Организация базальных мембран в ворсинках сосудистого сплетения головного мозга человека
- Авторы: Кирик О.В.1, Алексеева О.С.1,2, Григорьев И.П.1, Федорова Е.А.1, Бекетова А.А.1, Коржевский Д.Э.1
-
Учреждения:
- Институт экспериментальной медицины
- Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова
- Выпуск: Том 162, № 1 (2024)
- Страницы: 54-62
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://journal-vniispk.ru/1026-3543/article/view/263577
- DOI: https://doi.org/10.17816/morph.630499
- ID: 263577
Цитировать
Аннотация
Обоснование. Сосудистое сплетение головного мозга, являясь источником цереброспинальной жидкости (ликвора) и основным компонентом ликвороэнцефалического барьера, обеспечивает активный транспорт только необходимых веществ и препятствует проникновению вредных веществ, включая провоспалительные молекулы, патогены и токсины. Особую роль в реализации барьерных функций играют базальные мембраны сосудистого сплетения, которые подстилают хориоидальный эпителий и эндотелий капилляров и служат дополнительным фильтром для веществ, проникающих из крови в ликвор. Детальный анализ морфологической организации базальных мембран в ворсинках сосудистого сплетения человека ранее не проводился.
Цель исследования — изучение организации базальных мембран в ворсинках сосудистого сплетения конечного мозга человека с использованием иммуногистохимического выявления коллагена IV типа.
Материалы и методы. Исследование выполнено на архивном материале сосудистого сплетения головного мозга человека (n=10; возраст 29–50 лет) с использованием иммуногистохимического метода выявления коллагена IV типа.
Результаты. Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к коллагену IV типа показала распределение этого белка в субэпителиальной области и в строме ворсинок сосудистого сплетения. Все иммунопозитивные структуры имели чёткие контуры; реакция со стороны цитоплазмы клеточных элементов и неспецифический фон отсутствовали. Контакты субэпителиальных и субкапиллярных базальных мембран, меченных антителами к коллагену IV типа, не обнаружены.
Заключение. В ходе исследования показано, что базальные мембраны ворсинок сосудистого сплетения головного мозга человека в субэпителиальной и периваскулярной областях имеют различную организацию, при этом объединения субэпителиального и периваскулярного компонентов, содержащих коллаген IV типа, как правило, не происходит.
Ключевые слова
Полный текст
Обоснование
Сосудистое сплетение головного мозга является основным источником цереброспинальной жидкости (ликвора), обеспечивает активный транспорт веществ против градиента концентрации, препятствует проникновению веществ, включая провоспалительные молекулы, патогены и токсины, синтезирует ряд важных компонентов, выделяемых в полость желудочков [1]. Именно поэтому повреждение сосудистого сплетения может приводить к нарушению ликвородинамики и негативному влиянию на головной мозг в целом с дальнейшим развитием стойких патологических изменений [2–6].
Сосудистое сплетение формирует ворсинки, покрытые однослойным кубическим эпителием. Стромальный компонент сплетения состоит из кровеносных сосудов и окружающей их соединительной ткани. Поскольку сосудистое сплетение ― область гематоликворного барьера, особое значение в нём принадлежит базальным мембранам. Базальные мембраны располагаются в субэпителиальной и субэндотелиальных зонах и служат дополнительным фильтром для веществ, проникающих из крови в ликвор [2]. Среди компонентов базальных мембран представлены различные гликопротеиды и сульфатированные протеогликаны, но их основным структурным белком является коллаген IV типа. Наличие коллагена IV типа необходимо для поддержания внутренней организации базальных мембран при механических воздействиях и стабильного их функционирования [7].
Несмотря на то, что в последние годы выполнены отдельные исследования сосудистого сплетения с использованием антител к различным типам коллагена, детальный анализ организации базальных мембран в ворсинках этого органа не проводился.
Цель исследования ― изучение организации базальных мембран в ворсинках сосудистого сплетения конечного мозга человека с использованием иммуногистохимического выявления коллагена IV типа.
Материалы и методы
Дизайн исследования
Проведено наблюдательное одноцентровое ретроспективное выборочное контролируемое нерандомизированное исследование.
В работе использован архивный материал ― блоки сосудистого сплетения головного мозга человека (n=10; возраст 29–50 лет) [8] из архива отдела общей и частной морфологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».
