Li +  Ions Accumulation Triggers  FOS ,  JUN ,  EGR1 ,  MYC  Transcription Alteration in LiCl-Treated Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

O. E. Kvitko; Квитко О. Е.; D. A. Fedorov; Федоров Д. А.; S. V. Sidorenko; Сидоренко С. В.; O. D. Lopina; Лопина О. Д.; E. A. Klimanova; Климанова Е. А.

doi:10.31857/S0320972524100091

Li⁺ Ions Accumulation Triggers FOS, JUN, EGR1, MYC Transcription Alteration in LiCl-Treated Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Authors: Kvitko O.E.¹, Fedorov D.A.¹, Sidorenko S.V.¹, Lopina O.D.¹, Klimanova E.A.¹
Affiliations:
1. Lomonosov Moscow State University
Issue: Vol 89, No 10 (2024)
Pages: 1744-1751
Section: Regular articles
URL: https://journal-vniispk.ru/0320-9725/article/view/280914
DOI: https://doi.org/10.31857/S0320972524100091
EDN: https://elibrary.ru/IOYVJO
ID: 280914

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Changes in the intracellular concentrations of Na⁺ and K⁺ are shown to alter gene expression. Another monovalent cation, Li⁺, is well known as medicine for the treatment of psychiatric disorders but mechanism of its action is obscure. Thus, it is important to evaluate an effect of Li⁺ on gene expression in endothelial cells. Here we studied the influence of increased intracellular Na⁺ or Li⁺ concentrations on the transcription of Na⁺_i/K⁺_i-sensitive genes. A treatment of human endothelial cells (HUVEC) with LiCl for 1.5 h caused an accumulation of Li⁺ in the cells. This was followed by an increase in FOS and EGR1 mRNA and a decrease in JUN and MYC mRNA levels. Treatment of HUVEC with monensin led to an accumulation of Na⁺ and a loss of K⁺ ions. However, Na⁺-ionophore monensin had no significant effect on gene expression. Incubation of HUVEC with elevated extracellular NaCl concentration increased intracellular K⁺ concentration and ATF3 transcription and decreased JUN transcription. These results indicate that Na⁺ and Li⁺ ions have different effects on the cellular gene expression profile that apparently due to various actions on the intracellular monovalent cations ratio.

Keywords

lithium, sodium, Na+/K+-sensitive genes, monensin, endothelial cells

Full Text

Принятые сокращения: HUVEC – эндотелиальные клетки пупочной вены человека.

ВВЕДЕНИЕ

Клетки животных строго поддерживают градиент одновалентных катионов Na⁺ и K⁺ через плазматическую мембрану, в основном за счёт активности Na,K-АТPазы. Этот градиент имеет решающее значение для регуляции клеточных функций, таких как поддержание объёма клетки и внутриклеточного рН, вторичный транспорт ионов и метаболитов, формирование мембранного потенциала, активность ферментов и процессы трансляции [1]. Однако при некоторых физиологических и патологических состояниях наблюдаются изменения внутриклеточной концентрации этих катионов, которые влияют на экспрессию генов [2]. К числу таких генов принадлежат так называемые Na⁺_i/K⁺_i-чувствительные гены, экспрессия которых изменяется в ответ на изменение концентрации одновалентных катионов независимо от ионов Ca²⁺. К ним относятся гены, кодирующие различные транскрипционные (FOS, JUN, EGR1, ATF3 и др.) и провоспалительные (IL6 и PTGS2) факторы [3]. Было обнаружено, что количество и уровень экспрессии дифференциально экспрессируемых генов напрямую связаны с величиной соотношения Na⁺_i/K⁺_i [4]. В связи с этим возникает вопрос о существовании внутриклеточного молекулярного сенсора одновалентных катионов. Одним из возможных механизмов влияния одновалентных катионов на экспрессию генов является формирование G-квадруплексов и изменение их конформации в результате взаимодействия с ионами металлов [5, 6]. G-Квадруплексы – это неканонические вторичные структуры, образующиеся в гуанин-богатых областях нуклеиновых кислот [7]. G-Квадруплексы связывают одновалентные катионы, причём способность катионов различных металлов стабилизировать G-квадруплексы уменьшается в порядке K⁺ > > Rb⁺ > Na⁺ > Li⁺ [8]. Классическим примером гена, транскрипция которого контролируется G-квадруплексом в промоторной области, является ген транскрипционного фактора c-Myc [9]. Кроме того, наличие G-квадруплексов предсказано в промоторах генов FOS [10], JUN, EGR1 [7]. До сих пор препараты, содержащие ионы Li⁺, являются одними из основных фармакологических средств, используемых в лечении психических расстройств. Попадая в плазму крови, они в первую очередь влияют на метаболизм эндотелиальных клеток [11]. В данном исследовании была изучена взаимосвязь между влиянием ионов Na⁺ и Li⁺ на транскрипцию генов FOS, JUN, EGR1, ATF3, MYC, PTGS2 и изменением внутриклеточного содержания одновалентных катионов в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Первичная культура HUVEC и среда для выращивания эндотелиальных клеток были приобретены у компании «Cell Applications» (Калифорния, Сан-Диего, США), среды DMEM и F12, L-глютамин – у «ПанЭко» (Россия). Монензин, FBS, LiCl и Trizol были приобретены у «Thermo Fisher Scientific» (США), NaCl и KCl – у «MP Biomedicals» (США), ТХУ (трихлоруксусная кислота) – у «Диа-М» (Россия), MgCl₂ – у «Honeywell Fluka» (Германия). Планшеты, культуральные флаконы и серологические пипетки были приобретены у компании «Corning» (США). Набор ZymoResearch Quick-RNA Microprep был получен от «ZymoResearch» (США), набор ImProm-IITM Reverse Transcription System – от «Promega» (США), набор R-402 для ПЦР с Taq-полимеразой в присутствии красителя SYBR Green I – от «Синтол» (Россия).

