Особенности изменения уровня нейромедиаторов и маркеров нейродегенерации в головном мозге крыс с экспериментальной болезнью Паркинсона на фоне курсовой терапии стероидными гликоалкалоидами

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона — хроническое нейродегенеративное заболевание головного мозга, при котором происходит нарушение двигательной активности и развитие таких немоторных нарушений, как, например, снижение когнитивных функций. Несмотря на ведущиеся исследования роли различных факторов в этиологии и изучение звеньев патогенеза болезни Паркинсона, а также по разработке новых подходов к терапии, в настоящее время не существует методов лечения БП, а основной стратегией терапии является замедление прогрессирования заболевания [1]. Основной патогенеза БП является потеря дофаминергических нейронов в области компактной черной субстанции среднего мозга. В этой связи “золотым стандартом” терапии БП является леводопа — препарат, действие которого направлено на восполнение недостатка дофамина в головном мозге, что позволяет корректировать клинические проявления заболевания и улучшить качество жизни пациента [2]. К характерным для болезни Паркинсона биохимическим изменениям в мозге, кроме снижения уровня дофамина, относится недостаток “тормозных” нейромедиаторов, таких как ГАМК, а также избыток “возбуждающих” нейромедиаторов — ацетилхолина, серотонина и глутамата. Несмотря на доминирующую роль дофаминергической системы в БП нельзя не учитывать влияние иных нейромедиаторных систем на течение заболевания; так, при нарастании патохимических изменений, характерных для БП, большее значение приобретают симптомы, обусловленные поражением холинергической и других систем [3]. В связи с этим остается актуальным вопрос разработки новых подходов и терапевтических средств для лечения болезни Паркинсона, в том числе влияющих на моноаминергические нейромедиаторные механизмы [4, 5]. Целью данной работы является исследование влияния гликоалкалоидов Solanum Tuberosum L. на изменение уровня нейромедиаторов и маркеров нейродегенерации в ткани головного мозга у крыс с экспериментальной БП. Алкалоиды Solanum Tuberosum — соланин и чаконин содержатся в побегах и зеленых частях картофеля, и, как следствие, широко распространены по всему миру. Их особенностями является доступность и простота извлечения из растительного сырья. Ранние исследования показали наличие у соланина и чаконина М-холиноблокирующего эффекта, а также слабо выраженную активность в отношении ацетилхолинэстеразы [6]. Данный вид активности является предпосылкой для применения алкалоидов Solanum Tuberosum L. в качестве противопаркинсонического средства.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используемые в ходе исследования гликоалкалоиды были выделены по описанной ранее схеме [6].

Для выполнения поставленной цели работа была подразделена на следующие этапы:

Определение острой токсичности гликоалкалоидов.

Изучение влияния гликоалкалоидов на уровень нейромедиаторов и маркеров нейродегенерации в головном мозге крыс в условиях экспериментальной болезни Паркинсона.

Для определения острой токсичности крысам самкам Wistar средним весом (300 ± 30) г (n = 10 для каждой дозы) вводили перорально, с помощью зонда, водный раствор алкалоидов, подкисленный уксусной кислотой до рН 6.5, в концентрациях 200 мг/мл (666.67 мг/кг), 100 мг/мл (333.33 мг/кг), 40 мг/мл (133.33 мг/кг), 20 мг/мл (66.67 мг/кг), 10 мг/мл (33.33 мг/кг), 5 мг/мл (16.67 мг/кг). Состояние крыс оценивали в течении суток, после чего рассчитывали LD50 методом пробит-анализа и терапевтическую дозу гликоалкалоидов.

Для исследования противопаркинсонической активности использовали 40 крыс самок Wistar весом (350 ± 50) г. Животные были получены из питомника лабораторных животных “Рапполово” и на время исследования содержались в помещениях вивария в контролируемых условиях: температура окружающего воздуха (22 ± 2)^оС, относительная влажность (60 ± 5)%, при естественной смене суточного цикла и со свободным доступом к полнорационному корму и воде. Содержание и манипуляции с животными соответствовали положениям Директивы ЕС2010/63 “О защите животных, использующихся в научных целях”.

