Assessment of the Degree Of DNA Methylation in Lymphocytes аfter а Single Blood Irradiation in vitro

Full Text

В настоящее время широко распространено изучение таких эпигенетических процессов, как метилирование ДНК, которое участвует в регуляции экспрессии генов, в клеточной дифференцировке, репликации, репарации ДНК и других клеточных процессах. Изменение степени метилирования ДНК в составе генов подвержено влиянию эндогенных и экзогенных факторов. Например, неметилированное состояние CpG-динуклеотидов в промоторной области генов лейкотриеновых рецепторов B4 (LTB4R и LTB4R2), регулирующих прогрессию опухоли, является потенциальным маркером повышенной инвазивности опухолевых клеток при раке молочной железы [1]. Радиационное воздействие на организм человека также сопровождается изменением степени метилирования ДНК. Lee Y. и др. (2015) отмечают снижение уровня глобального метилирования ДНК у работников, подвергшихся радиационному облучению при исполнении своих профессиональных обязанностей, по сравнению с контрольной группой [2]. Кузьминой Н.С. и др. (2014, 2016) выявлено аберрантное метилирование СpG-островков промоторов генов клеточного цикла (RASSF1A, CDKN2A, p16/INK4A, p14/ARF) и детоксикации ксенобиотиков (GSTP1), которое сохраняется в отдаленные сроки после хронического воздействия ионизирующего излучения (ИИ) в лейкоцитах крови человека [3, 4]. Отмечается дозозависимое гиперметилирование p16/INKA, р53, GSTP1, SOD3, АТМ, ESR1, которое сохраняется годы и десятилетия после перенесенного пролонгированного внешнего (γ-излучение) и сочетанного (γ- и α-излучение) облучения [5]. Наши предварительные исследования также выявили связь степени метилирования проапоптического гена Bаk1 с дозой хронического внешнего облучения в лимфоцитах крови работников объекта использования ионизирующего излучения [6]. Изучение эпителиоцитов слизистой оболочки бронхов человека после рентгеновского облучения в дозах 0 и 1 Гр также показало связь степени метилирования генов с дозой γ-излучения, при этом CpG-сайты одних генов были гиперметилированы, других — гипометилированы [7].

Таким образом, оценка степени метилирования генов лимфоцитов крови при однократном воздействии γ-излучения является актуальной задачей, которая позволит в дальнейшем выявить маркеры радиационного воздействия, перспективные для биологической дозиметрии персонала, контактирующего с источниками ИИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Исследование включало 10 человек мужского пола (20–34 лет) — работников объекта использования ИИ, не подвергавшихся воздействию ИИ и не страдающих хроническими заболеваниями.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

У каждого донора брали добровольное информированное согласие на взятие биоматериала (крови) и обработку персональных данных.

Материал. Кровь у доноров забирали из локтевой вены в пробирки Vacuette с Li-гепарином (Greiner Bio-one, Австрия) с иглой Visio Plus для системы Vacuette (Greiner Bio-one, Австрия). Далее кровь от каждого донора разделяли на две части: контрольный (0 Гр) и экспериментальный образцы. Экспериментальные образцы подвергали однократному воздействию γ-излучения in vitro в дозе 1.5 Гр. Облучение крови проводили с помощью γ-терапевтического аппарата Theratron Equinox (Канада), предназначенного для дистанционного облучения. Радиоактивный источник ⁶⁰Со (мощность дозы 1.93 Гр/мин, Еγ ≈ 1.25 МэВ). Время от взятия крови до ее облучения с учетом транспортировки образцов составляло не более 1 ч. Контрольные образцы не подвергали облучению (0 Гр), при этом они находились в тех же условиях (транспортировка, температурный режим), что и экспериментальные образцы. Облучение и культивирование контрольных и экспериментальных образцов осуществляли в день взятия крови, после чего оценивали степень метилирования ДНК в лимфоцитах крови.

Методика. Культивирование контрольных и экспериментальных образцов цельной крови проводили в стерильных условиях с использованием ламинарного шкафа Kojair (Финляндия). Кровь в объеме 4 мл смешивали с 16 мл питательной среды RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), с предварительно добавленным L-глютамином (ПанЭко, Россия), 4 мл эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия) и 0.4 мл фитогемагглютинина (ПанЭко, Россия). После чего кровь инкубировали в культуральных флаконах при 37°C в орбитальном шейкере-инкубаторе Biosan Sia (Латвия) в течение 46.5 ч.