Описание исследования
Материал фиксирован в спирт-формоле, обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. На ротационном микротоме Pfm Rotary 3003 (PFM, Германия) из парафиновых блоков изготовлены срезы толщиной 7 мкм и монтированы на стёклах с адгезионным покрытием HistoBond (Marienfeld, Германия). Срезы окрашены гематоксилином и эозином, базальные мембраны выявляли с помощью иммуногистохимической реакции на коллаген IV типа, используя моноклональные мышиные антитела клона CIV 22 (Dako/Agilent, США). Перед проведением реакции осуществляли блокировку эндогенной пероксидазы с использованием 3% водного раствора перекиси водорода. В качестве вторичных антител использовали реагент MACH 2 Mouse HRP-Polymer (BioCare Medical, США). Визуализацию продукта реакции осуществляли с помощью хромогена DAB (Thermo Fisher, Германия). В качестве контроля использовали срезы сосудистого сплетения, обработанные аналогичным образом, за исключением этапа нанесения первичных антител к коллагену IV типа. Ядра клеток после проведения реакций докрашивали гематоксилином. Анализ препаратов и получение микрофотографий препаратов проводили с помощью светового микроскопа Leica DM750 и цифровой фотокамеры ICC50 (Leica, Германия).
Этическая экспертиза
Исследование одобрено локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 58-9/1-684 от 11.12.2009).
Статистический анализ
Статистическая обработка данных не проводилась.
Результаты
Объекты (участники) исследования
В работе использованы 10 блоков сосудистого сплетения головного мозга человека (возраст 29–50 лет) из отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург).
Основные результаты исследования
На срезах сосудистого сплетения головного мозга человека, окрашенного гематоксилином и эозином, оценивали качество фиксированного материала и отсутствие признаков аутолиза, которые могли бы препятствовать адекватной постановке иммуногистохимических реакций. Все отобранные для исследования случаи демонстрировали хорошую сохранность эпителия, в том числе сохранность тинкториальных особенностей клеточных элементов и волокнистого компонента соединительной ткани, что свидетельствовало об отсутствии аутолитических изменений тканей. Базальные мембраны при окраске гематоксилином и эозином были неразличимы.
Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к коллагену IV типа демонстрировала распределение этого белка в субэпителиальной области и в строме ворсинок сосудистого сплетения. Все иммунопозитивные структуры имели чёткие контуры, реакция со стороны цитоплазмы клеточных элементов и неспецифический фон отсутствовали. Контрольные препараты демонстрировали отсутствие реакции (рис. 1).
Рис. 1. Фрагмент сосудистого сплетения головного мозга человека: a ― иммуногистохимическая реакция на коллаген IV типа; b ― отрицательный контроль (без первичных антител). Докраска гематоксилином. Масштабный отрезок равен 50 мкм.
Fig. 1. Choroid plexus of the human brain: a ― immunohistochemical reaction to type IV collagen; b ― negative control (without primary antibody). Counter-staining with hematoxylin. Scale bar 50 μm.
При малом увеличении чётко выделялось линейное окрашивание субэпителиального слоя стромы ворсинок, которое соответствовало локализации базальной мембраны эпителия. В отдельных участках наблюдались очаговые скопления коллагена IV типа в субэпителиальной области (рис. 2). Кровеносные сосуды ворсинок проявляли отчётливую реакцию на коллаген IV типа по периметру. Более крупные кровеносные сосуды располагались в центральной части ворсинок, а мелкие тонкостенные сосуды присутствовали в периферической части крупных ворсинок и в мелких ворсинках, располагаясь непосредственно под эпителием.
Рис. 2. Сосудистое сплетение головного мозга человека: иммуногистохимическая реакция на коллаген IV типа. Докраска гематоксилином.
Fig. 2. Choroid plexus of the human brain: immunohistochemical reaction to type IV collagen. Counter-staining with hematoxylin.
При большом увеличении можно наблюдать, что капилляры ворсинок, расположенные вблизи эпителиального покрова сплетения, образуют линейные зоны прилежания, в области которых базальные мембраны эпителия сплетения и эндотелия сосуда располагаются параллельно на достаточно протяжённых участках (рис. 3), при этом слияния двух базальных мембран, как правило, не происходит. В части ворсинок удаётся наблюдать перициты, заключённые между слоями базальной мембраны капилляров сосудистого сплетения, и редкие периваскулярные клетки, прилежащие к базальной мембране снаружи (рис. 4). В более крупных сосудах (преимущественно в артериях) базальные мембраны окружают поперечно расположенные профили срезов гладкомышечных клеток.
