана высокая активность изоформ PDE8A и PDE8B, вовлеченных в регуляцию и модуляцию стероидогенных эффектов гонадотропинов. Их ингибирование усиливает трансдукцию ЛГ-сигнала, подобно тому, как это происходит при гормональной стимуляции [109].

В случае фосфолипазного пути, реализуемого при активации G_q/11-белка, происходит активация фосфоинозитид-специфичной PLCβ, результатом чего является гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата и генерация двух вторичных посредников – мембранно-связанного DAG и водорастворимого IP3. DAG активирует форбол-чувствительные изоформы PKC, в то время как IP3 мобилизует ионы кальция из внутриклеточных депо [86, 142]. Регуляторные эффекты IP3 реализуются путем его связывания с IP3-рецепторами, локализованным в мембране эндоплазматического ретикулума, что приводит к утечке ионов кальция из внутриклеточных депо, повышению их концентрации в примембранном пространстве эндоплазматического ретикулума и, как следствие, к активации Ca²⁺-активируемых рианодиновых рецепторов, имеющих высокую проводимость для Ca²⁺ [126]. Стремительное повышение концентрации Ca²⁺ в цитозоле приводит к активации большого числа Ca²⁺-регулируемых белков, в первую очередь Ca²⁺-кальмодулин-зависимых, среди которых ключевую роль играют различные изоформы Ca²⁺-кальмодулин-зависимой протеинкиназы II [86].

Адаптерные белки β-аррестины, которые, как и G-белки, взаимодействуют с ICL и ориентированным внутрь клетки вестибюлем трансмембранного тоннеля, присутствуют во всех типах клеток и тканей и вовлечены в контроль многих физиологических процессов [78, 131]. Важное значение для сигналинга, реализуемого через ЛГ/ХГ-Р, имеют две формы β-аррестинов – βarr1 и βarr2. Их основной функцией является способность нарушать взаимодействие лиганд-активированного GPCR с G-белком и вызывать интернализацию лиганд-рецепторного комплекса в составе ранней эндосомы внутрь клетки [29]. Наряду с этим β-аррестины образуют с GPCR активный комплекс, наделенный собственными сигнальными функциями, который опосредует активацию ряда внутриклеточных эффекторов, в том числе ERK1/2, компонентов MAPK [131].

β-Аррестин-опосредуемая десенситизация GPCR обусловлена взаимодействием β-аррестина с сайтами рецептора, которые после гормональной активации подвергаются фосфорилированию либо специфичными GPCR-киназами (GRK), либо низкоспецифичными PKA и PKC. В цитоплазматических участках GPCR, включая ЛГ/ХГ-Р, имеются несколько сайтов-мишеней для фосфорилирования протеинкиназами, и паттерн фосфорилирования зависит от множества факторов. Это структурные особенности активной, гормон-связанной, конформации рецептора, его способность образовывать комплексы, тип и соотношение G-белков, типовая принадлежность воздействующих на рецептор протеинкиназ, включая различные изоформы GRK. Паттерн фосфорилирования GPCR является “фосфокодом”, предопределяющим дальнейшие сигнальные события с участием β-аррестинов. Тем самым, предпочтительными становятся либо интернализация и последующая деградация или рециклизация GPCR, либо формирование сигналосомы, включающей комплекс GPCR–β-аррестины.

Следует, однако, отметить, что структурные различия ЛГ и чХГ, в том числе в связи с различиями в гликозилировании, и многоцентровое (помимо внеклеточного ортостерического сайта) их взаимодействие с молекулой рецептора, в том числе включающее контакты, прямые или опосредованные, с аллостерическими сайтами, приводят к существенным различиям воздействия обоих гормонов на ЛГ/ХГ-Р и к различиям в их физиологических эффектах. Основные черты сходства и различий сигналинга, индуцированного ЛГ и чХГ, обусловленные аллостерическими механизмами их влияния на активность ЛГ/ХГ-Р, будут рассмотрены ниже.

СХОДСТВО И РАЗЛИЧИЯ ЭФФЕКТОВ ЧХГ И ЛГ НА СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ

цАМФ-сигнгалинг

Еще в начале 1990-х гг. было показано, что ЛГ и чХГ стимулируют активность АЦ и повышают уровень цАМФ в ооцитах лягушки и в культуре L-клеток кишечника с экспрессированным ЛГ/ХГ-Р мыши [54, 55]. Они также стимулировали фосфолипазный каскад и вызывали мобилизацию Ca²⁺ из внутриклеточных депо. Оба процесса были независимы, что свидетельствовало об отсутствии значимого взаимодействия между сигнальными каскадами, реализуемыми через G_s- и G_q/11-белки [54, 55]. Повышение уровня цАМФ и подъем внутриклеточной концентрации Ca²⁺ после активации гонадотропинами происходили достаточно быстро, в среднем через 1 мин, что указывает на сходную кинетику этих процессов [4, 120]. G_i-белки, с которыми также способен взаимодействовать ЛГ/ХГ-Р, могут быть вовлечены как в негативную регуляцию АЦ после ее стимуляции гонадотропином (короткая отрицательная обратная связь), так и быть донорами Gβγ-димера, вовлеченного в активацию PLCβ2 и PLCβ3, ответственных за активацию кальциевого сигналинга и различных изоформ PKC [61]. Активация АЦ с помощью ЛГ и чХГ повышала фосфорилирование фактора CREB и усиливала зависимую от него экспрессию гена, кодирующего холестерин-транспортирующий белок StAR, катализирующий первую стадию стероидогененеза [104]. Тем самым, механизмы влияния ЛГ и чХГ на АЦ характеризуются определенным сходством. Однако эффективность такого влияния различается и весьма существенно [22, 104].

Большинство данных, полученных с использованием клеточных культур, демонстрируют более высокий потенциал чХГ в сравнении с ЛГ в отношении активации АЦ и PKA. В COS-7-клетках с экспрессированным ЛГ/ХГ-Р показано, что ED₅₀ для стимулирующего АЦ эффекта чХГ составляет 107 ± 14 пмоль/л, в то время как соответствующий показатель для ЛГ в 5 раз выше [22]. При этом кинетика активации АЦ имела другой характер, и при использовании чХГ максимальное повышение уровня цАМФ в клетке достигалось через 1 ч и более, в то время как при использовании ЛГ это происходило всего через 10 мин [22]. Повышение уровня цАМФ в HEK-293 клетках при воздействии чХГ по величине было также существенно выше, чем при воздействии ЛГ [80]. В наибольшей степени различия в эффективности ЛГ и ЧХГ были выражены в клетках гранулезы яичников [26]. Обработка первичной культуры клеток гранулезы яичников человека в течение 36 ч с помощью чХГ вызывала более выраженное и устойчивое во времени повышение уровня цАМФ в сравнении с обработкой рекомбинантным ЛГ, взятым в той же дозе. В результате в культуре с обработкой чХГ продукция прогестерона была значимо выше, чем в контроле и в культуре с обработкой ЛГ, что свидетельствует о более выраженной стимуляции овариального стероидогенеза, вызываемого чХГ [22]. Сходные результаты были получены при обработке гонадотропинами культивируемых клеток гранулезы яичников козы, где чХГ с существенно большей эффективностью, чем ЛГ, повышал внутриклеточный уровень цАМФ и активировал PKA [56]. Стимулирующий эффект чХГ на уровень цАМФ и цАМФ-зависимое фосфорилирование ERK1/2 при обработке культуры клеток Лейдига также значительно превышал соответствующие эффекты ЛГ, в случае стимуляции продукции цАМФ – почти в 10 раз [104].

Следует отметить, что такие зависимые от цАМФ показатели, как фосфорилирование CREB и экспрессия гена белка StAR в культуре клеток Лейдига и в HEK273-клетках, обработанных чХГ и ЛГ, значимо не различались [26, 104]. Это может быть обусловлено контррегуляторными влияниями, которые запускаются при длительном повышении концентрации цАМФ, среди которых значимую роль имеет повышение активности цАМФ-специфичных PDE. Не менее интересен тот факт, что продукция прогестерона в различных типах клеток, обработанных чХГ, была существенно выше, чем при обработке ЛГ, в то время как уровни тестостерона при этом различались слабо [105]. Такое нивелирование различий на уровне концентрации тестостерона обусловлено тем, что при воздействии ЛГ для синтеза тестостерона в большей степени реализуется путь, включающий вместо прогестерона в качестве промежуточного метаболита 17-гидроксипрогестерон (Δ5-путь), в то время как чХГ обеспечивает синтез больших количеств прогестерона, выполняющего функцию “продукта параллельного накопления”, который затем поступает в менее эффективный Δ4-путь синтеза андрогенов. Результатом является выравнивание продукции тестостерона, вызываемое обоими гонадотропинами, на более поздних стадиях тестикулярного стероидогенеза, несмотря на значительно большее количество прогестерона, накапливаемого в клетках, обработанных чХГ [105].