После завершения инкубации культуральную суспензию поровну разделяли на 2 пробирки объемом 15 мл, затем центрифугировали 8 мин при 2000 об./мин с использованием центрифуги Eppendorf Centrifuge 5702R (Германия), после культуральную суспензию отмывали физиологическим раствором от гепарина 3 раза. Далее осадок аликвотировали в пробирки типа эппендорф по 700 мкл и замораживали сначала при –20°C, затем при –80°С (в течение 5–6 сут).

Выделение ДНК из лимфоцитов крови проводили с использованием набора QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя, после предварительной промывки замороженных образцов 1-кратным SSC (saline sodium citrate — смесь хлорида натрия и цитрата натрия). Концентрацию и чистоту ДНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop-1000 (США).

Степень метилирования ДНК контрольных и экспериментальных образцов определяли методом бисульфитного секвенирования ограниченных наборов геномных локусов — RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) с использованием рестриктазы XmaI (метод XmaI-RRBS) [8]. Секвенирование геномных библиотек XmaI-RRBS осуществляли с использованием системы Ion Personal Genome Machine (PGM), наборов для секвенирования Ion PGM 200 Sequencing Kit и Ion 318 Chip (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК библиотек определяли с помощью флуориметра Qubit 4 (США).

Статистические методы. Данные секвенирования обрабатывали с использованием стандартного программного обеспечения Ion Torrent Suite™. Cutadapt 1.15 применяли для обрезки адаптерных последовательностей, с помощью программного пакета Bismark 0.20 выполняли выравнивание обработанных бисульфитом натрия прочтений и получение данных о метилированных и неметилированных цитозинах. Дифференциально метилированные цитозины отбирали из данных Xmal-RRBS с использованием пакета Reproducibility-Optimized Test Statistic (ROTS) с возможностью парного тестирования [9]. Контроль качества обработанных прочтений осуществляли с помощью инструмента FASTQC [10]. Расчеты проводили с использованием статистического языка программирования R 3.6.3 [11]. Анализ обогащения по функциональной принадлежности (Gene Ontology, далее GO) был выполнен с использованием пакета clusterProfiler с функцией enrichGO. В качестве предельного значения для дифференциально метилированных цитозинов было установлено изменение среднего значения метилирования b-value на ±0.20 (20٪) между контрольными и экспериментальными образцами. Различия считали значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ широкогеномного бисульфитного секвенирования (XmaI-RRBS) показал, что после облучения образцов in vitro в дозе 1.5 Гр CpG-динуклеотиды некоторых генов стремятся либо к гипометилированному, либо к гиперметилированному состоянию, что отмечено по крайней мере у 50٪ экспериментальных образцов. Выявлен 41 ген, среди которых 26 генов (HOXD4, PADI2, FOXK1, FTCD, PRDM16, TOM1, PPP1R14A, FLNB, OR1F1, RARA, CRTAC1, AP5B1, ARL5C, NOC2L, MAMDC4, FGFRL1, PPFIA3, CUX2, ANKRD20A19P, FAM83H-AS1, CBFA2T3, POLN, MIR4458HG, FNBP1, SPIRE2 и ZSCAN10) имеют тенденцию к гипометилированию CpG-динуклеотидов, а 15 генов (CHRNA4, SEPTIN9, ZNF174, ELK3, NFAM1, ALG10, SOX8, KLHL30, URI1, HBZ, KLF14, MYO16, MYEOV, DMKN и PAX7) имеют тенденцию к гиперметилированию CpG-динуклеотидов. В табл. 1 представлены средние частоты метилирования CpG-динуклеотидов 41 гена до и после облучения.