Методы. Культура клеток. HUVEC, культивировавшиеся менее 3 пассажей, были получены от компании «Cell Applications» (#200-05n). Клетки высевали с плотностью ~ 6 × 10⁴ клеток на лунку в 6-луночные планшеты, содержащие среду для роста эндотелиальных клеток (#211-500, «Cell Applications»), и выдерживали при 37 °C в увлажнённой атмосфере с 5% CO₂. Через 3–5 дней после посева клетки достигали 80–90%-ной конфлюэнтности, после чего их повторно культивировали в среде DMEM:F12, содержащей 0,2% FBS, 4 мМ L-глутамина и стрептомицин-пенициллин, в течение 6 ч. После этого клетки инкубировали в аналогичной среде с добавлением 40 мМ NaCl, 40 мМ LiCl или 0,5–2 мкг/мл монензина в течение 1,5 ч.

Измерение внутриклеточного содержания Na⁺, Li⁺, K⁺. Подготовку образцов проводили на льду. Лунки планшетов трижды промывали холодным раствором 0,1 М MgCl₂. После этого в лунки добавляли 5%-ный раствор ТХУ и инкубировали при +4 °C в течение 1–2 ч. Полученные преципитаты центрифугировали при 18 000 g в течение 40 мин. Супернатант собирали в отдельные пробирки и использовали для измерения внутриклеточного содержания Na⁺, Li⁺ и K⁺ методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии на спектрометре «Квант-2м1» («Кортек», Россия) в пропано-воздушной смеси в соответствии с инструкцией. Для калибровки использовали растворы KCl (0,5–4 мг/л K⁺), LiCl (0,25–4 мг/л Li⁺) и NaCl (0,5–2 мг/л Na⁺) в 5%-ном растворе ТХУ. Осадки растворяли в 0,1 М NaOH, содержащем 0,1% дезоксихолата натрия, концентрацию белка определяли методом Лоури [12]. Содержание внутриклеточных ионов нормировали на общее содержание белка в образце.

Выделение РНК и обратная транскрипция. Выделение РНК проводили с помощью набора ZymoResearch Quick-RNA Microprep. Лунки промывали ледяным раствором 0,1 М MgCl₂, затем добавляли 400 мкл реагента Trizol. Водную фазу, содержащую тотальную РНК, выделяли из полученных лизатов с помощью хлороформа и 96%-ного этанола. Дальнейшую очистку РНК и обработку ДНК проводили на колонках Quick-RNA Microprep Kit в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК в полученных элюатах определяли с помощью прибора NanoVue («VWR International», США) при длине волны 260 нм, а чистоту препаратов оценивали по соотношению A260/A280. Обратную транскрипцию проводили с помощью набора ImProm-IITM Reverse Transcription System в соответствии с инструкциями производителя.