Изучение эффектов чХГ и ЛГ в гранулезо-лютеиновых клетках человека показало, что чХГ не только с большей эффективностью в сравнении с ЛГ стимулирует фосфорилирование фактора CREB и повышает экспрессию гена, кодирующего StAR, но и в большей степени стимулирует проапоптотические процессы [24]. В отношении регуляции экспрессии гена ароматазы ситуация обратная, и стимулирующий эффект ЛГ через 72 ч после обработки превосходил таковой чХГ, что обусловливало повышение ароматазной активности и стимуляцию конверсии андрогенов в эстрогены, необходимых для поддержания роста фолликулов и ооцита и повышающих выживаемость гранулезо-лютеиновых клеток [24]. Необходимо отметить, что ЛГ также более эффективно в сравнении с чХГ повышал экспрессию генов, кодирующих антиапоптотический белок XIAP и циклин D2, оказывая выраженный антиапоптотический эффект [24]. Это указывает на то, что ЛГ-стимулированные цАМФ-зависимые пути характеризуются в большей степени антиапоптотическим потенциалом, в то время как соответствующие пути, активируемые чХГ, являются триггерами проапоптотических каскадов.

Важным обстоятельством является то, что стимулирующие АЦ эффекты чХГ и ЛГ по-разному модулируются ФСГ. Это обусловлено как гетероди(олиго)меризацией ЛГ/ХГ-Р и структурно близкого ему ФСГР, что меняет эффективность и паттерн их активации гонадотропинами, так и кросс-взаимодействием внутриклеточных каскадов, активируемых ФСГ и гонадотропинами с ЛГ-активностью. С использованием гранулезо-лютеиновых клеток человека показано, что в присутствии ФСГ способность чХГ усиливать продукцию цАМФ повышается в 5 раз, что ведет к усилению фосфорилирования CREB и стероидогенного ответа на чХГ [25]. АЦ эффект рекомбинантного ЛГ в присутствии ФСГ существенно не менялся, вследствие чего совместная обработка клеток с помощью рекомбинантного ЛГ и ФСГ не приводила к значимому повышению фосфорилирования CREB и продукции стероидных гормонов. Интересно, что ФСГ потенцирует стимулирующие эффекты ЛГ (но не чХГ) на активность ERK1/2, ключевого звена каскада MAPK, и на активность Akt-киназы, важнейшего медиатора антиапоптотических процессов, что повышает выживаемость клеток [25]. Эффект ФСГ на чХГ- и ЛГ-индуцированный сигналинг хорошо согласуется с мощным пролиферативным потенциалом эндогенного ЛГ в фолликулярную фазу и после образования трофобласта, а также с сильно выраженным стероидогенным эффектом плацентарного чХГ, что необходимо для поддержания беременности после выхода из лютеиновой фазы.

При длительном стимулирующем воздействии гонадотропинов на клетки-мишени (от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от объекта исследования) отмечается значительное снижение плотности ЛГ/ХГ-Р на поверхности клеток, в основе лежит интернализация лиганд-рецепторных комплексов в составе ранних эндосом во внутриклеточные компартменты. Фактором, который ускоряет процесс интернализации ЛГ/ХГ-Р, является образование значительных по размеру ЛГ/ХГ-Р-содержащих агрегатов [64]. Такие агрегаты значительно быстрее и в больших количествах образуются при связывании ЛГ/ХГ-Р с чХГ, чем при их связывании с ЛГ, и это обусловливает более высокую скорость и интенсивность десенситизации и даун-регуляции ЛГ/ХГ-Р при активации чХГ [62]. В клетках без обработки чХГ значительная часть ЛГ/ХГ-Р локализовалась в крупных мембранных структурах, которые были способны эффективно встраиваться в плазматическую мембрану. Как только чХГ удаляли из среды, крупные агрегаты постепенно диссоциировали и высводившиеся из них ЛГ/ХГ-Р перемещались в мембранные везикулы, обретая способность транслоцироваться в плазматическую мембрану и связываться с гормоном [65]. При этом ЛГ с меньшей интенсивностью индуцировал образование больших ЛГ/ХГ-Р агрегатов, что обеспечивало менее выраженное снижение чувствительности клеток-мишеней к гонадотропинам с ЛГ-активностью и к более быстрому ее восстановлению после десенситизации ЛГ/ХГ-Р, вызванной длительным воздействием гонадотропина [105].

Фосфолипазные пути

Как в семенниках, так и в яичниках, активируемые гонадотропинами фосфолипазные пути, реализуемые через G_q/11-белки, играют не менее важную роль в ЛГ-опосредуемом сигналинге, чем цАМФ-зависимые пути [68]. G_q/11-опосредуемая активация PLCβ необходима для нормального протекания овуляции, обеспечивая надлежащую активацию рецепторов прогестерона и разрыв фолликула [84]. В то же время необходимо отметить, что такие важные для овуляции процессы, как возобновление мейоза, разрастание слоя кумулюсных клеток и овариальный ангиогенез, опосредумые в основном через ЛГ-активируемые цАМФ-пути, нормально протекают в клетках гранулезы, дефицитных по генам Gα_q/11-субъединиц, т. е. непосредственно от фосфолипазного сигналинга не зависят [84].

В отличие от цАМФ-сигналинга для активации фосфолипазных путей требуются существенно более высокие концентрации гонадотропинов. EC₅₀ для чХГ, обеспечивающее активацию PLCβ и IP3-опосредуемую мобилизацию кальция из внутриклеточных депо, в 20 раз выше EC₅₀ для чХГ, требуемого для полумаксимальной активации АЦ [146]. Стимулирующее влияние чХГ на накопление IP3 в большей степени выражено при высокой плотности ЛГ/ХГ-Р и снижается при их низкой плотности, что указывает на предпочтительность взаимодействия гормон-активированного ЛГ/ХГ-Р с G_s-, но не с G_q/11-белком. Эффективность стимулирующего влияния чХГ на мобилизацию Ca²⁺ через 1 мин после обработки была существенно выше, чем таковая для ЛГ, но со временем различия нивелировались, что обусловлено активацией откачки Ca²⁺ из цитозоля. Вследствие этого интегрированные значения для повышения концентрации Ca²⁺ в цитозоле в ответ на чХГ и ЛГ в течение трехминутного интервала различались слабо [80].

Необходимо различать механизмы, обусловленные активацией PLCβ-путей, от механизмов, включающих активацию кальциевых каналов плазматической мембраны L-типа, которые вносят значимый вклад в стероидогенные эффекты гонадотропинов. Важно отметить, что активация этих каналов реализуется в основном через βγ-димер G-белка, донатором которых являются G_i-белки, также являющиеся мишенями ЛГ и чХГ [70]. При этом вход Ca²⁺ в клетку необходим для пополнения запасов Ca²⁺ во внутриклеточных депо. Первые данные об участии кальциевых каналов плазматической мембраны в стимулирующем эффекте чХГ на экспрессию стероидогенных белков и стероидогенез были получены в экспериментах на опухолевых клетках Лейдига мыши [81]. В Ca²⁺-обогащенной среде стимулирующий эффект чХГ на экспрессию гена, кодирующего StAR, усиливался в 1.7 раза, и это было ассоциировано со значительным повышением продукции прогестерона. При добавлении во внеклеточную среду комплексообразователей, связывающих Ca²⁺, или блокатора кальциевых каналов верапамила отмечали резкое снижение чХГ-индуцированной стимуляции стероидогенеза [81]. В дальнейшем роль кальциевых каналов L-типа в модуляции гонадотропин-стимулированного стероидогенеза была показана на клетках гранулезы крысы. Было продемонстрировано ингибирующее влияние амфетамина, снижающего концентрацию внутриклеточного Ca²⁺, на стимулированную гонадотропинами экспрессию стероидогенных белков в яичниках и на овариальный стероидогенез в целом [30].

Внутриклеточный кальциевый сигналинг вовлечен не только в стероидогенные эффекты ЛГ и чХГ, но и в реализацию их пролиферативных эффектов, как это показано для ЛГ при действии на клетки эпителиального рака яичников OV207 и OVCAR-3 [85]. В основе пролиферативных эффектов ЛГ лежит активация каскада MAPK, в том числе его конечного звена ERK1/2, причем ЛГ-индуцированная стимуляция ERK1/2 осуществляется как путем активации кальциевых каналов L-типа, так и через стимуляцию одного из конечных компонентов фосфолипазного пути – протеинкиназы Сδ. Индуцированная ЛГ миграция и пролиферация клеток рака яичников подавлялась при ингибировании стимулирующего ERK1/2 эффекта гонадотропина, что может быть достигнуто снижением концентрации Ca²⁺ во внеклеточной среде с помощью комплексообразователей, ингибированием кальциевого тока через плазматическую мембрану с помощью блокатора кальциевых каналов верапамила и путем подавления выброса Ca²⁺ из внутриклеточных депо с помощью дантролена. Стимулирующие эффекты ЛГ на ERK1/2 подавлялись также ингибиторами протеинкиназы Сδ [85].