 

Таблица 1. Средняя частота метилирования CpG-динуклеотидов генов до и после воздействия γ-излучения в дозе 1.5 Гр in vitro по крайней мере у 50% исследуемых образцов

Table 1. The average frequency of methylation of CpG-dinucleotides of genes before and after exposure to gamma radiation at a dose of 1.5 Gy in vitro in at least 50% of the researched samples

Ген		Локализация	Средняя частота метилирования CpG-динуклеотидов		p-value	FDR
			до облучения	после облучения
Гипометилированные гены	HOXD4	downstream	0.6012	0.2008	0.0001	0.6667
	PADI2	upstream	0.4844	0.2227	0.0006	0.7391
	FOXK1	upstream	0.7021	0.4965	0.0010	0.8018
	FTCD	inside intron	0.5681	0.2892	0.0012	0.8018
	PRDM16	inside intron	0.4639	0.1592	0.0018	0.8018
	TOM1	inside intron	0.7502	0.4582	0.0019	0.8018
	PPP1R14A	inside exon	0.4253	0.1842	0.0030	0.8018
	FLNB	downstream	0.7349	0.5187	0.0041	0.8018
	OR1F1	upstream	0.4176	0.2178	0.0061	0.8018
	RARA	inside exon	0.6946	0.4587	0.0082	0.8018
	CRTAC1	inside intron	0.6370	0.3819	0.0088	0.8018
	AP5B1	inside exon	0.6818	0.4629	0.0090	0.8018
	ARL5C	inside intron	0.5196	0.3769	0.0118	0.8018
	NOC2L	promoter	0.3271	0.1640	0.0139	0.8018
	MAMDC4	inside intron	0.3947	0.1942	0.0149	0.8018
	FGFRL1	downstream	0.8622	0.6732	0.0152	0.8018
	PPFIA3	inside intron	0.4090	0.1967	0.0243	0.8018
	CUX2	inside intron	0.6984	0.4791	0.0245	0.8018
	ANKRD20A19P	inside exon	0.5022	0.4306	0.3088	0.8018
	FAM83H-AS1	inside intron	0.1853	0.0766	0.0287	0.8018
	CBFA2T3	promoter	0.5302	0.3567	0.0296	0.8018
	POLN	inside intron	0.8402	0.6919	0.0297	0.8018
	MIR4458HG	inside intron	0.2580	0.1316	0.0329	0.8018
	FNBP1	inside exon	0.3181	0.1933	0.0364	0.8018
	SPIRE2	inside intron	0.5149	0.3188	0.0383	0.8018
	ZSCAN10	promoter	0.4170	0.3154	0.0494	0.8018
Гиперметилированные гены	CHRNA4	inside exon	0.6516	0.9208	0.0003	0.7391
	SEPTIN9	inside intron	0.1502	0.4356	0.0010	0.8018
	ZNF174	downstream	0.4794	0.8072	0.0016	0.8018
	ELK3	inside intron	0.3344	0.6106	0.0021	0.8018
	NFAM1	downstream	0.2933	0.5862	0.0021	0.8018
	ALG10	downstream	0.5457	0.7752	0.0023	0.8018
	SOX8	downstream	0.4407	0.7027	0.0033	0.8018
	KLHL30	inside intron	0.4844	0.7123	0.0070	0.8018
	URI1	downstream	0.7134	0.9268	0.0130	0.8018
	HBZ	downstream	0.8045	0.9215	0.0162	0.8018
	KLF14	inside exon	0.2003	0.4103	0.0193	0.8018
	MYEOV	downstream	0.5093	0.6598	0.0285	0.8018
	MYO16	inside exon	0.3204	0.5519	0.0361	0.8018
	DMKN	inside intron	0.6150	0.7652	0.0436	0.8018
	PAX7	inside intron	0.2057	0.3638	0.0487	0.8018
Примечание. Upstream — восходящие нетранслируемые области, promoter — промотор, inside intron — область интрона, inside exon — область экзона, downstream — нисходящие нетранслируемые области. FDR (False discovery rate) — ожидаемая доля ложных отклонений. Note. Upstream — ascending untranslated regions, inside intron — intron region, inside exon — exon region, downstream —descending untranslated regions. FDR — false discovery rate.

 

Распределение дифференцированно метилированных цитозинов относительно областей гена (экзонов, интронов, промоторов, восходящих и нисходящих нетранслируемых (некодирующих) областей) у экспериментальных образцов показано на рис. 1. Для цитозинов, которые изменили статус метилирования в CpG-динуклеотидах после воздействия γ-излучения на кровь in vitro, гипометилирование ДНК наиболее характерно для восходящих нетранслируемых областей и области промотора, а гиперметилирование ДНК в большей степени характерно для нисходящих нетранслируемых областей.