Крыс рандомизировали по массе тела на четыре группы по 10 животных в каждой: ложнооперированная (ЛО) группа; группа, не получавшая терапию, — негативный контроль (НК); группа, получавшая терапию препаратом сравнения, — прамипексол (производства “Тева Канада Лимитед”, Канада) в дозе 1 мг/кг [7]; группа, получавшая лечение исследуемыми веществами в дозе 1/300 от LD50. В качестве препарата сравнения был выбран прамипексол, так как данный лекарственный препарат один из широко применяемых и эффективных в клинической практике для терапии БП [8].

Для моделирования болезни Паркинсона была выбрана ротеноновая модель. Для этого крысам проводили стереотаксическую операцию при анестезии хлоралгидратом (Acros Organics, 350 мг/кг, внутрибрюшинно): в черепе просверливали отверстие, в правое полосатое тело вставляли канюлю, после чего животным всех групп, кроме ложнооперированной, вводили 4 мкл раствора ротенона (Sigma-Aldrich, США) в ДМСО в концентрации 5 мг/мл. Животным ложнооперированной группы вводили аналогичный объем физиологического раствора. Были использованы следующие стереотаксические координаты: AP + 0.4, ML-2.0 (от брегмы) и DV-3.3 ниже твердой мозговой оболочки. Эксперимент проводили спустя 14 дней формирования заболевания, согласно описанной в литературе методике [9].

В течении 28 дней крысы ежедневно получали пероральную терапию прамипексолом или алкалоидами. Для приготовления смеси для перорального введения готовили суспензию прамипексола в воде, а алкалоиды, ввиду низкой концентрации, растворяли в подкисленной уксусной кислотой до рН 6.7—6.9 воде. Спустя 28 дней введения животных выводили из эксперимента методом декапитации под хлоралгидратной анестезией. Вскрывали черепную коробку и извлекали головной мозг, из которого готовили гомогенат с 5 мл фосфатного буферного раствора (pH 7.4) в соотношении ткань — буферный раствор 1 : 7. Гомогенат головного мозга центрифугировали при 10000g в течение 10 мин, после чего в супернатанте определяли количество дофамина, серотонина, ацетилхолина, ГАМК. Для оценки степени выраженности нейродеструктивных процессов в супернатанте мозговой ткани оценивали содержание белка S100β и мозгового нейротрофического фактора (BDNF). Концентрацию нейромедиаторов и маркеров нейродегенерации оценивали методом ИФА с применением видоспецифичных реактивов Cloud Clone (CША). Ход анализа соответствовал таковому, прописанному в инструкции к каждому набору. Статистические отличия оценивали с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft) при уровне значимости р < 0.05 методом ANOVA с пост-процессингом по Ньюмену—Кейлсу. Данные представлены в виде М ± SEM (среднее значение ± стандартная ошибка среднего).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе оценки острой токсичности гликоалкалоидов было установлено, что введение животным алкалоидов в концентрациях 200 мг/мл (666.67 мг/кг) и 100 мг/мл (333.33 мг/кг) вызывало смерть в течение 3 ч. При некропсии выявлены множественные перфорации на всем протяжении желудочно-кишечного тракта и кровоизлияние в брюшной полости, что объясняется раздражающим действием гликоалкалоидов [10]. Введение алкалоидов в концентрациях 40 мг/мл (133.33 мг/кг), 20 мг/мл (66.67 мг/кг) и 10 мг/мл (33.33 мг/кг) приводило к параличу дыхательного центра и остановке дыхания, при этом наблюдалось скопление крови в легких. Наблюдение за животными, получившими раствор 5 мг/мл, показало, что состояние животных оставалось удовлетворительным на протяжении всего периода. При пересчете LD50 составила 16.67 мг/кг. Согласно СГС классификации (Нью-Йорк и Женева, 2011) исследуемые алкалоиды можно отнести ко 2-му классу пероральной токсичности. При расчете терапевтической дозы мы учитывали высокую биологическую активность алкалоидов и практическое применение низких терапевтических доз иных препаратов алкалоидов [11]. Исходя из полученных данных был проведен расчет терапевтической дозы, которую применяли в ходе дальнейших исследований. Для снижения возможных токсических эффектов терапевтическая доза составила 1/300 высшей суточной дозы, что составляет 0.06 мг/кг.