Поскольку чХГ с гораздо более высокой эффективностью активирует цАМФ-пути, то не удивительно, что он с существенно меньшей эффективностью влияет на фосфолипазные пути и ассоциированную с ними активность ERK1/2 и, соответственно, имеет низкий пролиферативный потенциал, более того, он наделен антипролиферативной активностью. В пользу этого свидетельствуют результаты сравнительного исследования длительной экспозиции первичной культуры клеток гранулезы козы с ЛГ и чХГ [56]. ЛГ в значительной степени стимулирует активность DAG-чувствительной PKC и значимо повышает фосфорилирование ERK1/2, что ассоциировано с активацией ERK1/2-опосредуемой пролиферации фолликулярных клеток, в то время как чХГ на эти показатели не влияет и, напротив, снижает пролиферацию клеток гранулезы, действуя через цАМФ-зависимые механизмы [56]. Эти данные свидетельствуют о различном паттерне воздействия ЛГ и чХГ на фосфолипазные пути, вовлеченные в контроль клеточного роста и дифференцировки.

Индуцированное чХГ и ЛГ взаимодействие рецептора ЛГ/ХГ с β-аррестинами

После активации ЛГ/ХГ-Р гонадотропином запускается процесс рекрутирования β-аррестинов, результатом чего является интернализация лиганд-рецепторного комплекса в составе ранних эндосом внутрь клетки. Это приводит либо к деградации ЛГ/ХГ-Р, либо к индукции внутриклеточного сигналинга [26]. Механизмы взаимодействия с β-аррестинами для ЛГ/ХГ-Р отличаются от таковых в случае ФСГР, поскольку ЛГ/ХГ-Р способен рекрутировать β-аррестины, находясь в нефосфорилированном состоянии, вследствие чего ЛГ-регулируемые β-аррестиновые пути не являются зависимыми от паттерна и активности киназ GRK-семейства [89]. Во взаимодействие ЛГ/ХГ-Р с β-аррестинами вовлечены ICL3 этого рецептора и АДФ-рибозилирующий фактор 6 (ARF6) [28, 89]. В неактивном, ГДФ-связанном состоянии ARF6 связывается с β-аррестином, и образовавшийся комплекс заякоривается в плазматической мембране, будучи доступен для взаимодействия с цитоплазматическими участками ЛГ/ХГ-Р. После активации ЛГ/ХГ-Р гонадотропином происходит образование транзиторного комплекса между рецептором и ARF6, что приводит к обмену ГДФ на ГТФ в нуклеотидсвязывающем сайте ARF6. При этом происходит реорганизация комплекса между активной, ГТФ-связанной, формой ARF6 и β-аррестином, в результате чего последний высвобождается из комплекса с ARF6 и связывается с ICL3 ЛГ/ХГ-Р, что и обеспечивает даун-регуляцию и интернализацию лиганд-рецепторного комплекса [116].

Сравнительный анализ влияния ЛГ и чХГ на рекрутирование β-аррестинов демонстрирует, что чХГ более активен, вызывая β-аррестин-опосредуемые эффекты значительно быстрее и при более низких концентрациях. На это указывает EC₅₀ для чХГ-индуцированного рекрутирования βarr2 в опухолевых клетках Лейдига мыши (10 нМ), которое в 13 раз ниже, чем для ЛГ (130 нМ). Исходя из величины стимулирующего эффекта на рекрутирование β-аррестина, ЛГ определяют как частичный агонист ЛГ/ХГ-Р, в отличие от чХГ, демонстрирующего активность полного агониста β-аррестин-специфичного сигналинга [105]. Как отмечалось выше, ключевую роль в стимуляции стероидогенеза играют цАМФ-пути, и чХГ является более эффективным активатором стероидогенеза в сравнении с ЛГ, включая стадию синтеза прогестерона. В связи с этим представляет интерес, что β-аррестины положительно регулируют синтез прогестерона гонадотропинами, поскольку снижение их экспрессии с помощью микроРНК ингибирует продукцию этого гормона, прекурсора андрогенов и эстрогенов [105]. Поскольку чХГ более эффективно стимулирует рекрутирование β-аррестинов, то этот его эффект, наряду с более выраженной стимуляцией АЦ, может обеспечивать более высокую стероидогенную активность чХГ, которая, однако, ограничивается стадией синтеза прогестерона.

Более низкая активность ЛГ в отношении β-аррестинов позволяет предотвратить или снизить интернализацию и даун-регуляцию ЛГ/ХГ-Р при длительном воздействии даже сравнительно высоких концентраций ЛГ, сохраняя тем самым чувствительность клеток к эндогенным гонадотропинам и препятствуя истощению пула активных ЛГ/ХГ-Р в плазматической мембране и во внутриклеточных компартментах. Активирующие мутации в ЛГ/ХГ-Р, такие как замена локализованного в ICL3 Asp⁵⁶⁴ на глицин или тирозин, вызывают значительное (в случае Asp⁵⁶⁴Gly пятикратное) повышение интернализации конститутивно активного ЛГ/ХГ-Р внутрь клетки [16]. Активирующие мутации индуцируют те же конформации ЛГ/ХГ-Р, что и чХГ, о чем свидетельствует отсутствие влияния чХГ на перераспределение мутантных ЛГ/ХГ-Р в мембранных микродоменах, обусловленное взаимодействием с β-аррестинами [77].

Все вышесказанное можно обобщить в виде табл. 1, демонстрирующей черты сходства и различий сигнальных механизмов действия ЛГ и чХГ на клетки-мишени.

 

Таблица 1. Сходство и различия в активации сигнальных путей ЛГ и чХГ в клетках-мишенях

Путь	Сходство	Различия
цАМФ-сигнальный путь	Действуя на тестикулярные клетки Лейдига и фолликулярные клетки яичников, ЛГ и чХГ посредство Gs-белков стимулируют АЦ, повышают уровень цАМФ внутри клеток, активируют ПКА и цАМФ-зависимые эффекторные белки и транскрипционные факторы, в том числе фактор CREB	АЦ эффект чХГ более выражен, реализуется в более низких концентрациях, значителен в клетках гранулезы, на которые ЛГ действует слабо. чХГ через цАМФ-зависимые механизмы стимулирует ERK1/2, что обусловливает его проапоптотический эффект, в то время как ЛГ через АЦ-систему не активирует MAPK и демонстрирует антиапоптотический эффект
Фосфолипазный путь	Оба гормона посредством Gq/11-белков и PLCβ повышают уровень кальция в клетке, стимулируя его выход из внутриклеточных депо, и активируют форбол-чувствительные изоформы ПКС. Для активации фосфолипазного пути требуются более высокие концентрации ЛГ и чХГ, чем для активации АЦ-пути	Эффект чХГ на фосфолипазный каскад менее выражен, чем таковой ЛГ, и в значительной степени зависит от концентрации внеклеточного кальция. Активируя Gq/11-белки в клетках гранулезы яичников, ЛГ индуцирует ПКС-зависимую активацию ERK1/2, результатом чего является его мощный митогенный эффект, который не выявляется у чХГ
β-аррестиновый путь	Оба гонадотропина стимулируют рекрутирование β-аррестинов, что приводит к эндоцитозу активированного гормоном ЛГ/ХГ-Р, а также стимулирует эндосомальный β-аррестиновый сигналинг	Стимулирующий эффект чХГ на рекрутирование β-аррестинов более выражен и реализуется в более низких концентрациях, чем таковой ЛГ. Это приводит к быстрому ослаблению чувствительности ЛГ/ХГ-Р к гормональной стимуляции, а также к деградации рецепторов, в том числе вследствие мощной агрегации в эндосомах

 

N- И O-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ГОНАДОТРОПИНОВ КАК ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ

Число, структура и заряд N-гликанов и их влияние на функциональную активность гонадотропинов и их физиологические эффекты

Ключевую роль для активности гонадотропинов и их сигнальных каскадов играет N-гликозилирование и, в случае чХГ и других ХГ, также O-гликозилирование. Как отмечалось выше (см. рис. 1), α-субъединица, общая для ЛГ и ХГ, подвергается N-гликозилированию по двум сайтам (Asn⁵², Asn⁷⁸), в то время как β-ЛГ и β-ХГ имеют, соответственно, один и два сайта. Наряду с различиями в степени гликозилирования и локализации гликанов в α- и β-субъединицах не менее важную роль в гонадотропин-индуцированной сигнальной трансдукции играют природа и заряд олигосахаридных цепей. Так, в α- и β-субъединицах ЛГ и гипофизарной формы чХГ значительная часть олигосахаридных цепей содержат терминальные остатки сульфатированного GalNAc, которые несут значительный отрицательный заряд, в плацентарном чХГ и в α- и β-субъединицах ФСГ на концах N-гликанов локализованы в основном остатки сиаловых кислот, отрицательный заряд которых менее выражен [15]. При этом суммарный заряд N-гликана определяется количеством и соотношением концевых гликозильных остатков, что, в свою очередь, зависит от степени разветвленности N-гликана. N-гликаны в α- и β-субъединицах ЛГ и чХГ менее разветвленные, чем в ФСГ, и это не только вносит значительный вклад в результирующий заряд этих субъединиц, но и определяет их пространственную конфигурацию и способность связываться с ЛГ/ХГ-Р.