 

Рис. 1. Гистограмма для дифференциально метилированных цитозинов с расположением относительно элементов гена по оси X и подсчетом по оси Y для цитозинов, которые изменили статус метилирования, выявленных по крайней мере у 50٪ экспериментальных образцов.

Примечание. Upstream — восходящие нетранслируемые области, promoter — промотор, inside intron — область интрона, inside exon — область экзона, downstream — нисходящие нетранслируемые области.

Fig. 1. Annotation barplots for differential methylated cytosines with location relative to gene elements on x-axis and counts on y-axis for cytosines that changed methylation status detected in at least 50٪ of the experimental samples.

Note. Upstream — ascending untranslated regions, inside intron — intron region, inside exon — exon region, downstream — descending untranslated regions.

 

Было выявлено частичное гиперметилирование после облучения лимфоцитов крови in vitro внутри интрона гена GSTP1 (рис. 2), для которого ранее было показано аберрантное метилирование промоторной области после хронического воздействия ИИ [3, 4].

 

Рис. 2. Пример визуализации аномального метилирования ДНК внутри интрона GSTP1 после облучения лимфоцитов крови in vitro, полученный с использованием геномного браузера Integrative Genomic Browser (IGV).

Примечание. На верхней панели показан результат высокопроизводительного параллельного бисульфитного секвенирования образца ДНК до облучения; на нижней панели — после облучения в дозе 1.5 Гр. Каждая дорожка представляет последовательность (считывание) одной молекулы из образца; красный цвет — метилированные цитозины, синий — неметилированные цитозины в контексте CpG. На рисунке представлен фрагмент из 40 пар оснований (chr11:67,351,775-67,351,814); эталонная последовательность генома (hg19 человека) находится внизу. Показанный фрагмент находится в пределах острова GSTP1 5`CpG (зеленый).

Fig. 2. An example of visualization of abnormal methylation inside intron of the GSTP1 gene after in vitro irradiation of blood lymphocytes obtained using the Integrative Genomic Browser (IGV).

Note. The upper panel shows the result of high-throughput parallel bisulfite sequencing of the DNA sample before irradiation; the bottom panel, the result of DNA sequencing of the sample after irradiation with 1.5 Gy. Each track represents a sequence (read) of a single molecule from the sample; red is for methylated cytosines and blue is for nonmethylated cytosines in the CpG context. A fragment of 40 base pairs (chr11:67,351,775-67,351,814) is presented; the reference genome sequence (Human hg19) is at the bottom. The fragment shown is within the GSTP1 5’CpG island (green).

 

Анализ обогащения по функциональной принадлежности с использованием GO биологических процессов показал, что гены с гипометилированными CpG-динуклеотидами после облучения играют роль в положительной регуляции дифференцировки жировых клеток, отрицательной регуляции развития хрящевой ткани, развитии обонятельных луковиц, обонятельных долей и движения на основе актиновых микрофиламентов. Гены с гиперметилированными CpG-динуклеотидами после облучения участвуют в катаболизме пуриновых рибонуклеотидов, в регуляции дифференцировки миобластов, активации лейкоцитов, а также рецепторов, связанных с G-белками, передаче сигналов с помощью фермента фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и дифференцировке различных клеток. Топ-20 биологических процессов приведен на рис. 3.

 

Рис. 3. Топ-20 биологических процессов онтологии генов (GO) с представленностью (количество входных генов в процессе / количество всех входных генов) по оси X и терминами GO по оси Y в гипометилированных (A) и в гиперметилированых (Б) CpG-динуклеотидах, выявленных по крайней мере у 50٪ экспериментальных образцов.

Примечание. Count — число выявленных генов, которые участвуют в биологическом процессе.

Fig. 3. Top 20 enriched Gene Ontology (GO) Biological processes terms with GeneRatio (Num. of genes in process/Num. of total input genes) on X-axis and GO terms on Y-axis in CpGs demethylated (A) and CpGs hypermethylated (B) detected in at least 50٪ of the experimental samples.