В результате исследования уровня нейромедиаторов головного мозга было выявлено снижение концентрации дофамина у группы НК относительно ЛО на 48.8% (p < 0.05), тогда как у группы крыс, получавших прамипексол, наблюдалось увеличение аналогичного показателя относительно группы НК на 32.3% (p < 0.05). При этом введение гликоалкалоидов не оказало существенного влияния на изменение уровня дофамина в головном мозге у крыс с экспериментальной БП.

Определение уровня серотонина позволило выявить увеличение его уровня у группы НК на 24.9% (p < 0.05) относительно ЛО, а также снижение у группы прамипексола на 13.4% (p < 0.05) относительно НК, тогда как у группы алкалоидов отсутствуют достоверные отличия относительно группы НК.

Количество ацетилхолина у группы НК повышено на 51.4% (p < 0.05) относительно ЛО. Применение прамипексола и алкалоидов способствовало снижению содержание АХ на 13.4% (p < 0.05) и 35.9% (p < 0.05) соответственно относительно НК (рис. 1).

 

Рис. 1. Влияние прамипексола и гликоалкалоидов на изменение концентрации нейромедиаторов в тканях головного мозга у крыс с болезнью Паркинсона. ▲ — достоверно относительно ЛО; ■ — достоверно относительно НК.

 

При отсутствии терапии происходило снижение уровня ГАМК у животных группы НК на 47.9% (p < 0.05) относительно ЛО крыс, тогда как применение прамипексола и алкалоидов повышало данный показатель на 33.5% (p < 0.05) и 55.1% (p < 0.05) соответственно относительно НК группы животных (см. рис. 1).

При анализе содержания белка S100β было выявлено его повышение у группы НК на 46.9% (p < 0.05) относительно ЛО, а также его снижение на фоне применения прамипексола и алкалоидов на 60.3% (p < 0.05) и 68.6% (p < 0.05) относительно НК группы соответственно.

Определение нейротрофического фактора BDNF позволило установить снижение данного показателя у группы НК на 58.9% (p < 0.05) относительно ЛО и повышение у групп крыс, получавших прамипексол и алкалоиды на 53.7% (p < 0.05) и 52.4 % (p < 0.05) относительно НК группы животных.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При нарастании характерных для болезни Паркинсона биохимических нарушений достоверно (p < 0.05) изменился уровень дофамина и серотонина у группы негативного контроля, относительно группы ложнооперированных животных: –48.8% и +24.9%. Применение прамипексола достоверно (p < 0.05) стабилизировало данные показатели, относительно группы негативного контроля (+32.3% и –13.4% соответственно), что согласуется с его механизмом действия [12]. В свою очередь, терапия алкалоидами не оказывала значительного эффекта на данное звено патогенеза БП, а достоверные отличия от группы негативного контроля не обнаружены.