Рис. 3. Кровеносный сосуд в субэпителиальной области ворсинки сосудистого сплетения. Стрелками указаны субэпителиальная и субэндотелиальная базальные мембраны; отрезок показывает расстояние между базальными мембранами (1,78 мкм); звёздочкой отмечен просвет кровеносного сосуда; Э ― эпителиоциты ворсинки. Иммуногистохимическая реакция на коллаген IV типа. Докраска гематоксилином.
Fig. 3. Blood vessel in the subepithelial area of the choroid plexus villi. Arrows indicate the subepithelial and subendothelial basement membranes; the segment shows the distance between the BMs equal to 1.78 µm; the asterisk indicates the lumen of the blood vessel; Э ― villous epithelial cells. Immunohistochemical reaction to type IV collagen. Counter-staining with hematoxylin.
Рис. 4. Кровеносный сосуд (капилляр) в строме сосудистого сплетения: стрелкой указана периваскулярная клетка, двойной стрелкой ― перицит, звёздочкой отмечен просвет кровеносного сосуда; Э ― эпителиоциты ворсинки. Иммуногистохимическая реакция на коллаген IV типа. Докраска гематоксилином.
Fig. 4. A blood vessel (capillary) in the stroma of the choroid plexus, an arrow indicates a perivascular cell, a double arrow indicates a pericyte, an asterisk indicates the lumen of a blood vessel; Э ― indicates villous epithelial cells. Immunohistochemical reaction to type IV collagen. Counter-staining with hematoxylin.
В отдельных ворсинках базальная мембрана эпителия выглядит утолщённой (более 1 мкм), в некоторых участках ― двухслойной. Строма ворсинок между эпителием и кровеносными сосудами состоит из волокон, структура которых слабо проявляется на препаратах, окрашенных иммуногистохимически. Среди неокрашенных волокон обнаруживаются редкие элементы, проявляющие положительную реакцию на коллаген IV типа, которые нельзя считать базальными мембранами в силу их локализации вне связи с эпителиальными пластами и иными клеточными элементами. В единичных ворсинках эти связанные лишь опосредованно с базальными мембранами волокна коллагена образовали скопления, занимая часть стромы ворсинки.
Обсуждение
Представленные результаты дополнили свидетельства о том, что коллаген IV типа служит надёжным маркером базальных мембран [9], и подтвердили исходное предположение о том, что этот маркер пригоден для выявления базальных мембран на парафиновых срезах сосудистого сплетения головного мозга человека. Вопреки утвердившемуся мнению, что для проведения иммуногистохимических реакций необходимо использовать приемы теплового и протеолитического демаскирования антигенов [10, 11], наш опыт показывает, что для антител клона CIV 22 подобная процедура не является необходимой, но утверждать это можно будет лишь после проведения специального сравнительного исследования.
Расположение базальных мембран в ворсинках сосудистого сплетения указывает на возможность двух независимых источников их формирования. Известно, что процесс формирования базальной мембраны в значительной степени представляет собой процесс самосборки на поверхности клеток переплетённых полимеров ламининов и коллагенов типа IV, которые связаны с нидогенами 1 и 2, а также с гепарансульфатными протеогликанами агрином и перлеканом [12]. Базальные мембраны образуются по такой общей схеме в различных тканях, причём химический состав базальных мембран в разных органах и даже в пределах одной области мозга может различаться [12–15]. Эта гетерогенность локализации мест образования и различие химического состава свидетельствуют о возможном различии происхождения базальных мембран и в сосудистом сплетении, где источником образования двух видов базальных мембран (субэпителиальной и периваскулярной), как можно предполагать, являются эпителий сосудистого сплетения для субэпителиальной базальной мембраны и клеточные элементы сосудистой стенки (эндотелиоциты, перициты, гладкомышечные клетки) ― для периваскулярной. Малоклеточный характер стромы ворсинок сплетения и отсутствие развитого слоя субэпителиальных клеток соединительной ткани заставляет предполагать, что основным источником синтеза коллагена IV, составляющего основу базальной мембраны сосудистого сплетения, служат сами эпителиоциты. Подобное мнение не вполне согласуется с отдельными данными о кооперативном формировании базальной мембраны эпителиальными и соединительнотканными клетками [16, 17].
