Характеристика эритрона головной почки и циркулирующей крови камбалы-глоссы (Platichthys flesus) на протяжении годового цикла

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Кислородная емкость крови костистых рыб в значительной степени определяет уровень окислительных процессов в их тканевых структурах. Она зависит в основном от числа циркулирующих эритроцитов. Показано (Joshi, 1989; Al-Hassan et al., 1990), что эта величина непостоянна и претерпевает периодические изменения на протяжении годового цикла. Этот факт допускает возникновение ряда критических состояний, связанных, прежде всего, с развитием тканевой гипоксии гемического типа (Soldatov, 2012). Природе их возникновения посвящена серия работ. Допускается влияние температурного фактора, который способствует или ограничивает пролиферативную активность эритроидного ростка гемопоэза (Sharma, Joshi, 1985; Joshi, 1989). Однако прямая зависимость процессов эритропоэза от температуры показана не во всех работах (Al-Hassan et al., 1990; Mahoney, McNulty, 1992). Рост числа эритроцитов в крови рыб наблюдали и в условиях низких температур. Изучение продолжительности жизни ядерных эритроцитов рыб показало, что она достигает 270–310 сут (Золотова, 1989; Fischer et al., 1998). Это позволяет предположить, что у костистых рыб происходит разовая генерация эритроидных клеток гемопоэтической тканью на протяжении годового цикла. Факторы, ее определяющие, остаются открытыми.

Нерегулярность эритропоэтических процессов в гемопоэтической ткани, по-видимому, является основной причиной изменения числа циркулирующих эритроцитов в крови костистых рыб на протяжении года. Основные факторы, усиливающие генерацию эритроидных форм в гемопоэтической ткани, – эритропоэтины. Данные соединения идентифицированы у рыб при помощи методов иммунохимического анализа (Chu et al., 2008; Kondera, 2019). Их продукция осуществляется передними почками, они же являются и основным органом эритропоэза (Kulkeaw, Sugiyama, 2012; Witeska, 2013). Выработка эритропоэтинов, в свою очередь, индуцируется гипоксией (Lai et al., 2006; Sarrimanolis et al., 2020). Это состояние у рыб может возникать в период нереста, когда происходит перераспределение пластических ресурсов в пользу генеративной ткани (Shulman, Love, 1999). В этом прямое участие принимает кровь на фоне развития анемичного состояния (Jawad et al., 2004). Показана также чувствительность эритроидного ростка к содержанию половых гормонов в плазме крови рыб (инъекции вытяжек гипофиза карпа, гонадотропина, эстрогена, тестостерона, релизинг-факторов) (Ochiai et al., 1975; Hilge, Klinger, 1978; Pottinger, Pickering, 1987).

Анализ клеточного состава крови и передних почек (пронефроса) показал присутствие значительного числа малодифференцированных эритроидных форм в постнерестовый период, что подтверждает активную генерацию клеток эритроидного ряда именно в период нереста (Andreyeva et al., 2017). Об этом же свидетельствуют данные авторадиографии (включение ³Н-тимидина) (Солдатов, 2005). В остальные периоды годового цикла уровень незрелых эритроидных клеток был существенно ниже. Эта закономерность показана в основном на теплолюбивых видах (Солдатов, 2005; Andreyeva et al., 2017). Для сравнения целесообразно было бы выполнить исследования на холодолюбивых видах, нерест которых приурочен к низким температурам. Предварительные результаты получены для камбалы–глоссы (Platichthys flesus L., 1758), которые в целом подтверждают рассмотренную выше закономерность (Soldatov, 2023). В настоящей работе приводится расширенная информация о клеточном составе крови и пронефроса у этого же вида на протяжении годового цикла.