Note. Count — the number of identified genes that are involved in the biological process.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно результатам XmaI-RRBS изменения степени метилирования CpG-динуклеотидов по крайней мере у 50٪ образцов после однократного воздействия γ-излучения выявлены гены, которые участвуют в важных клеточных процессах: транскрипция, апоптоз, аутофагия, пролиферация и др. Например, FOXK1 (forkhead box K1), гипометилированный после облучения, участвует в индукции аутофагической гибели в ответ на повреждение ДНК; белки FOXK (FOXK1 и FOXK2) функционируют как супрессоры транскрипции [12]. Гипометилирование FOXK1 отмечается в гепатоцитах, при гепатоцеллюлярной карциноме человека [13]. Также отмечается снижение степени метилирования этого гена с возрастом [14, 15]. Другой ген, имеющий тенденцию к гипометилированию CpG-динуклеотидов, CBFA2T3 (CBFA2/RUNX1 partner transcriptional co-repressor 3), участвует в ингибировании дифференцировки клеток острого миелоидного лейкоза [16]. Гипометилирование FOXK1 и CBFA2T3 наблюдается после облучения культуры иммортализованных эпителиоцитов бронхов человека в дозе 1 Гр [7]. AP5B1 (adaptor related protein complex 5 subunit beta 1) принимает участие в аутофагии и внутриклеточном транспорте [17].

Гиперметилирование CpG-динуклеотидов, выявленное по крайней мере у 50٪ облученных образцов, наблюдалось у HBZ (hemoglobin subunit zeta), который участвует в миграции и пролиферации клеток при Т-клеточном лейкозе [18]. Отмечалась также тенденция к снижению экспрессии HBZ после воздействия “малых” (150 мГр) доз ИИ [19].

Дифференцированно метилированные цитозины у экспериментальных образцов распределены неравномерно относительно областей гена. Наиболее характерно гипометилирование CpG-динуклеодилов в области промотора (рис. 1). Исследование Kennedy E.M. и др. (2018) показало, что облучение рентгеновским излучением (1 Гр) эпителиоцитов слизистой оболочки бронхов человека приводит в большей степени к гипометилированию, чем к гиперметилированию CpG-сайтов. При этом гипометилирование происходило, в первую очередь, в более высоко метилированных CpG-сайтах. Помимо этого, выявлено, что воздействие рентгеновского излучения отражается в основном на транскрибируемой области гена, в меньшей степени — на активных/доступных промоторах и энхансерах [7]. Снижение степени метилирования генов было обнаружено после воздействия ИИ на лимфобласты человека в дозе 2 Гр [20]. После радиационного воздействия (2 и 5 Гр) на опухолевые клетки при раке толстой кишки наблюдалось гипометилирование промоторных областей и увеличение экспрессии генов (ANGPT1, APBB2, CHGA, CTGF, IFI6, IGLON5, SLC43A2) [21]. Воздействие γ-излучения в дозе 7 Гр на клетки менингиомы человека приводило к гипометилированию промотора и увеличению экспрессии урокиназного активатора плазминогена (urokinase plasminogen activator, uPA), также наблюдалось снижение экспрессии ДНК-метилтрансферазы 1 (DNMT1) [22]. В свою очередь, в других исследованиях отмечалось гиперметилирование ДНК в промоторной области генов. Гиперметилирование СpG-островков промоторов генов было выявлено Кузьминой Н.С. и др. (2016, 2017, 2018) при хроническом воздействии ИИ на организм человека [4, 23, 24]. Повышение степени метилирования промоторной области гена клеточного цикла CCND2 отмечалось Chen X. и др. (2015) в радиационно устойчивых клетках плоскоклеточного рака [25]. Таким образом, гипо- или гиперметилирование промоторной области генов, вероятно, зависит от типа клеток, способа и продолжительности радиационного воздействия.