ПЦР в реальном времени. Комплементарную ДНК (кДНК), синтезированную методом обратной транскрипции, использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 («BioRad», США). Изолированную РНК, не подвергавшуюся обратной транскрипции, использовали в качестве отрицательного контроля. Для контроля загрязнения реагентов использовали реакционную смесь, содержащую воду в объёме, равном объёму добавленной кДНК. Образцы содержали прямой и обратный праймеры («Синтол») в концентрации 200 нМ и кДНК в количестве 60 нг. ПЦР проводили по протоколу, описанному ранее [13]. Уровень экспрессии исследуемых генов оценивали методом ΔΔCt [14], используя RPS18 в качестве референсного гена. Последовательности праймеров, использованных в работе, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в работе

Символ гена	Название гена	Размер ПЦР-продукта, п.о.	Номер мРНК-последовательности в базе данных GenBank	Последовательности праймеров
RPS18	Ribosomal protein S18	205	NM_022551.3	F: 5′-ATTAAGGGTGTGGGCCGAAG-3′ R: 5′-TGGCTAGGACCTGGCTGTAT-3′
FOS	Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit	154	NM_005252.4	F: 5′-GCAAGGTGGAACAGTTATCTC-3′ R: 5′-GCAGACTTCTCATCTTCTAGTTG-3′
EGR1	Early growth response factor 1	291	NM_001964.3	F: 5′-CAGTGCCATCCAACGACAG-3′ R: 5′-ACAGAGGGGTTAGCGAAGG-3′
JUN	Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit	109	NM_002228.4	F: 5′-GGCTACAGTAACCCCAAGATCC-3′ R: 5′-AGGTGAGGAGGTCCGAGTTC-3′
ATF3	Activating transcription factor 3	119	NM_001674.4	F: 5′-GAGGCGACGAGAAAGAAATAAG-3′ R: 5′-CCTTCAGTTCAGCATTCACAC-3′
MYC	Myc proto-oncogene, bHLH transcription factor	264	NM_002467.6	F: 5′-GATTCTCTGCTCTCCTCGACG-3′ R: 5′-GTTGTGCTGATGTGTGGAGAC-3′
PTGS2	Prostaglandin-endoperoxide synthase 2	156	NM_000963.4	F: 5′-GTATGTATGAGTGTGGGATTTGAC-3′ R: 5′-CTTGAAGTGGGTAAGTATGTAGTG-3′

Статистический анализ данных проводили с помощью Microsoft Excel и GraphPad Prism 9. Нормальность распределения данных проверяли с помощью теста Шапиро–Уилка. Сравнение выборок проводили с помощью критерия Краскела–Уоллиса и одностороннего ANOVA. Различия принимали статистически значимыми при p < 0,05. Все данные представлены как среднее ± SE, объём выборки составлял 4–6 биологических повторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для сравнения влияния ионов Li⁺ и Na⁺ на транскрипцию генов FOS, JUN, EGR1, ATF3, MYC и PTGS2 в HUVEC клетки инкубировали в среде, содержащей LiCl, или в контрольной среде, содержащей Na⁺-ионофор монензин. Для контроля осмолярности внеклеточной среды использовали NaCl в концентрации, эквимолярной LiCl.