Цель работы – исследовать клеточный состав эритроидных элементов крови и головной почки у камбалы-глоссы (Platichthys flesus) и соотнести его с изменением числа эритроцитов в крови на протяжении годового цикла.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была холодолюбивая камбала-глосса P. flesus, которая нерестится в феврале–марте. Рыбу отлавливали при помощи ставного невода на протяжении года в районе Керченского пролива. Использовали взрослых особей обоих полов: длина тела – 17.5–27.0 см, масса – 105–328 г.

Рыбу перевозили в пластиковых баках емкостью 100 л с воздушной аэрацией. После транспортировки ее размещали в аквариумы при плотности посадки ≥10 л на особь и выдерживали в данных условиях в течение 5–7 сут. Считается, что этого времени достаточно для снятия состояния манипуляционного стресса (Ribera et al., 1989). Особей кормили фаршем из малоценных видов рыб, суточный рацион составлял 6–7% массы тела. В работе использовали активно питающихся, подвижных особей.

Кровь получали пункцией хвостовой артерии. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (Рихтер, Венгрия). Для получения образцов передней почки (пронефроса) вскрывали брюшную полость. Затем изготавливали мазки крови и отпечатки передней почки, которые окрашивали по комбинированному методу Паппенгейма (Май–Грюнвальд + Романовский–Гимза) (Houston, 1990). Перед отбором проб применяли уретановую анестезию. Уретан растворяли в воде аквариумов за 60–70 мин до отлова. Эффективные дозы для камбалы-глоссы были определены ранее (Soldatov, 2005a).

Число эритроцитов в крови подсчитывали в камере Горяева (Houston, 1990). На гистологических препаратах определяли относительное содержание незрелых эритроидных форм, находящихся на разных стадиях созревания: ЭБ, БН и ПН нормобластов. Относительное содержание незрелых эритроидных форм для цельной крови рассчитывали с учетом числа зрелых эритроцитов, для головной почки – с учетом клеточных форм всех ростков гемопоэза. Объем выборочных совокупностей был 5000 клеток. В работе применяли светооптический микроскоп Biomed PR-2 Lum (Россия), оборудованный камерой Levenhuk C NG Series (Китай).

При проведении сравнительного анализа использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) PAST v. 4.09 (Hammer, Harper, 2006). Нормальность распределения выборочных совокупностей проверяли по Shapiro–Wilk (W-test). Статистические сравнения проводили на основе непараметрического критерия Mann–Whitney. Минимальный уровень значимости р был < 0.05. Объем выборочных совокупностей приведен на графиках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки эритроидного ряда камбалы-глоссы в процессе созревания и дифференцировки представлены на рис. 1. Наименее зрелыми, способными к активной пролиферации, являются ЭБ (рис. 1а). Это относительно крупные округлые клетки с ядром нежно сетчатой структуры, занимающим почти весь их объем. Цитоплазма резко базофильная, представлена в виде узкой полосы. БН сохраняют округлую форму (рис. 1б). Ядро более компактное. Доля эухроматина снижена. Отличительная черта – наличие хорошо развитой перинуклеарной зоны. Цитоплазма базофильная, но окраска менее интенсивная, чем у ЭБ, т. е. содержание в ней нуклеиновых кислот снижено. Ранние БН способны к пролиферации. ПН приобретают эллипсоидную форму, свойственную зрелым эритроцитам (рис. 1в). По сравнению с клетками функционального пула, ядро у них более крупное. Цитоплазма имеет серую окраску, что свидетельствует о присутствии в ней одновременно нуклеиновых кислот и молекул гемоглобина, обладающего ацидофильными свойствами. Пролиферативная активность у данных клеточных форм не выражена.

 

Рис. 1. Эритроидные элементы крови и головной почки камбалы-глоссы: a – ЭБ; б – БН; в – ПН (показаны стрелкой).