Структура N-гликанов в α- и β-субъединицах, образующих димерный гонадотропин, может сильно различаться, что обусловлено различиями в их посттрансляционном процессинге, в том числе в машинерии их N-гликозилирования, а также в интенсивности обмена и реассоциации этих субъединиц. С учетом высокой вариабельности гликозилирования α- и β-субъединиц гонадотропинов [19, 34, 49], общее число гликоформ αβ-гетеродимеров ЛГ и ХГ может даже у одного организма быть очень значительным и исчисляться десятками, сотнями и даже тысячами вариантов [49]. Взаимодействие гонадотропинов с ЛГ/ХГ-Р сильно зависит от их гликозилирования, вследствие чего результирующий эффект воздействия гонадотропина на клетку-мишень находится в прямой зависимости от соотношения и паттерна его гликоформ. Учитывая особенности расположения N-гликанов в гонадотропинах, а также O-гликанов в С-концевой части ХГ, имеются основания считать, что гликозильные компоненты способны взаимодействовать с сайтами рецептора, отличными от его ортостерического сайта, тем самым аллостерически влияя на сродство гормона к ЛГ/ХГ-Р, на предвзятость сигналинга и эффективность клеточного ответа [19, 28, 50, 133]. Это имеет большое значение для оценки биологической активности рекомбинантных и природных форм чХГ, в том числе выделенных из различных источников и различными способами, а также в оценке отличий рекомбинантного ЛГ от эндогенного ЛГ при их использовании во вспомогательных репродуктивных технологиях [49]. Необходимость соответствия природным гликоформам рекомбинантных форм ЛГ и чХГ, а также гормонов с ЛГ-активностью, синтезированных химическим путем, является одной из наиболее сложно разрешимых проблем современной фармакологии, будучи основным препятствием для создания физиологически релевантных препаратов ЛГ и чХГ [48, 49].

Большинство данных по влиянию N-глико-зилирования на связывающие характеристики и активность гонадотропинов получены для ФСГ, что во многом предопределено интенсивной разработкой препаратов ФСГ для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях [19]. И эти данные свидетельствуют о том, что N-гликаны являются важнейшими аллостерическими модуляторами ФСГ-сигналинга, контролируя его эффективность и предвзятость.

Несмотря на отличия в структурной организации ФСГ и его рецептора, а также N-гликанов, модифицирующих α- и β-ФСГ, от таковых ЛГ, чХГ и ЛГ/ХГ-Р, основные закономерности влияния N-гликозилирования на активность справедливы и для гонадотропинов с ЛГ-активностью. Так, нормально или слабо гликозилированные формы чХГ, с большей эффективностью стимулируют цАМФ-пути, и, как следствие, их действие в основном направлено на стимуляцию стероидогенеза, в то время как гипергликозилированные формы чХГ в этом отношении менее активны [73], а их эффекты реализуются в направлении стимуляции митогенных путей, в которые могут быть вовлечены рецепторы, отличные от ЛГ/ХГ-Р [11]. При этом важную роль играет стабильность чХГ, поскольку нормально или слабо гликозилированные формы гормона имеют более короткое время полужизни в кровотоке, в отличие от гипергликозилированных форм, в которых сайты для протеолитического расщепления экранированы множеством гликозильных групп [31]. Важную информацию дает изучение взаимодействия гликозилированных форм ТТГ с ТТГ-Р , структуктурно близких ЛГ/ХГ-Р [132]. Интересен тот факт, что гипергликозилированные (но не нормально гликозилированные) формы чХГ способны стимулировать ТТГР, повышая уровень тиреоидных гормонов, чем может быть обусловлен повышенный риск выкидышей и развитие аутоиммунных заболеваний щитовидной железы на ранних сроках беременности [119], особенно в случае экспрессии варианта ТТГР с заменой Val⁵⁹⁷ на изолейцин в ТМД, имеющем гиперчувствительность к чХГ [21].

В пользу аллостерической природы влияния N- и О-гликозилирования гонадотропинов на их активность свидетельствуют следующие факты.

N-гликаны в молекулах гонадотропинов аллостерически модулируют их связывание с рецептором

Постулируется модулирующая роль N-гликанов в процессе связывания гормона с рецептором, без их взаимодействия с ортостерическим сайтом. Предполагается, что высокоаффинное связывание гликопротеинового гормона с ортостерическим сайтом рецептора должно включать почти исключительно специфическое взаимодействие между его АКО и их кластерами, т. е. основываться на принципах белок-белкового взаимодействия [67, 94]. Взаимодействия между N-гликаном и полипептидной цепью не могут быть высокоспецифичными и высокоаффинными, поскольку структура N-гликанов вариабельна, и потому они могут быть вовлечены во взаимодействие с ортостерическим сайтом лишь опосредованно, модулируя его связывание через аллостерические механизмы. Действительно, дегликозилированные формы гонадотропинов не только сохраняют способность связываться с рецептором, но и в ряде случаев их аффинность превосходит таковую гликозилированных форм [18, 66]. В согласии с вышесказанным находятся данные об отсутствии N-гликанов в области сайтов связывания гипофизарных гликопротеиновых гормонов и их рецепторов. У всех изученных видов позвоночных в рецепторах ЛГ/ХГ-Р, ФСГР и ТТГР имеются четыре области, свободные от N-гликанов, в том числе две на вогнутых гранях LRR-субдомена, ответственных за связывание гормона [94]. В то же время имеются основания считать, что N-гликаны могут влиять на взаимное расположение и эффективность взаимодействия между связывающими сайтами гормона и рецептора, в том числе путем изменения взаимной ориентации эктодомена и ТМД, и это влияет на паттерн активных конформаций лиганд-рецепторного комплекса [19, 83].

и селективность сигнальной трансдукции N-гликозилирование гонадотропинов влияет на эффективность

N-гликозилирование непосредственно влияет на эффективность регуляторного влияния гонадотропинов на внутриклеточные эффекторы, включая цАМФ-зависимые каскады и кальциевый сигналинг, и, как следствие, на физиологический ответ. Наличие или отсутствие N- и(или) O-гликанов способно менять фармакологический профиль гонадотропина, что впервые было продемонстрировано еще более 30 лет назад. Было показано, что дегликозилирование приводит к снижению или полной потере специфической активности [106], а в ряде случаев дегликозилированные формы гонадотропинов приобретали свойства антагонистов ЛГ/ХГ-Р [45]. При этом связывание дегликозилированных гонадотропинов с рецептором сохранялось, хотя его аффинность и менялась, и это указывает на аллостерический характер влияния гликанов в молекуле ЛГ или чХГ на активацию ЛГ/ХГ-Р. Одним из механизмов, которые могут лежать в основе влияния степени и паттерна N-гликозилирования гонадотропинов на их способность активировать рецептор, является воздействие N-гликанов на взаимное расположение эктодомена и ТМД. В случае стабилизации N-гликозилированным гонадотропином активной конформации рецептора, в которой обеспечивается эффективное взаимодействие между участками шарнирной области эктодомена и ECL1 и сегментами внешнего вестибюля ТМД, происходит запуск сигнального каскада, и гонадотропин функционирует как полный или частичный агонист. В противном случае, когда гонадотропин с другим паттерном N-гликозилирования препятствует такому взаимодействию, он функционирует как антагонист или инверсионный агонист.

Механизмы этого явления подробно изучены для ФСГ-Р и ТТГ-Р [19, 46]. В отношении ЛГ/ХГ-Р установлено, что при его связывании с чХГ происходит вращение эктодомена по механизму, сходному с таковым у ФСГР и ТТГР. По данным криогенной электронной микроскопии, для ЛГ/ХГ-Р и ТТГР при переходе из активной в неактивную конформацию показаны сходные углы вращения эктодомена – на 45° и 38° соответственно [41, 46]. Соразмерность N-гликанов в положении Asn⁵⁶ α-субъединиц ЛГ, чХГ и ТТГ показывает, что они выполняют в процессе активации рецепторов сходную функцию.

N-гликаны влияют на образование гонадотропиновых комплексов и характер их взаимодействия с рецепторами

Продемонстрирована важная роль N-гликанов в формировании и стабильности гетеродимерных комплексов гонадотропинов, что определяет их аффинность к рецептору, влияет на предвзятость трансдукции, являясь одним из аллостерических механизмов гонадотропинового сигналинга, а также существенно для биодоступности и фармакокинетических характеристик гонадотропинов. Длительная инкубация клеточных культур с гибридом N(56)dg-eLHalpha:eFSHbeta, в котором α-ЛГ лошади дегликозилирована по Asn⁵⁶, приводит к неустойчивому димерному комплексу с β-ФСГ и утрате активности гибридного гонадотропина [20]. В то же время для чХГ, β-субъединица которого была подвержена множественному O-гликозилированию, N-гликозилирование α-чХГ по Asn⁵⁶ слабо влияло на стабильность чХГ-гетеродимера, хотя было критично для его активности. Константы диссоциации для комплексов β-чХГ с нормальной и дегликозилированной по Asn⁵⁶ α-чХГ были сходными, а данные КД-спектроскопии и ЯМР демонстрировали лишь небольшие различия для этих комплексов, в основном связанные с локальными изменениями пространственной организации кластера АКО в β-чХГ, потенциально контактирующих с N-гликаном в сайте Asn⁵⁶ [42]. При этом активность чХГ-гетеродимера с Asn⁵⁶-дегликозилированной α-чХГ была резко снижена, что подтверждает важность N-гликана в этой позиции для взаимодействия с рецептором, в соответствии с моделью, предложенной для ФСГР и ТТГР [19, 46].