Интересным наблюдением является то, что в отличие от плаценты человека [18], ворсинки которой по своей организации подобны ворсинкам сосудистого сплетения, в сосудистом сплетении головного мозга человека отсутствуют типичные хориокапиллярные (синцитио-капиллярные) мембраны (т. е. участки непосредственного контакта капиллярного эндотелия и хориона) [19, 20]. При этом даже в области прилежания капилляра к эпителию сосудистого сплетения объединения базальных мембран не происходит. Наши наблюдения согласуются с результатами, в которых не было отмечено соединения базальных мембран субэпителиальных и эндотелиальных в эмбриональном сосудистом сплетении человека [21], а также с сообщением о химической гетерогенности васкулярных и неваскулярных базальных мембран вентрикулярной-субвентрикулярной зоны мозга мышей [14]. В совокупности эти результаты свидетельствуют о сложной структурной организации гематоликворного барьера, который препятствует проникновению в состав ликвора части компонентов плазмы крови. Вероятно, такая организация базальных мембран связана с особенностями организации и функционирования гематоликворного барьера, который препятствует проникновению в состав ликвора части компонентов плазмы крови, а не является зоной свободного транзита компонентов сыворотки крови.
Заключение
Таким образом, использованный подход позволил установить существование двух независимых систем организации базальных мембран в ворсинках сосудистого сплетения головного мозга человека ― субэпителиальной и периваскулярной, что указывает на сложный характер структуры гаматоликворного барьера человека.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины».
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: О.В. Кирик ― подготовка материала, постановка иммуногистохимических реакций, анализ полученных препаратов, обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; О.С. Алексеева ― подготовка материала, анализ полученных препаратов, обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; И.П. Григорьев, Д.Э. Коржевский ― анализ полученных препаратов, обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; Е.А. Федорова, А.А. Бекетова ― подготовка материала, постановка иммуногистохимических реакций, анализ полученных препаратов, написание текста и редактирование статьи.
Additional information
Funding source. The research was carried out within the framework of the state assignment of the Institute of Experimental Medicine.
Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.
Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. O.V. Kirik ― preparation of the material, formulation of immunohistochemical reactions, analysis of the obtained drugs, literature review, collection and analysis of literary sources, writing and editing the article; O.S. Alekseeva ― preparation of the material, analysis of the obtained drugs, literature review, collection and analysis of literary sources, writing and editing the article; I.P. Grigorev, D.E. Korzhevskii ― analysis of the obtained drugs, literature review, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article; Е.А. Fedorova, A.A. Beketova ― preparation of the material, formulation of immunohistochemical reactions, analysis of the drugs obtained, writing the text and editing the article.
Об авторах
Ольга Викторовна Кирик
Институт экспериментальной медицины
Автор, ответственный за переписку.
Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
SPIN-код: 5725-8742
канд. биол. наук
Россия, Санкт-ПетербургОльга Сергеевна Алексеева
Институт экспериментальной медицины; Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова
Email: osa72@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-5688-347X
SPIN-код: 4281-3091
канд. биол. наук
Россия, Санкт-Петербург; Санкт-ПетербургИгорь Павлович Григорьев
Институт экспериментальной медицины
Email: ipg-iem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3535-7638
SPIN-код: 1306-4860
канд. биол. наук
Россия, Санкт-ПетербургЕлена Анатольевна Федорова
Институт экспериментальной медицины
Email: el-fedorova2014@ya.ru
SPIN-код: 5414-4122
канд. биол. наук
Россия, Санкт-ПетербургАнастасия Алексеевна Бекетова
Институт экспериментальной медицины
Email: beketova.anastasiya@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-8659-733X
Россия, Санкт-Петербург
Дмитрий Эдуардович Коржевский
Институт экспериментальной медицины
Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-код: 3252-3029
д-р мед. наук, профессор РАН