 

На рис. 2 представлены полигоны распределения значений общего числа незрелых эритроцитов и отдельных эритроидных форм в пронефросе и крови камбалы-глоссы, полученные на протяжении годового цикла. Очаг эритропоэза в пронефросе камбалы-глоссы достигал максимальных размеров в марте–июле (90–210 сут). На незрелые эритроидные формы приходилось 11–17% клеточной массы отпечатка. Эритроидный росток представляли в основном ЭБ и БН. При этом максимальное число ЭБ в гемопоэтической ткани наблюдали в более ранний период годового цикла: март–апрель (90–120 сут). Уровень ПН был минимален (≤2% клеточной массы). В циркулирующей крови популяцию незрелых эритроцитов представляли ПН и БН. Максимум их содержания в основном приходился на май–июль (150–210 сут). В этот период уровень незрелых эритроидных форм достигал 4–6% общего числа клеток красной крови.

 

Рис. 2. Содержание незрелых эритроидных форм в пронефросе и крови камбалы-глоссы на протяжении годового цикла (полигоны распределения): а – общее содержание незрелых эритроидных форм в пронефросе и крови; б – содержание отдельных незрелых эритроидных форм в пронефросе; в – содержание отдельных незрелых эритроидных форм в крови; по оси абсцисс – нулевая точка соответствует началу календарного года.

 

Для оценки статистической значимости выявленных различий выборочные совокупности ранжировали с шагом в 3 мес. Учитывали состояния, которые претерпевает организм камбалы-глоссы на протяжении годового цикла: январь–март (нерестовый период), апрель–июнь (постнерестовый период), июль–сентябрь (относительный функциональный покой), октябрь–декабрь (преднерестовый период). Результаты расчетов представлены на рис. 3. Максимальный уровень незрелых эритроидных форм в пронефросе отмечали у особей камбалы-глоссы в постнерестовый период. По сравнению с нерестовым и преднерестовым состояниями различия были в 1.7–2.5 раза (p <0.001). Аналогичные результаты получены и в отношении циркулирующей крови. Уровень незрелых эритроидных форм в постнерестовый период в 4.5–6.5 раз (р <0.001) превышал таковой в преднерестовый и нерестовый периоды. Изменение числа зрелых эритроцитов в крови камбалы-глоссы на протяжении годового цикла в целом совпадало с активностью эритроидного ростка гемопоэза. Максимальные значения были отмечены в июле–сентябре (1.43 ± 0.16 кл. × 10⁶/мкл), минимальны – в январе–марте (0.97 ± 0.10 кл. × 10⁶/мкл). Различия достигали 47–48% (р <0.001). Это позволяет допустить, что последнее связано с периодическим смещением эритроцитарного баланса в пользу продукционных или деструктивных процессов.

 

Рис. 3. Уровень незрелых эритроидных форм в пронефросе (a), крови (б) и число циркулирующих эритроцитов в крови (в) у камбалы-глоссы на протяжении годового цикла (ранжирование с шагом 3 мес). 1 – нерестовый период, 2 – постнерестовый период, 3 – относительный функциональный покой, 4 – преднерестовый период, * – достоверно (при p <0.001).

 

Для оценки влияния эритропоэтических процессов на динамику числа эритроцитов в крови камбалы-глоссы проведен корреляционный анализ в отношении систем: “незрелые эритроциты пронефроса – число эритроцитов в крови”, “незрелые эритроциты крови – число эритроцитов в крови” (рис. 4). В первом случае зависимость описывали уравнением логарифмической функции при коэффициенте детерминации (R²) 0.608, во втором – использовали уравнение экспоненциальной функции при R² 0.991. Более низкая степень зависимости величин в первом случае, по-видимому, определяется тем, что активация эритроидного ростка гемопоэза и прирост числа эритроцитов в крови разнесены во времени. Первая переменная на 2–3 мес опережает вторую, что видно из графика. Максимум числа незрелых эритроидных элементов в пронефросе наблюдается в апреле–июне, тогда как число эритроцитов в крови достигает высоких значений только в июле–сентябре.