Гипергликозилирование вносит еще более значимый вклад, чем дегликозилирование, в способность ХГ образовывать гетеродимерные комплексы и играет критическую роль в паттерне его активности [103]. В случае α-субъединицы чХГ показано, что избыточное гликозилирование нарушает ее ассоциацию с β-чХГ [13]. Мономерные α-чХГ, содержащие объемные N-гликаны, препятствующие комплексообразованию, секретируются плацентой, гипофизом, некоторыми опухолями [103], а также в значительных количествах идентифицированы в семенной жидкости [140]. N-гликаны в гипергликозилированных субъединицах чХГ, которыми обогащена семенная жидкость, содержат большое количество остатков фукозы, что существенно меняет конформационную подвижность и гликанов, и субъединиц чХГ [97]. Гипергликозилированные α-ХГ могут функционировать в как в форме мономеров, так и гомодимеров α-ХГ–α-ХГ, что также справедливо для гипергликозилированных β-ХГ. Гипергликозилирование β-ХГ не только нарушает стабильность их комплекса с α-субъединицей, но и способствует генерации свободных форм β-ХГ и их гомодимеров β-ХГ–β-ХГ. При этом гипергликозилированный ХГ, включающий популяцию мономерных β-ХГ, не только с более низким сродством взаимодействует с ЛГ/ХГ-Р [73], но и приобретает способность стимулировать рецепторы трансформирующего фактора роста-β (TGFβ) [31, 95]. Стимуляция этих рецепторов, наряду с опосредуемой через ЛГ/ХГ-Р стимуляцией цАМФ-путей и различных изоформ PKС, приводит к активации таких эффекторов, как ERK1/2, Akt-киназа и белки SMAD-семейства [124]. Этим обусловлен мощный митогенный и антиапоптотический потенциал гипергликозилированных форм β-ХГ, который реализуется независимо от сигнальных путей, включающих ЛГ/ХГ-Р, и вносит определяющий вклад в рост и дифференцировку эмбриона на ранних стадиях его развития.

Различная рецепторная специфичность слабо и высоко гликозилированных изоформ чХГ обусловлена различиями в доступности определенных участков молекулы для взаимодействия с ЛГ/ХГ-Р. Антитела B-152, которые специфически опознают O-гликаны, привязанные к остатку 132 в С-концевой части β-чХГ, не способны преципитировать с гетеродимерами чХГ [12], что указывает на высвобождение С-концевого участка в гипергликозилированных формах чХГ либо вследствие диссоциации β-чХГ из димерного комплекса, либо вследствие значительного изменения конформации последнего, обеспечивающего презентацию этого участка для взаимодействия с антителами. Гипергликозилирование снижает аффинность чХГ к ЛГ/ХГ-Р и ослабляет его стимулирующие эффекты в отношении эффекторных систем, что может рассматриваться как аллостерическое влияние N- и O-гликанов на рецепторное связывание и специфическую активность гормона. Так, EC₅₀ для активации ЛГ/ХГ-Р в случае нормально гликозилированного плацентарного чХГ составляет 3.3 пМ, в то время как для гипергликозилированных форм – от 7.1 до 14.0 пМ [73]. Тем самым, избыточное количество гликанов в чХГ выполняет функции “связанного” негативного аллостерического модулятора (NAM).

N-гликозилирование гонадотропинов аллостерически влияет на стабильность рецепторных комплексов

N-гликозилирование гонадотропинов также влияет на стабильность гетероди(олиго)мерных комплексов, образуемых их рецепторами. Несмотря на то, что рецепторы гонадотропинов могут функционировать как мономеры, образование гомо- и гетероди(олиго)мерных рецепторных комплексов во многом предопределяет их активность, причем соотношение и структурная организация таких комплексов играют важную роль в паттерне сигнальной трансдукции, особенно для гетеродимеров, образуемых ЛГ/ХГ-Р и ФСГР. В стабилизации рецепторных комплексов могут принимать участие различные типы гликан-опосредуемых взаимодействий, включая взамодействия типа гликан-белок и гликан-гликан, которые способны стабилизировать или, напротив, дестабилизировать ассоциацию протомеров в составе комплекса или в комплексах более высокого порядка. Для ФСГР показано, что его связывание с высокими концентрациями гипогликозилированных форм ФСГ, содержащих 18 и 21 кДа β-ФСГ, приводит к возрастанию доли мономерных форм ФСГР, до 80% в ФСГ-связанном состоянии, причем этот эффект реализуется через 2 мин и положительно коррелирует с активацией АЦ [1]. Полностью гликозилированный ФСГ, включающий 24 кДа β-ФСГ, в этом отношении менее эффективен, а повышение доли мономерной формы ФСГР и активация АЦ в этом случае достигаются существенно позднее. Дегликозилированная форма ЛГ лошади со смешанной ЛГ- и ФСГ-подобной активностью, включающая α-лЛГ, дегликозилированную по Asn⁵⁶, и β-лЛГ, лишенную С-концевого сегмента 121–149, содержащего сайты для O-гликозилирования, напротив, повышает долю олигомерной формы рецептора до 50% и выше. К такому же результату приводит воздействие на ФСГР низких концентраций слабо гликозилированных форм ФСГ [1]. Все это свидетельствует в пользу зависимости степени олигомеризации ФСГР не только от степени N-гликозилирования гонадотропина, но и от его концентрации, а также указывает на взаимосвязь между N-гликозилированием и кинетическими показателями комплексообразования ФСГР. Все вышесказанное справедливо и для ЛГ/ХГ-Р, особенно в аспекте его гетеродимеризации с ФСГР, и это требует дальнейших исследований.

N-гликозилирование влияет на предвзятость гонадотропинового сигналинга

Степень и паттерн N-гликозилирования гонадотропинов может оказывать значимое влияние на предвзятость сигнальной трансдукции, а также предопределять судьбу лиганд-рецепторного комплекса в клетке, которая в значительной степени зависит от характера взаимодействия лиганд-активированного ЛГ/ХГ-Р и других рецепторов гипофизарных гликопротеиновых гормонов с β-аррестинами. Наибольшее число доказательств по влиянию N-гликозилирования на предвзятость внутриклеточного сигналинга и избирательность клеточного ответа, а в более широком смысле на фолликулогенез и оогенез, относится к ФСГ и его сигнальным каскадам [1, 32, 69, 139]. При этом имеются, хотя и косвенные, данные в отношении гонадотропинов с ЛГ-активностью. Так в середине менструального цикла у женщин, на стадии индукции овуляции, наблюдается не только значимое повышение суммарной концентрации ЛГ-гликоформ, но и превалирование доли слабо гликозилированной формы гормона, содержащей только два N-гликана в α-субъединице (в среднем 62–65%). Это синхронизировано с мощной активацией ЛГ-зависимых сигнальных путей в овариальных клетках, приводящих к разрыву фолликула [133]. В то же время, в раннюю фолликулярную фазу, а также в лютеальную фазу общая концентрация ЛГ в крови и доля его слабо гликозилированной формы резко снижены, что совпадает с ослаблением ЛГ-сигналинга в яичниках. К 14-му дню цикла меняется соотношение сиаловых кислот и сульфатированного GalNAc в N-гликанах, определяющих суммарный отрицательный заряд ЛГ, и это также вносит значительный вклад в их взаимодействие с ЛГ/ХГ-Р [133].

При изучении ЛГ лошади, наделенного как ЛГ-, так и ФСГ-подобной активностью, были получены доказательства предвзятости сигналинга его гликозилированных и дегликозилированных по Asn⁵⁶ форм по отношению к цАМФ-зависимому и β-аррестиновому путям, которые опосредуются через активацию ФСГР [129]. При этом дегликозилирование приводило к значительному снижению по сравнению с нативым гормоном, стимулирующего эффекта ЛГ лошади на активность АЦ и нижележащих цАМФ-зависимых каскадов, и в то же время сохраняло и даже потенцировало активацию β-аррестинового пути, результатом чего были активация ERK1/2 и повышение фосфорилирования рибосомального белка rpS6. Фосфорилирование rpS6 при этом осуществлялось независимо от PKA по сигнальному пути, включающему mTOR-опосредуемое фосфорилирование и активацию рибосомальной киназы p70S6K [130].