Частичное гиперметилирование ДНК лимфоцитов крови после воздействия γ-излучения in vitro было обнаружено внутри интрона гена GSTP1 (рис. 2). Белки GSTP1 (glutathione S-transferase pi 1) являются членами семейства ферментов глутатион-S-трансферазы (GSTs), которые играют важную роль в детоксикации, катализируя конъюгацию многих гидрофобных и электрофильных соединений с восстановленным глутатионом. Гиперметилирование этого гена было обнаружено в опухолевых клетках предстательной железы [26, 27]. Mian O.Y. и др. (2016) показали, что длительное воздействие “малых” доз ИИ приводит к снижению активности GSTP1, что способствует выживанию опухолевых клеток при раке предстательной железы [28]. Исследование Кузьминой Н.С. и др. (2014, 2018, 2019) показало, что хроническое воздействие γ-излучения на организм человека (на примере ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС) приводит к аберрантному гиперметилированию CpG-островков промотора GSTP1 лейкоцитов крови [3, 5, 24]. Помимо этого, было отмечено сохранение аберрантного гиперметилирования GSTP1 в течение длительного времени после облучения [3, 24] и зависимость степени метилирования этого гена от дозы γ-излучения [5]. Таким образом, наше исследование подтверждает ранее полученные результаты в отношении метилирования гена GSTP1.

Анализ обогащения по функциональной принадлежности биологических терминов GO генов, имеющих гипометилированные цитозины в экспериментальных образцах, показал связь с процессами дифференцировки клеток, развитием, миграцией лимфоцитов, положительной эпигенетической регуляцией экспрессии генов и др. Примечательно гипометилирование цитозинов генов, связанных с аутофагической гибелью и апоптозом, которые могут определять стимуляцию этих процессов после облучения ИИ для восстановления и элиминации нерепарируемых поврежденных клеток. Гиперметилированные после облучения ИИ цитозины генов, которые согласно анализу обогащения по функциональной принадлежности биологических терминов GO, связаны с процессами передачи внутриклеточных сигналов, катаболическими процессами, воспалительным и иммунным ответами, соответственно, могут обусловливать торможение этих процессов после радиационного воздействия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования были выявлены гены, которые имели тенденцию к гипометилированию (26 генов) и гиперметилированию (15 генов) CpG-динуклеотидов после однократного облучения образцов крови in vitro в дозе 1.5 Гр. Данные гены могут стать потенциальными кандидатами для изучения влияния ИИ на внутриклеточные и организменные процессы, а также могут быть перспективными маркерами для эпигеномной дозиметрии.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы работы выражают благодарность медицинским физикам отделения лучевой терапии Научно-исследовательского института онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра И.А. Милойчиковой и Н.Д. Тургуновой за помощь в облучении биоматериала (крови).

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование выполнено при поддержке Федеральной целевой программы “Обеспечение ядерной и радиационной безопасности на 2016–2020 годы и на период до 2035 года”.

About the authors

Olga S. Tsymbal

Seversk Biophysical Research Center of the Federal Medical-Biological Agency

Author for correspondence.
Email: olga-tsymbal@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2311-0451
Russian Federation, Seversk

Daria S. Isubakova

Seversk Biophysical Research Center of the Federal Medical-Biological Agency

Email: isubakova.daria@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5032-9096
Russian Federation, Seversk

Evgenia V. Bronikovskaya

Seversk Biophysical Research Center of the Federal Medical-Biological Agency

Email: Bronikev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6486-5025
Russian Federation, Seversk

Alexandra F. Nikolaeva

Research Centre for Medical Genetics

Email: alex.ru97@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-3805-8879
Russian Federation, Moscow

Vladimir O. Sigin

Research Centre for Medical Genetics

Email: sigin.vladimir@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8020-3577
Russian Federation, Moscow

Alexey I. Kalinkin

Research Centre for Medical Genetics

Email: alexeika2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9215-4581
Russian Federation, Moscow

Vladimir M. Kirillov

Research Centre for Medical Genetics

Email: 96vladkiri96@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8762-1322
Russian Federation, Moscow

Zhanna A. Startseva

Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: zhanna.alex@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-4345-7719
Russian Federation, Tomsk

Nicolay V. Litviakov

Seversk Biophysical Research Center of the Federal Medical-Biological Agency; Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: nvlitv72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0714-8927
Russian Federation, Seversk; Tomsk

Ivan V. Milto

Seversk Biophysical Research Center of the Federal Medical-Biological Agency; Siberian State Medical University

Email: milto_bio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9764-4392
Russian Federation, Seversk; Tomsk

Ravil M. Takhauov

Seversk Biophysical Research Center of the Federal Medical-Biological Agency; Siberian State Medical University

Email: niirm2007@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1994-957X
Russian Federation, Seversk; Tomsk

References

Supplementary files