 

Рис. 4. Корреляционные отношения для систем: а – “незрелых эритроцитов пронефроса – число эритроцитов в крови”, б – “незрелых эритроцитов крови – число эритроцитов в крови”.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Из представленных данных следует, что активная генерация клеток красной крови гемопоэтической тканью у камбалы-глоссы происходила в постнерестовый период (апрель–июль). Об этом свидетельствовал размер очага эритропоэза в передней почке и содержание незрелых эритроидных форм в циркулирующей крови. В остальной период времени эта функция подавлялась. В состоянии эритроидного ростка гемопоэза можно выделить ряд последовательных изменений: рост популяции ЭБ в пронефросе (март–апрель) → повышение числа БН в пронефросе (апрель–июнь) → увеличение числа БН и ПН в крови (май–июль). Следует отметить, что в кровоток поступают в основном эритроидные формы, утратившие способность к пролиферации: поздние БН и ПН. Пролиферирующий пул клеток (ЭБ и ранние БН), напротив, удерживаются стромой пронефроса (Soldatov, 2005b; Witeska, 2013).

Разовая генерация клеток эритроидного ряда совпадала с увеличением числа эритроцитов в периферическом русле. Ранее аналогичные результаты получены для типично теплолюбивого вида кефали–сингиля (Солдатов, 2005). В отличие от камбалы-глоссы, нерест кефали–сингиля протекает в летне-осенний период, что также свидетельствует об отсутствии прямой связи процессов гемопоэза с температурой среды.

Известно, что характер организации системы красной крови у костистых рыб во многом совпадает с высшими позвоночными (Soldatov, 2005b; Witeska, 2013). В ней имеется продукционное звено, представленное преимущественно головными почками (пронефрос) (El-Saydah et al., 2010). Роль терминального звена выполняет селезенка (Soldatov, 2005b; Sales et al., 2017). Здесь накапливается в основном старая эритроцитарна масса, которая подвергается деградации (процессы эритродиереза). Она же выполняет функцию депо крови. Принципиальное отличие заключается в отсутствии баланса между этими двумя процессами, что приводит к периодическим изменениям кислородной емкости крови у рыб на протяжении годового цикла. Это показано в серии исследований, рассмотренных выше, и настоящая работа не является исключением.

По-видимому, причину следует искать в особенностях организации клеток функционального пула. У рыб они представлены ядерными эритроцитами (Soldatov, 2005b; Witeska, 2013). Это относительно крупные клетки, имеющие эллипсоидную форму. Их продольная ось может достигать 15–17 мкм (Soldatov, 2005b). Цитоплазма сравнительно хорошо структурирована (Jagoe, Welter, 2011). В ней присутствуют митохондрии, что отражает способность к аэробному метаболизму (Jagoe, Welter, 2011). Подобный характер организации позволяет эритроцитам рыб длительный период времени находиться в системе циркуляции. Это подтверждают данные о продолжительности их жизни. С помощью методов авторадиографии и использования флуоресцентных зондов она определена в 270–310 сут (Золотова, 1989; Fischer et al., 1998). Это существенно выше, чем у млекопитающих, поэтому разовая генерация эритроцитов у костистых рыб на протяжении годового цикла вполне оправдана.