Таким образом, гликозилирование оказывает значимое влияние на устойчивость гетеродимерных комплексов гонадотропинов и их рецепторов на связывающие характеристики ЛГ/ХГ-Р, на предвзятость сигнальной трансдукции, причем в случае гипергликозилированных форм β-ХГ меняется рецепторная специфичность гонадотропинов, которая при повышении степени гликозилирования смещается от ЛГ/ХГ-Р к рецепторам TGFβ. Не исключено и влияние на образование лиганд-рецепторного комплекса N-гликозилирования внеклеточных участков самого ЛГ/ХГ-Р. При этом не всегда возможно разделить аллостерические эффекты гликозилирования от стерических эффектов, влияющих на доступность сайтов взаимодействия гонадотропина и его рецептора, от влияния гликозилирования на посттрансляционный процессинг и секреторную активность гонадотропинов, а также на процессинг и транслокацию в мембрану ЛГ/ХГ-Р. К тому же характер влияния N-гликанов в значительной степени определяется не только их количеством и локализацией, но и типом гликозилирования и химической структурой N-гликанов (соотношение сиаловой кислоты и сульфатированного GalNAc, определяющее заряд N-гликанов, наличие остатков фукозы, определяющих их конформационую жесткость, и др.). Предпринимались попытки разделить функции N- и O-гликозилирования в регуляции активности и контроле структурной организации гонадотропинов [45], но до сих пор это остается трудноразрешимой задачей.

Важно, что гликозилирование критически влияет на фармакокинетику гонадотропинов и их устойчивость к протеолитической деградации, что также отражается на эффективности их регуляторного влияния на внутриклеточный сигналинг. Кроме того, при осложненной беременности и в условиях репродуктивных дисфункций, а также при приеме различных препаратов, включая контрацептивы, наблюдаются существенные изменения паттерна гликозилирования, что неизбежно сказывается на фармакокинетике, биодоступности и паттерне гонадотропинов с ЛГ-активностью, в первую очередь различных форм чХГ, и опосредует различные эффекты гликоформ ЛГ и чХГ на стероидогенез, фолликулогенез, оогенез и эмбриогенез [43, 134].

КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ КАК АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОРА ЛГ/ХГ

Образование гомо- и гетероди(олиго)мерных комплексов GPCR, а также комплексообразование рецепторов с другими компонентами сигнальной трансдукции (G-белки, β-аррестины) играет важную роль в сигнальной трансдукции [110]. Несмотря на то, что большинство этих сведений относятся к GPCR класса С, комплексообразование играет важную роль и для GPCR класса А, к которым относится ЛГ/ХГ-Р. GPCR класса А активны преимущественно в мономерной форме, в то время как образование комплексов обусловлено переходом рецептора в неактивное состояние и(или) необходимо для модуляции связывания гормона и его эффективности [51, 92]. Гомоди(олиго)меризация может быть вовлечена в процессы десенситизации, процессинга и транслокации рецепторов. Образование комплексов обепечивает механизм транс-активации GPCR, внося существенный вклад в предвзятость сигнальной трансдукции, что в наибольшей степени проявляется при образовании гетерокомплексов. Механизмы, опосредующие эффекты протомеров на активность образуемых ими комплексов, включают в качестве основного компонента аллостерические влияния [51, 92]. Само образование комплексов находится под контролем аллостерических регуляторов различной природы, специфично взаимодействующих с сайтами в протомерах, которые формируют контакты между ними, в том числе с сайтами, взаимодействующими с мембранными липидами [137].

В случае гонадотропинов имеются различные модели, описывающие возможную роль и оценивающие вклад комплексообразования в регуляцию активности их рецепторов. Это иллюстрируется динамичным паттерном мономерных и олигомерных форм ЛГ/ХГ-Р, их взаимными переходами при связывании рецептора с лигандами и в процессе активации [41, 71, 108], а также существованием и специфичной активностью гетеродимерных комплексов, образуемых ЛГ/ХГ-Р и ФСГР [23, 27, 47, 70, 75, 82].

В базальном состоянии основная популяция ЛГ/ХГ-Р (около 60%), как и ФСГР (около 70%), представлена мономерными формами [71]. При активации гормоном доля мономерных форм повышается, хотя и в небольшой степени, и это обусловлено образованием активированного комплекса, в котором ЛГ/ХГ-Р представлен мономером [41]. В неактивном состоянии ЛГ/ХГ-Р образуют преимущественно гомоолигомерные, трех- и тетрамерные комплексы, в то время как доля гомодимеров существенно ниже. Если в мономерном состоянии лиганд-связанный ЛГ/ХГ-Р активирует нижележащие эффекторы по механизму цис-активации, то в составе комплексов – по механизму транс-активации [71].

Исследование механизмов образования ди- и олигомерных комплексов ЛГ/ХГ-Р показало ключевую роль в этом межспиральных контактов, образуемых ТМ каждого из протомеров, причем для различных комплексов набор таких взаимодействий, хотя и в небольшой степени, отличается. При изучении различных пар протомеров ЛГ/ХГ-Р была показана определяющая роль в комплексообразовании контактов между спиралями ТМ4 и ТМ1, а также межспиральных контактов ТМ3-ТМ3 и ТМ5-ТМ5 [71]. В пользу вовлечения ТМ в стабилизацию гомоди(олиго)мерных комплексов свидетельствуют результаты изучения химерных ЛГ/ХГ-Р, в том числе лишенных эктодомена или его интерфейса с ТМД [98]. Важно, что ТМД также вовлечен в ди(олиго)меризацию ЛГ/ХГ-Р, в том числе в условиях его активации гонадотропином. Индуцированные гонадотропином конформационные изменения, возникающие в LRR-субдомене и шарнирной области эктодомена, распространяются на ТМД, что меняет паттерн и эффективность взаимодействий между ТМ протомеров, определяя стабильность рецепторного комплекса [147]. В этом случае влияние связанного с ЛГ или чХГ эктодомена одного протомера на свободный от лиганда эктодомен другого протомера осуществляется не напрямую, а через посредство индуцированных связыванием гонадотропина изменений в ТМД протомеров и взаимодействий между ними [147].

В отношении оценки аллостерического влияния комплексообразования на активность ЛГ/ХГ-Р наибольший интерес представляют исследования гетеродимерных комплексов между ЛГ/ХГ-Р и ФСГР, тем более что в их составе активность ЛГ/ХГ-Р существенно варьирует и характеризуется предвзятым сигналингом. Имеются данные, указывающие на образование гетеродимеров между ЛГ/ХГ-Р и ФСГР и на их роль в контроле стероидогенеза и фолликулогенеза [23], хотя до сих пор ведутся споры об образовании стабильных гетеродимеров ФСГР–ЛГ/ХГ-Р [27].

Связывание ФСГ с комплексом ФСГР–ЛГ/ХГ-Р по механизму транс-активации вызывает стимуляцию несвязанного с лигандом ЛГ/ХГ-Р, тем самым запуская ЛГ-зависимые каскады даже в отсутствие значимых количеств ЛГ или чХГ. Может реализоваться и обратная ситуация. Функционирование таких комплексов имеет критическое значение для ФСГ-зависимых стадий фолликулогенеза, включая созревание антральных фолликулов. На этих стадиях число ЛГ/ХГ-Р и концентрация ЛГ в крови очень низкие и недостаточны для эффективного синтеза андрогенов. В то же время, андрогены являются прекурсорами для эстрогенов, значительные количества которых необходимы для роста и развития антрального фолликула [144]. На ранних стадиях развития антрального фолликула тека-клетки, которые экспрессируют ЛГ/ХГ-Р и продуцируют андрогены, еще не в полной мере дифференцированы от клеток гранулезы, которые не являются ЛГ-компетентными. Предполагают, что на преантральной стадии фолликулогенеза существуют клетки, которые наделены свойствами и клеток теки, и гранулезных клеток, обогащены ФСГР и экспрессируют лишь небольшие количества ЛГ/ХГ-Р [91]. Поскольку экспрессия ЛГ/ХГ-Р и уровень ЛГ на преантральной стадии не достаточны для обеспечения синтеза такого количества андрогенов, которое необходимо для поддержания высокого уровня эстрогенов, то за ЛГ-подобные эффекты могут отвечать гетерокомплексы, функционирующие по описанному выше принципу ФСГ-индуцированной транс-активации ЛГ/ХГ-Р [23, 27, 47, 70, 75, 82].

В пользу функционирования ФСГР–ЛГ/ХГ-Р гетероди(олиго)меров свидетельствуют следующие факты. У женщин с инактивирующими мутациями в гене β-ЛГ фолликулогенез до стадии антрального фолликула протекает нормально, и это сопровождается нормальным уровнем андрогенов и эстрогенов [3, 102]. В 1990-е гг. были получены данные, что препараты ФСГ вызывают рост и созревание фолликулов и образование желтых тел у гипофизэктомированных крыс и мышей [128], причем нокаут гена, кодирующего ЛГ/ХГ-Р, предотвращал эти эффекты ФСГ [99]. Тем самым, на ранних стадиях развития антрального фолликула ЛГ/ХГ-Р в большей степени, чем гонадотропины с ЛГ-активностью, необходим для поддержания андрогенного статуса, обеспечивающего нормальное протекание фолликулогенеза [23].

