Transgenic Lines of Human Induced Pluripotent Stem Cells ICGi022-A-6 and ICGi022-A-7 with Doxycycline-Inducible Variants of Programmable Nuclease AsCas12a

S. V. Pavlova; Павлова С. В.; K. R. Valetdinova; Валетдинова К. Р.; T. B. Malankhanova; Маланханова Т. Б.; D. E. Polivtsev; Поливцев Д. Е.; A. A. Malahova; Малахова А. А.; E. V. Grigor’eva; Григорьева Е. В.; A. I. Shevchenko; Шевченко А. И.; S. M. Zakian; Закиян С. М.; S. P. Medvedev; Медведев С. П.

doi:10.31857/S047514502306006X

Трансгенные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека ICGi022-A-6 и ICGi022-A-7 с доксициклин-управляемыми вариантами программируемой нуклеазы AsCas12a

Авторы: Павлова С.В.¹^,2^,3, Валетдинова К.Р.¹, Маланханова Т.Б.¹, Поливцев Д.Е.¹^,4, Малахова А.А.¹^,2^,3, Григорьева Е.В.¹^,2^,3, Шевченко А.И.¹^,2^,3, Закиян С.М.¹^,2^,3, Медведев С.П.¹^,2^,3
Учреждения:
1. ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”
2. ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской Федерации”
3. ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук”
4. ФГАОУВО “Новосибирский национальный исследовательский государственный университет”
Выпуск: Том 54, № 6 (2023)
Страницы: 415-428
Раздел: КОЛЛЕКЦИЯ ЛИНИЙ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
URL: https://journal-vniispk.ru/0475-1450/article/view/232038
DOI: https://doi.org/10.31857/S047514502306006X
EDN: https://elibrary.ru/GESSIW
ID: 232038

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностях ДНК. С использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGi022-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCas12a (также известной как AsCpf1), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCas12a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGi022-A-7 (AsCas12a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCas12a(TTTV) и AsCas12a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. С помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток – OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров – OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эмбриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.

Ключевые слова

индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), трансгенез, система CRISPR/Cas9, нуклеаза AsCas12a (AsCpf1), изогенные клеточные линии

Об авторах

С. В. Павлова

ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”; ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской Федерации”; ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения
Российской академии наук”

Email: medvedev@bionet.nsc.ru
Россия, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10; Россия, 630055, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15; Россия, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8

Список литературы

Медведев С.П., Маланханова Т.Б., Валетдинова К.Р., Закиян С.М. Создание и исследование клеточных моделей наследственных нейродегенеративных заболеваний с помощью направленного редактирования геномов // Нейрохимия. 2021. Т. 38. № 4. С. 313–319.
Устьянцева Е.И., Медведев С.П., Ветчинова А.С. и др. Платформа для исследования механизмов нейродегенерации с помощью генетически кодируемых биосенсоров // Биохимия. 2019. Т. 84. № 3. С. 423–435.
Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts // N. Engl. J. Med. 2004. V. 350. № 13. P. 1353–1356.
DeKelver R.C., Choi V.M., Moehle E.A. et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome // Genome Res. 2010. V. 20. № 8. P. 1133–1142.
Gao L., Cox D.B.T., Yan W.X. et al. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 8. P. 789–792.
Grigor’eva E.V., Malankhanova T.B., Surumbayeva A. et al. Generation of GABAergic striatal neurons by a novel iPSC differentiation protocol enabling scalability and cryopreservation of progenitor cells // Cytotechnology. 2020. V. 72. P. 649–663.
Hellemans J., Mortier G., De Paepe A. et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data // Genome Biol. 2008. V. 8. P. R19.
Kim D., Kim J., Hur J.K. et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 863–868.
Kleinstiver B.P., Tsai S.Q., Prew M.S. et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 869–874.
Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Pavlova S.V. et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population // Stem Cell Res. 2020. V. 48. P. 101952.
Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nat. Protoc. 2013. V. 8. № 11. P. 2281–2308.
Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system // Cell. 2015. V. 163. № 3. P. 759–771.