К факторам, индуцирующим эритропоэз у рыб на протяжении годового цикла, следует отнести выработку эритропоэтинов, лизис старых эритроцитов на момент нереста, действие половых гормонов и ряд других. Выработке эритропоэтинов обычно предшествует развитие гипоксического состояния. В период нереста оно наиболее вероятно. В преднерестовый период в крови находится в основном старая эритроцитарная масса. В клетках усиливаются процессы перекисного окисления липидов (Phillips et al., 2000), часть гемоглобина переходит в окисленное состояние ввиду низкой эффективности NADH-диафоразы. Рост содержания метгемоглобина в преднерестовый период выявлен и у камбалы-глоссы (Солдатов, 2023). Старые эритроциты задерживаются селезенкой, где подвергаются деградации. Это должно приводить к снижению числа клеток красной крови в системе циркуляции, что и имело место. В период нереста в организме происходит и перераспределение пластических ресурсов в пользу генеративной ткани (Shulman, Love, 1999). В этом активное участие принимает кровь. У ряда видов костистых рыб в этот период отмечают развитие анемии (Jawad et al., 2004). На снижение числа эритроцитов в крови могут влиять и половые гормоны, титры которых повышаются в плазме крови в преднерестовый период. Об этом свидетельствуют эксперименты с инъекцией вытяжек гипофиза карпа, гонадотропина, эстрогена, рилизинг-факторов (Ochiai et al., 1975; Hilge, Klinger, 1978). Из приведенных выше фактов следует, что в преднерестовый период у рыб должно развиваться состояние гипоксии преимущественно гемической природы (анемия).

Анемичные состояния повышают выработку HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1-alpha) (Zinkernagel et al., 2007). Это соединение является субъединицей гетеродимерного фактора транскрипции эритропоэтина. Оно идентифицировано и у костистых рыб (Lai et al., 2006). HIF-1α индуцирует выработку эритропоэтина. Последний усиливает пролиферативную активность колониеобразующих единиц (КОЕ-Э) – эритробластов (Obeagu, 2015). Это смещает эритроцитарный баланс в пользу продукционных процессов. Эритропоэтины идентифицированы в крови рыб при помощи методов иммунохимического анализа (Wickramasinghe, 1993). Наиболее высокая их концентрация обнаружена в почках (Moritz et al., 1997; Lai et al., 2006). Для бурого фугу (Takifugu rubripes, Temminck & Schlegel, 1850) аннотирована полная структура гена данного соединения (Chou et al., 2004). Обнаружена также положительная связь между уровнем тестостерона в плазме крови и продукцией эритропоэтина в почках рыб (Pottinger, Pickering, 1987).

Таким образом, нерест вызывает наиболее радикальные изменения в крови и гемопоэтической ткани. По-видимому, преднерестовая анемия является ключевым фактором, индуцирующим продукцию эритропоэтинов и генерацию эритроцитов в гемопоэтической ткани рыб на протяжении годового цикла. Это наиболее масштабный процесс, который не исключает иные адаптивные реакции кроветворной ткани на факторы среды и состояния организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эритрон пронефроса камбалы-глоссы был представлен ЭБ и БН. Максимальный размер эритроидного очага гемопоэза в пронефросе отмечен в постнерестовый период (апрель–июль). На него приходилось до 17% клеточной массы отпечатков. Содержание ПН терминальной стадии клеточной дифференцировки невелико. В крови, помимо клеток функционального пула, в основном преобладали БН и ПН, не способные к пролиферации. Максимальное содержание этих клеточных форм регистрировали тоже в постнерестовый период. Клетки более ранних генераций (ЭБ) в крови не обнаружены. Рост продукции эритроидных клеток гемопоэтической тканью совпадал с увеличением числа циркулирующих эритроцитов в крови, что свидетельствовало о смещении эритроцитарного баланса в системе красной крови в пользу продукционных процессов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Данная работа финансировалась за счет средств, полученных в рамках проекта (гранта) РНФ № 23-24-00061.

Об авторах

А. А. Солдатов

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Российской академии наук; Севастопольский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: alekssoldatov@yandex.ru
Россия, Севастополь; Севастополь

И. А. Парфенова

Севастопольский государственный университет

Email: alekssoldatov@yandex.ru
Россия, Севастополь

Т. А. Кухарева

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Российской академии наук

Email: alekssoldatov@yandex.ru
Россия, Севастополь

Н. Е. Шалагина

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Российской академии наук

Email: alekssoldatov@yandex.ru
Россия, Севастополь

В. Н. Рычкова

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Российской академии наук

Email: alekssoldatov@yandex.ru
Россия, Севастополь

Список литературы

Дополнительные файлы