Россия, Санкт-ПетербургСписок литературы
- Коржевский Д.Э. Сосудистое сплетение головного мозга и организация гематоликворного барьера у человека // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2003. Т. 2, № 1. С. 5–14. EDN: PCBHFJ
- Kaur C., Rathnasamy G., Ling E.A. The choroid plexus in healthy and diseased brain // J Neuropathol Exp Neurol. 2016. Vol. 75, N 3. P. 198–213. doi: 10.1093/jnen/nlv030
- Serot J.M., Foliguet B., Béné M.C., Faure G.C. Choroid plexus and ageing in rats: A morphometric and ultrastructural study // Eur J Neurosci. 2001. Vol. 14, N 5. P. 794–798. doi: 10.1046/j.0953-816x.2001.01693.x
- Chen C.P., Chen R.L., Preston J.E. The influence of ageing in the cerebrospinal fluid concentrations of proteins that are derived from the choroid plexus, brain, and plasma // Exp Gerontol. 2012. Vol. 47, N 4. P. 323–328. doi: 10.1016/j.exger.2012.01.008
- Redzic Z.B., Preston J.E., Duncan J.A., et al. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging // Curr Top Dev Biol. 2005. Vol. 71. P. 1–52. doi: 10.1016/S0070-2153(05)71001-2
- Silverberg G.D., Heit G., Huhn S., et al. The cerebrospinal fluid production rate is reduced in dementia of the Alzheimer’s type // Neurology. 2001. Vol. 57, N 10. P. 1763–1766. doi: 10.1212/wnl.57.10.1763
- Pöschl E., Schlötzer-Schrehardt U., Brachvogel B., et al. Collagen IV is essential for basement membrane stability but dispensable for initiation of its assembly during early development // Development. 2004. Vol. 131, N 7. P. 1619–1628. doi: 10.1242/dev.01037
- Sufieva D.A., Fedorova E.A., Yakovlev V.S., et al. 25-Year storage of human choroid plexus in methyl salicylate preserves its antigen immunoreactivity // Turk Patoloji Derg. 2023. Vol. 39, N 2. P. 109–116. doi: 10.5146/tjpath.2022.01581
- Randles M.J., Humphries M.J., Lennon R. Proteomic definitions of basement membrane composition in health and disease // Matrix Biol. 2017. Vol. 57–58. P. 12–28. doi: 10.1016/j.matbio.2016.08.006
- Goodwin P.C., Johnson B., Frevert C.W. Microscopy, immuno-histochemistry, digital imaging, and quantitative microscopy // Treuting P.M., Dintzis S.M., Montine K.S., eds. Comparative anatomy and histology. London: Academic Press, 2017. P. 53–66. doi: 10.1016/b978-0-12-802900-8.00004-x
- Krenacs L., Krenacs T., Stelkovics E., Raffeld M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections // Methods Mol Biol. 2010. Vol. 588. P. 103–119. doi: 10.1007/978-1-59745-324-0_14
- Yurchenco P.D., Patton B.L. Developmental and pathogenic mechanisms of basement membrane assembly // Curr Pharm Des. 2009. Vol. 15, N 12. P. 1277–1294. doi: 10.2174/138161209787846766
- Erickson A.C., Couchman J.R. Still more complexity in mammalian basement membranes // J Histochem Cytochem. 2000. Vol. 48, N 10. P. 1291–1306. doi: 10.1177/002215540004801001
- Sato Y., Kiyozumi D., Futaki S., et al. Ventricular-subventricular zone fractones are speckled basement membranes that function as a neural stem cell niche // Mol Biol Cell. 2019. Vol. 30, N 1. P. 56–68. doi: 10.1091/mbc.E18-05-0286
- Zeisberg M., Kramer K., Sindhi N., et al. De-differentiation of primary human hepatocytes depends on the composition of specialized liver basement membrane // Mol Cell Biochem. 2006. Vol. 283, N 1–2. P. 181–189. doi: 10.1007/s11010-006-2677-8
- Thomsen M.S., Routhe L.J., Moos T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain // J Cereb Blood Flow Metab. 2017. Vol. 37, N 10. P. 3300–3317. doi: 10.1177/0271678X17722436
- Xu L., Nirwane A., Yao Y. Basement membrane and blood-brain barrier // Stroke Vasc Neurol. 2018. Vol. 4, N 2. P. 78–82. doi: 10.1136/svn-2018-000198
- Воронова О.В., Милованов А.П., Михалева Л.М. Интеграционный подход в исследовании сосудов плаценты при преэклампсии // Клиническая и экспериментальная морфология. 2022. Т. 11, № 3. С. 30–44. EDN: TVUIAF doi: 10.31088/CEM2022.11.3.30-44
- Jarzembowski J.A. Normal structure and function of the placenta // McManus L.M., Mitchell R.N., eds. Pathobiology of human disease: A dynamic encyclopedia of disease mechanisms. London: Academic Press, 2014. P. 2308–2321. doi: 10.1016/B978-0-12-386456-7.05001-2
- Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Неокесарийский А.А. и др. Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. 2006. Т. 129, № 3. С. 63–64. EDN: KXHBQR
- Коржевский Д.Э., Отеллин В.А. Структурные основы становления гематоликворного барьера у человека // Успехи физиологических наук. 2002. Т. 33, № 4. С. 43–52. EDN: ZECKGH
Дополнительные файлы