В противовес этому алкалоиды нормализуют уровень АХ и ГАМК значимее (–35.9% и +55.1% относительно НК (p < 0.05)), чем препарат сравнения (–13.5% и +33.5% относительно НК). Снижение уровня АХ объясняется известной холиноблокирующей активностью соланина и чаконина в отношении М-холинорецепторов [6]: введение холинолитиков может приводить к снижению концентрации АХ в головном мозге [13]. Нельзя не отметить важную роль ГАМКергической нейротрансмиссии, связанной с ионами Ca²⁺, в поддержании гомеостаза как на клеточном, так и на системном уровне, что определяется работой ГАМК-В рецепторов. Активация ГАМКергической системы приводит к снижению притока ионов Ca²⁺, что положительно сказывается на кальций-индуцированном стрессе, снижает энергетические потребности клетки и корректирует митохондиальную дисфункцию, что, в свою очередь, снижает накопление интрацеребральных включений, в том числе телец Леви [14]. Таким образом, положительная динамика уровня ГАМК не только влияет на моторные нарушения, но и на течение болезни в целом. Полученная информация коррелирует с клиническим опытом лечения болезни Паркинсона [15].

При прогрессировании болезни Паркинсона происходит деградация нейронов головного мозга, что отражается повышенным уровнем белка S100β [16]: так, в наших экспериментах у группы НК этот показатель превышен более чем в пять раз (рис. 2). Существует прямая взаимосвязь между повышением уровня этого белка и гибелью нейронов [16]. Исходя из этого, можно делать выводы о том, что исследуемые гликоалкалоиды и препарат сравнения тормозили разрушение клеточных структур, так как приводили к значительному снижению уровня белка S100β (см. рис. 2).

 

Рис. 2. Влияние прамипексола и смеси соланина и чаконина на изменение концентрации белка S100β и субстанции BDNF в тканях головного мозга у крыс с болезнью Паркинсона. ▲ — достоверно относительно ЛО; ■ — достоверно относительно НК.

 

Гибель дофаминергических нейронов сопровождается снижением концентрации BDNF. Также данный нейротрофин предотвращает гибель клеток и поддерживает функцию пораженных нейронов при БП [17]. Сопоставимый уровень нейротрофического фактора головного мозга у групп, получавших терапию прамипексолом и алкалоидами, указывает на наличие нейропротекторного эффекта, а также позволяет предположить стимуляцию репаративных процессов в головном мозге животных с БП. Ранее уже проводились исследования относительно нейропротекторных эффектов прамипексола, которые связывают с его противовоспалительной активностью и усилением аутофагии [18].

Так как применение гликоалкалоидов приводит к схожему изменению уровня нейромедиаторов и маркеров нейродегенерации у животных с БП, то можно предположить их положительное влияние на моторные нарушения и наличие нейропротекторного эффекта. Возможно, моделирующее действие ГАМКергической системы оказывает некоторое влияние на уровни S100β и BDNF у группы животных, получавших терапию алкалоидами, однако маловероятно, что отдельно взятая система может оказывать столь выраженный протекторный эффект. Также остается открытым вопрос о механизмах, которые приводят к нормализации уровня ГАМК у животных, получавших терапию исследуемыми веществами. Литературные данные относительно фармакологической активности соланина и чаконина, а также потенциальных мишеней, недостаточны, ввиду чего можно предположить, что данные вещества обладают плейотропным действием, однако, данный вопрос требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

Применение алкалоидов Solanum Tuberosum L. в дозе 0.06 мг/кг в условиях экспериментальной БП нормализовало уровень АХ и ГАМК, а также значительно снижало уровень белка S100β и BDNF. Стоит отметить, что введение гликоалкалоидов не оказывало влияния на уровень дофамина и серотонина.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Внешнее финансирование отсутствует.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Этическое одобрение. Все применимые международные, национальные и институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

Об авторах

В. А. Воронов

Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ФГБОУ ВO Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения России

Автор, ответственный за переписку.
Email: a54545a@mail.ru
Россия, Пятигорск

Д. И. Поздняков

Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ФГБОУ ВO Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения России; Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии, филиал Федерального государственного бюджетного учреждения “Федеральный научно-клинический центр медицинской реабилитации и курортологии Федерального медико-биологического агентства”

Email: a54545a@mail.ru
Россия, Пятигорск; Пятигорск

Список литературы

Дополнительные файлы