На рис. 1, а, б показано, что инкубация HUVEC в присутствии 40 мМ внеклеточного LiCl в течение 1,5 ч не влияла на внутриклеточное содержание ионов Na⁺ и K⁺, но приводила к внутриклеточному накоплению 230 нмоль Li⁺/мг белка (рис. 1, в). Добавление 40 мМ Na⁺ во внеклеточную среду практически не влияло на содержание Na⁺ (рис. 1, а), но увеличивало содержание K⁺ внутри клеток на ~ 400 нмоль/мг белка (рис. 1, б) за счёт активации Na,K-АТРазы, как мы показали ранее [13]. Обработка клеток 1,2 мкг/мл монензина в течение 1,5 ч обеспечивала общее изменение внутриклеточного содержания одновалентных катионов (рис. 1, а, б), сопоставимое с тем, которое вызывала инкубация клеток в присутствии ионов Li⁺ (рис. 1, в). Однако в этом случае наблюдалось увеличение содержания Na+ на 300 нмоль/мг белка и уменьшение содержания K⁺ на 261 нмоль/мг белка внутри клеток. Потеря K⁺, скорее всего, происходит за счёт активации K⁺,Cl−-котранспортёров (KCC) и/или K⁺-каналов, возникающей вследствие набухания клеток, опосредованного внутриклеточным накоплением Na+ [15, 16]. Предварительно мы убедились, что зависимость содержания внутриклеточного Na⁺ от концентрации монензина носит линейный характер (рис. 2). Эти результаты согласуются с увеличением внутриклеточного содержания Na⁺, наблюдаемым в клетках HeLa, обработанных 1 мкг/мл монензина в течение 6 ч [17]. Учитывая, что дисбаланс одновалентных катионов способствует экспрессии генов в HUVEC Ca²⁺_i-независимым образом [3], мы изучили влияние ионов Na⁺ и Li⁺ на экспрессию некоторых Na⁺_i/K⁺_i-чувствительных генов. На рис. 3, а–г показано, что накопление Li⁺ в клетках приводило к увеличению транскрипции генов раннего ответа FOS и EGR1 в 15 и 8 раз соответственно и снижению транскрипции JUN и MYC в 3 раза. Уровень экспрессии A F3 и PTGS2 существенно не изменялся (рис. 3, д, е). Эти данные в основном согласуются с ранее опубликованными результатами. Во-первых, было показано, что 24-часовая инкубация клеток лейкемии человека NB4 в присутствии 20 мМ LiCl снижала уровень белка c-Myc в 2 раза [18]. Во-вторых, лечение литием здоровых мужчин в течение 2 недель приводило к накоплению Li⁺ в крови до 0,73 ± 0,27 мМ. Это вызывало увеличение транскрипции FOS в 1,8 раза и снижение транскрипции JUN в 2 раза в лейкоцитах [19]. В-третьих, обработка клеток нейробластомы SH-SY5Y 20 мМ Li⁺ приводила к увеличению транскрипции EGR1 [20]. В-четвёртых, лечение литием пациентов с биполярным расстройством не изменяло экспрессию ATF3 в их моноцитах [21], тогда как инкубация хондроцитов человека T/C28a в присутствии 20 мМ LiCl в течение 5 ч приводила к увеличению уровня мРНК PTGS2 в 3–4 раза [22], что не согласуется с нашими результатами. Возможно, это объясняется тем, что обработка эндотелиальных клеток Li⁺ в течение 1,5 ч недостаточна для увеличения экспрессии PTGS2, и этот эффект проявится при более длительной инкубации.

Рис. 1. Влияние 40 мМ LiCl, 40 мМ NaCl и 1,2 мкг/мл монензина, добавленных в культуральную среду, на внутриклеточное содержание ионов Na⁺ (а), K⁺ (б) и Li⁺ (в) в HUVEC. Клетки инкубировали в экспериментальных условиях в течение 1,5 ч. Значения представлены как среднее ± SE (n = 4–6). Значимые различия рассчитывали с помощью одностороннего ANOVA; * p < 0,05; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Рис. 2. Зависимость внутриклеточного содержания Na⁺ в HUVEC от концентрации монензина в культуральной среде. Клетки инкубировали в среде, содержащей монензин, в течение 1,5 ч. Значения представлены как среднее ± SE (n = 4–6)