Образование гетерокомплексов ФСГР–ЛГ/ХГ-Р было подтверждено с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии и других методов [47, 68, 75, 82]. Гетеродимер ФСГР–ЛГ/ХГ-Р был стабилизирован, в первую очередь, посредством взаимодействия внешних поверхностей ТМ5, ТМ6 и ТМ7, которые включают ряд аллостерических сайтов, контактирующих с липидной фазой мембраны. Эндогенными регуляторами аллостерических сайтов GPCR, контактирующих с липидной фазой мембраны, могут быть мембранные липиды, холестерин и фосфолипиды, что позволяет через изменение липидного состава мембраны влиять на активность рецепторов, а также на образование ими ди(олиго)мерных комплексов. С другой стороны, вовлечение аллостерических сайтов, расположенных на боковой поверхности ТМД, во взаимодействие между протомерами рецепторного комплекса не только меняет конформацию и подвижность ТМД и его интерфейсов с эктодоменом и ICL, но и экранирует сайты взаимодействия с мембранными липидами и другими гидрофобными молекулами, способными специфично связываться с такими сайтами. Это может лежать в основе взаимосвязи между физико-химическими и структурными особенностями липидного матрикса мембраны и функциональным состоянием GPCR.

Образование гетерокомплексов ФСГР–ЛГ/ХГ-Р влияет на предвзятость сигнальной трансдукции, ослабляя цАМФ-пути и усиливая фосфолипазные пути [47, 70]. Стимуляция гетеродимерных комплексов ФСГР–ЛГ/ХГ-Р с помощью ЛГ или чХГ и с помощью ФСГ приводит к значительному ослаблению стимулирующего АЦ сигнала [47] и при этом усиливает сигналы, осуществляемые через G_q/11-белки, опосредующие активацию PLСβ [70]. Последнее обусловлено тем, что при ассоциации лиганд-активированного ЛГ/ХГ-Р с ФСГР происходит реорганизация комплекса ЛГ–ЛГ/ХГ-Р–G_q/11-белок, обеспечивающая более эффективное проведение сигнала по этому пути [70]. Наряду с Gα_q/11-субъединицей, при гетеродимеризации ФСГР–ЛГ/ХГ-Р в ЛГ-индуцированную стимуляцию кальциевого сигналинга вовлечен и Gβγ-димер, причем его действие реализуется путем открытия кальциевых каналов плазматической мембраны, хотя не исключены и другие, независимые от Gβγ-димера, механизмы активации. В пользу значительного вклада внеклеточного Ca²⁺ в эффекты ЛГ в условиях ассоциации ЛГ/ХГ-Р с ФСГР свидетельствуют ослабление эффекта гонадотропина на кальциевый сигналинг при снижении концентрации Ca²⁺ во внеклеточном пространстве, а также ингибирующее влияние на этот эффект ингибиторов кальциевых каналов [70]. Тем самым, свободный от лиганда ФСГР является PAM для ЛГ-индуцированной стимуляции G_q/11-белка и одновременно с этим NAM для активации АЦ системы, демонстрируя свойства предвзятого аллостерического модулятора.

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ РЕГУЛЯТОРЫ ЛГ/ХГ-Р

Помимо ортостерического сайта, вовлеченного в высокоаффиное связывание гонадотропинов, в ЛГ/ХГ-Р имеются аллостерические сайты, локализованные в различных локусах молекулы, в том числе в верхней половине ТМД, которые при связывании ЛГ и чХГ остаются свободными [75, 110]. Внутри трансмембранного тоннеля ЛГ/ХГ-Р локализованы два аллостерических сайта – основной и модулирующий его активность [2, 60]. Первый сформирован внутренними поверхностями ТМ4, ТМ5, ТМ6 и ТМ7 [58, 79], в то время как второй образован ТМ1, ТМ2, ТМ3 и ТМ7 [2]. Оба сайта физически перекрываются между собой. Следствием этого является обеспечение широкого фармакологического диапазона аллостерической регуляции ЛГ/ХГ-Р. В процессе разработки низкомолекулярных лигандов трансмембранных аллостерических сайтов ЛГ/ХГ-Р выявлены наделенные как собственной активностью полные и инверсионнные агонисты, так и аллостерические модуляторы, которые по фармакологической активности могут быть отнесены к PAM и NAM [75, 110]. Наряду с этим выявлены аллостерические регуляторы с активностью аго-PAM [110].

Первые низкомолекулярные лиганды ЛГ/ХГ-Р были разработаны голландскими учеными в 2002 г., которые синтезировали производные тиено[2, 3-d]пиримидина (ТП) с активностью агонистов, в том числе наиболее активное соединение Org43553 [127]. В дальнейшем Org43553 стал прототипом для большого числа ТП c активностью аллостерических регуляторов ЛГ/ХГ-Р [8, 10, 35, 36, 88, 110, 112, 121, 122]. Нами была разработана серия ТП с активностью агонистов/аго-PAM ЛГ/ХГ-Р, в том числе наиболее активные in vivo соединения 5-амино-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)-4-(3-(никотинамидо)фенил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид (TP03) и 5-амино-N-трет-бутил-4-(3-(1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамидо)фенил)-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид (TP4/2) [8, 10, 35, 36, 38, 112].

При изучении Org43553 было показано, что оно специфично связывается с ЛГ/ХГ-Р (K_d, 2.4 нМ), причем в его присутствии связывание гонадотропинов с ортостерическим сайтом ЛГ/ХГ-Р и их стимулирующее влияние на АЦ сохраняется, что указывает на несовпадение локализации аллостерического и ортостерического сайтов [60]. Результатом связывания Org43553 с ЛГ/ХГ-Р была стимуляция АЦ и фактора CREB, хотя эффективность Org43553 была ниже таковой ЛГ [125]. Разработанные нами соединения TP01, TP03, TP4/2, TP21, TP23 и TP37 также стимулировали АЦ во фракциях плазматических мембран, выделенных из семенников и яичников крыс [7, 8, 10, 35, 36, 39, 112]. TP03 и TP4/2 при действии на первичные культуры клеток Лейдига грызунов повышали в них внутриклеточный уровень цАМФ и усиливали стероидогенез, что приводило к дозозависимому усилению продукции тестостерона [9, 112].

Org43553 и разработанные нами ТП, стимулируя активность АЦ, слабо влияли на G_q/11-белки и фосфолипазные пути [39, 112, 125]. Org43553 даже в сравнительно высоких концентрациях стимулировал PLСβ лишь на 33–37 %, что составляет менее 5% от соответствующего эффекта ЛГ [125]. Имеются основания полагать, что ТП также слабо влияют на активность β-аррестинов, о чем свидетельствуют отсутствие их эффекта на каскад MAPK и низкая интенсивность эндоцитоза ЛГ/ХГ-Р [125]. Даже при курсовом введении крысам ТП слабо влияют на экспрессию гена, кодирующего ЛГ/ХГ-Р, и на плотность ЛГ/ХГ-Р в клетках-мишенях, что предотвращает резистентность к действию эндогенных гонадотропинов с ЛГ-активностью [8–10].

Исследование комплекса Org43553 с трансмембранным аллостерическим сайтом ЛГ/ХГ-Р с помощью криоэлектронной микроскопии показало, что этот агонист занимает верхнюю часть образованного этим сайтом кармана. Морфолиновое кольцо Org43553 направлено наружу, к границе между шарнирной областью и внеклеточной частью ТМД, в то время как трет-бутиламинная группа направлена вглубь трансмембранного тоннеля. Сам аллостерический сайт включает АКО, принадлежащие спиралям ТМ3, ТМ5, ТМ6 и ТМ7, петлям ECL2 и ECL3 и граничащего с ТМ1 сегмента шарнирной области. Показана важность гидрофобных взаимодействий между Org43553 и аллостерическим сайтом ЛГ/ХГ-Р [41]. Используя методы гомологического моделирования и молекулярной динамики, нами были оценены параметры связывания TP4/2 и других разработанных ТП с ЛГ/ХГ-Р и показано, что гидрофобные взаимодействия играют определяющую роль в стабилизации комплекса низкомолекулярного агониста с трансмембранным аллостерическим сайтом, в то время как кулоновские взаимодействия и водородные связи менее значимы [8]. Как и в случае Org43553, 1-метил-1H-пиразол-4-ильная группа TP4/2 была направлена к внеклеточному входу в трансмембранный тоннель, а трет-бутиламинная группа – к центральной его части. Сниженная способность TP4/2 взаимодействовать с трансмембранным аллостерическим сайтом ТТГР хорошо согласуется с данными об отсутствии значимого влияния этого соединения и его аналогов на ТТГ-стимулированную активность АЦ в мембранах щитовидной железы и в условиях in vivo на уровни тиреоидных гормонов и экспрессию генов, ответственных за их синтез [6, 8, 39].