Рис. 3. Влияние 40 мМ LiCl, 40 мМ NaCl и 1,2 мкг/мл монензина, добавленных в культуральную среду, на содержание мРНК генов FOS (а), JUN (б), EGR1 (в), MYC (г), ATF3 (д), PTGS2 (е) в HUVEC. Клетки инкубировали в экспериментальных условиях в течение 1,5 ч. Значения представлены как среднее ± SE (n = 5). Значимые различия рассчитывали с помощью одностороннего ANOVA; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Увеличение содержания внеклеточного Na⁺ на 40 мМ приводило к двукратному снижению уровня мРНК JUN (рис. 3, в) и трёхкратному увеличению транскрипции ATF3 (рис. 3, е), не влияя на транскрипцию других исследуемых генов. Это согласуется с полученными нами ранее данными о том, что увеличение концентрации внеклеточного Na⁺ усиливает экспрессию ATF3 как на уровне мРНК, так и на уровне белка в HUVEC [23]. Увеличение внутриклеточного содержания Na+ при инкубации клеток в присутствии монензина не оказало существенного влияния на экспрессию исследуемых генов (рис. 3). Этот результат оказался неожиданным, поскольку ранее было показано увеличение экспрессии FOS на уровне белка в клетках HeLa, обработанных 1 мкг/мл монензина в течение 6 ч, что сопровождалось внутриклеточным дисбалансом одновалентных катионов [17]. С другой стороны, подобный эффект не был обнаружен в аналогичных экспериментах с использованием гладкомышечных клеток из аорты крысы [24]. Однако здесь необходимо учитывать различия в паттернах экспрессии генов, инициируемых диссипацией градиента одновалентных катионов в клетках грызунов и негрызунов [25]. Несмотря на то что в клетках, обработанных монензином, содержание Na+ было в 4 раза выше по сравнению с контрольными образцами, мы не обнаружили изменений в экспрессии Na⁺_i/K⁺_i-чувствительных генов. Если принять во внимание гипотезу о том, что G-квадруплексы участвуют в регуляции экспрессии таких генов, то отсутствие эффекта монензина на этот параметр можно объяснить стабилизирующим действием ионов K⁺, содержание которых в присутствии монензина существенно не менялось (рис. 1, б).

Влияние ионов Li⁺ на экспрессию генов было описано достаточно давно [26], однако точные механизмы этого явления до сих пор мало изучены. В этой связи рассматриваются различные сигнальные пути в клетке, включая cAMP- [27], Wnt/β-катенин- [28], PI3K/Akt-зависимый сигнальные пути [29]. Мы, в свою очередь, предлагаем рассмотреть эту проблему в контексте прямого воздействия одновалентных катионов на G-квадруплексы. Способность ионов Li⁺ увеличивать экспрессию генов посредством дестабилизации G-квадруплексов подтверждается тем, что его положительное влияние на транскрипцию KIT аналогично действию синтетических олигонуклеотидов, препятствующих сборке G-квадруплексов [30]. Часто предполагается, что дестабилизация G-квадруплексов должна приводить к увеличению экспрессии генов. Однако следует иметь в виду, что сами G-квадруплексы, помимо создания стерических препятствий для РНК-полимеразы, могут служить участками для взаимодействия с белками, регулирующими транскрипцию генов. В частности, показано, что мутации G-квадруплекса в промоторе MYC, нарушающие его формирование, приводят к уменьшению экспрессии MYC как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Изменённые последовательности, не образующие G-квадруплексы, значительно слабее взаимодействовали с РНК-полимеразой и транскрипционными факторами. Кроме того, эти мутации приводили к освобождению участка для посадки нуклеосомы, затрудняющей ход транскрипции [31]. Таким образом, дестабилизация и/или изменение типа этих структур может повлиять на взаимодействие ДНК с белками или другими удалёнными регуляторными элементами генома [32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что ионы Li⁺ и Na⁺ изменяют экспрессию факторов транскрипции FOS, JUN, EGR1, MYC и ATF3, причём влияние этих ионов различно. Это явление может быть связано с G-квадруплексами, расположенными в промоторах исследуемых генов. Возможно, изменения конформации G-квадруплексов, опосредованные одновалентными катионами, приводят к последующим изменениям транскрипции этих генов. Различия во влиянии ионов Na⁺ и Li⁺ на профиль экспрессии исследуемых генов, вероятно, связаны с различной чувствительностью разных G-квадруплексов к этим катионам. Однако эта гипотеза требует дальнейшей экспериментальной проверки. Кроме того, необходимо выяснить, каким должно быть минимальное значение внутриклеточного соотношения Na⁺_i/K⁺_i, так называемый «натрий-калиевый переключатель» [33], обеспечивающее Na⁺_i/K⁺_i-чувствительные изменения экспрессии генов.

Вклад авторов. Е.А. Климанова – концепция и руководство работой; О.Е. Квитко, Д.А. Федоров, С.В. Сидоренко – проведение экспериментов; О.Е. Квитко, Д.А. Федоров, Е.А. Климанова – обсуждение результатов исследования; О.Е. Квитко, Д.А. Федоров – написание текста; О.Д. Лопина – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-75-10009).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.