Крайне важно, что Org43553 и разработанные нами ТП активны не только in vitro, но и in vivo, причем они эффективны как при парентеральных, так и при пероральном способах введения [8, 10, 35, 36, 38, 39, 52, 121-123]. Сохранение активности при пероральном введении свидетельствует о хорошем всасывании ТП в желудочно-кишечном тракте и их высокой биодоступности при таком способе доставки. Одним из подходов для предотвращения осложнений терапии с помощью ЛГ или чХГ является снижение их дозы, но это приводит к ослаблению эффективности препаратов и недостижению требуемого эффекта. Нами и другими авторами продемонстрирована частичная аддитивность эффектов низких доз гонадотропинов и ТП на активность АЦ и продукцию тестостерона в условиях in vitro [39, 125]. Это позволило высказать гипотезу об их аддитивности и потенцировании в условиях in vivo. В подтверждение этого нами показано, что предобработка самцов крыс с помощью TP03 в дозах от 7.5 до 25 мг/кг почти в 2 раза повышала стероидогенный эффект чХГ и снижала его эффективную дозу, а также меняла чХГ-стимулированный паттерн экспрессии стероидогенных генов [111].

Наряду со взаимным влиянием ортостерического и аллостерического сайтов важную роль в эффекте потенцирования могут играть присущие аллостерическим агонистам ЛГ/ХГ-Р свойства низкомолекулярных шаперонов, что хорошо проявляется для мутантных форм рецептора со сниженной способностью к транслокации в плазматическую мембрану. Так, ЛГ/ХГ-Р с мутациями Ala⁵⁹³Pro и Ser⁶¹⁶Tyr в ТМД не способны к транслокации, остаются в эндоплазматическом ретикулуме, пребывая в неактивном состоянии, несмотря на способность связываться с ЛГ и чХГ. Org42599 с активностью ЛГ/ХГ-Р-агониста, трифторацетат Org 43553, восстанавливало активность мутантных ЛГ/ХГ-Р с заменами Ala⁵⁹³Pro и Ser⁶¹⁶Tyr [93]. Инкубация клеток, в которых были экспрессированы мутантные ЛГ/ХГ-Р, с Org42599 повышала экспрессию мутантного рецептора, долю ЛГ/ХГ-Р с правильной укладкой полипептидной цепи и подходящей топологией в мембране, увеличивала плотность ЛГ/ХГ-Р на поверхности клетки. Этот эффект был связан со способностью Org42599 проникать через плазматическую мембрану клеток Лейдига и специфично связываться с аллостерическим сайтом расположенного в ретикулярной мембране ЛГ/ХГ-Р, что обеспечивало правильную укладку рецептора и его транслокацию в мембрану [93]. Шапероноподобным эффектом ТП может быть опосредован не только их потенцирующий эффект на эффекты гонадотропинов, но и сохранение высокой эффективности ТП, как это показано нами для TP03, при стимуляции стероидогенеза у крыс с различными моделями сахарного диабета [8, 10].

Наряду с полными агонистами и(или) PAM, были разработаны аллостерические лиганды для ЛГ/ХГ-Р с активностью NAMs, нейтральных антагонистов и инверсионных агонистов, среди которых наибольший интерес представляют производные терфенила [59], тетрагидро-1,6-нафтиридина [136], пиримидо[4,5,6-de][1, 6]нафтиридина и пиридо[3,4-d]пиримидина [37], бензамида [5], а также дихлородифенилтрихлорэтана [90]. Эти препараты могут быть применены для лечения гормон-зависимых опухолей и для контрацепции, а также для коррекции гипергонадотропного гипогонадизма.

Помимо лигандов трансмембранного аллостерического сайта, перспективными являются лиганды цитоплазматических аллостерических сайтов, включающих в качестве молекулярных детерминант участки, вовлеченные во взаимодействие ЛГ/ХГ-Р с G-белками и β-аррестинами. В качестве таких лигандов могут использоваться синтетические пептиды, соответствующие участкам ICL2, ICL3 и проксимальному сегменту С-хвостового домена ЛГ/ХГ-Р. Основываясь на том, что С-концевая половина ICL3 участвует во взаимодействии с G_s-белком, что косвенно указывает на ее перекрывание и(или) взаимодействие с внутриклеточным аллостерическим G_s-компетентным сайтом, нами был синтезирован и исследован пальмитоилированный с С-конца пептид NKDTKIAKK-Nle-A(562–572)-K(Pal)A, который соответствовал участку 562–572 ЛГ/ХГ-Р [40, 113, 114]. В условиях in vitro в микромолярных концентрациях он повышал активность АЦ и ГТФ-связывание в тестикулярных мембранах, а при интратестикулярном введении самцам крыс стимулировал у них тестикулярный стероидогенез и повышал продукцию тестостерона [40, 113]. При этом он в значительной степени ингибировал стимулирующие эффекты чХГ на активность АЦ системы in vitro и на продукцию тестостерона in vivo, что указывает на его фармакологический профиль, как PAM-антагониста [40, 113]. Следует, однако, отметить, что при подкожном и внутривенном введении пептид 562–572 ЛГ/ХГ-Р имел низкую стабильность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процесе эволюции позвоночных, наряду с усложнением механизмов регуляции репродуктивных функций, происходило повышение сложности и гибкости управления этими механизмами, в том числе на уровне сигнальной системы, регулируемой гонадотропинами с ЛГ-активностью. Для повышения информационной емкости ЛГ-системы, расширения спектра сигнальных каскадов и эффекторных белков, активируемых гонадотропинами, а также для обеспечения таргетности ЛГ-сигналинга и его тонкой настройки в конкретных физиологических условиях реализовывались сразу несколько стратегий. Одни из них состояли в изменении структуры гонадотропинов с ЛГ-активностью, без существенного изменения структуры связывающего сайта. С этой целью на уровне генома генерировались различные формы гонадотропинов, которые у человека и некоторых приматов представлены двумя молекулами – ЛГ и ХГ, а также варьировался их статус гликозилирования. Тем самым, не только достигались требуемые в определенных физиологических условиях эффективность и предвзятость гонадотропин-индуцированной сигнальной трансдукции, но и обеспечивались дополнительные уровни ее регуляции. Другие стратегии состояли в “гонадотропин-независимом” влиянии на конформационные характеристики рецептора и его способность взаимодействовать с гонадотропином, и эти стратегии основаны исключительно на аллостерических механизмах. И наиболее важным здесь было комплексообразование ЛГ/ХГ-Р – как его гомоди(олиго)меризация, так и образование гетерокомплексов с ФСГР. Образование рецепторных комплексов может приводить к ослаблению или даже предотвращению гонадотропинового сигнала (гомодимеризация ЛГ/ХГ-Р) или влиять на его предвзятость. В случае ЛГ/ХГ-Р–ФСГР-гетерокомплекса, вследствие транс-активации, реализуется запуск ЛГ-зависимых внутриклеточных каскадов с помощью ФСГ. Совмещение аллостерических эффектов образования ЛГ/ХГ-Р-комплексов на ЛГ-сигналинг с таковыми различных комбинаций гонадотропиновых субъединиц и их гликоформ приводит, с одной стороны, к еще большему разнообразию потенциальных эффектов гонадотропинов в клетке-мишени, и, с другой стороны, позволяет тонко регулировать избирательность и интенсивность гормонального сигнала, что имеет решающее значение для разработки препаратов с ЛГ-активностью с целью их применения в репродуктивной медицине. Присутствие в молекуле ЛГ/ХГ-Р аллостерических сайтов, локализованных в ТМД и в ICL, создает хорошие предпосылки для создания низкомолекулярных аллостерических регуляторов ЛГ/ХГ-Р с широким спектром фармакологической активности, что в настоящее время реализуется в ходе разработки ТП, лигандов трансмембранного аллостерического сайта ЛГ/ХГ-Р.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-75-20122 и его продолжение № 23-75-31003).

 

Сокращения: АКО – аминокислотный остаток; ЛГ – лютеинизирующий гормон; ЛГ/ХГ-Р – рецептор ЛГ/ХГ; ТМ – трансмембранный участок; ТМД – трансмембранный домен; ТП – тиено[2, 3-d]пиримидиновое производное; ФСГ-Р – рецептор фолликулостимулирующего гормона; ХГ – хорионический гонадотропин; чХГ – ХГ человека; ARF6 – АДФ-рибозилирующий фактор 6; BAM – предвзятый аллостерический модулятор; ECL – внеклеточная петля; GalNAc – сульфатированный N-ацетилгалактозамин; GPCR – G-белок-сопряженный рецептор; GRK – специфичная для GPCR рецепторная киназа; ICL – цитоплазматическая петля; MAPK – митоген-активируемые протеинкиназы; NAM – негативный аллостерический модулятор; PAM – положительный аллостерический модулятор; PDE – фосфодиэстераза; TGFβ – рецептор трансформирующего фактора роста-β; TP03 – 5-амино-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)-4-(3-(никотинамидо)фенил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид; TP4/2 – 5-амино-N-трет-бутил-4-(3-(1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамидо)фенил)-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид.

Sobre autores

A. Shpakov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: alex_shpakov@list.ru
Rússia, St. Petersburg, 194223

K. Derkach

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: derkatch_k@list.ru
Rússia, St. Petersburg, 194223

Bibliografia

Arquivos suplementares