Влияние пренатального стресса на уровень метаболитов оксида азота в ЦНС

Полный текст

NO – одна из важнейших сигнальных молекул, регулирующих физиологические функции организма и метаболизм клеток нервной системы. Установлено участие NO в модуляции процессов обучения и долговременной синаптической потенции в гиппокампе и длительной синаптической депрессии в мозжечке [1], страха и активности серотониновой системы в префронтальной коре [2]. NO участвует в регуляции большого количества сигнальных путей, обеспечивающих как компенсаторно-приспособительную реакцию клеток на экстремальные воздействия, так и запрограммированную гибель клеток [3, 4]. NО и его метаболиты обладают прооксидантными свойствами, могут вызывать перекисное окисление фосфолипидов и окисление тиольных групп белков митохондриальной мембраны, приводя к высвобождению в цитозоль апоптогенных факторов [5]. Многочисленные исследования показали, что избыток NO может приводить к нитрозативному стрессу в нервной системе, способствуя возникновению неврологической патологии [6]. Уровень NO связывают с различными изменениями в поведении [7] и уровнем тревожности [8]. Есть данные, подтверждающие связь между тревожностью и пренатальным уровнем NO [9].

К настоящему времени накоплен убедительный объем данных, доказывающих, что стресс во время внутриутробного периода является фактором, оказывающим модифицирующее влияние на поведение [10], обучение и память [11], окислительный и нитрозативный стресс играют роль в развитии различных нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний [6]. Эффекты пренатального стресса имеют половые особенности, при этом потомство мужского пола подвергается более высокому риску, чем женского [12]. Особенности гормональной регуляции самок и характерные для их эстрального цикла изменения также оказывают значительное влияние на выраженность последствий перенесенного пренатального стресса [13]. Система синтеза NO на организменном уровне также подвергается перестройке после пренатального стресса [14]. Авторы исследования установили, что в изменении системы NO в плазме крови пренатально стрессированных животных имеются половые особенности, которые характеризуются снижением содержания eNOS и повышением содержания ингибитора NO-синтазной реакции – АДМА в сыворотке крови самцов, но не самок, при увеличении концентрации iNOS в сыворотке крови крыс обоих полов, перенесших пренатальный стресс.

Целью работы стало изучение влияния пренатального стресса на уровень NO-метаболитов в филогенетически разных отделах ЦНС (сенсомоторная кора больших полушарий, гипоталамус, кора мозжечка и моторные области спинного мозга) у половозрелых самцов и самок крыс в зависимости от стадии эстрального цикла.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В эксперименте участвовали 12 самок нелинейных белых крыс в возрасте 4–6 месяцев со средней массой 242 ± 11.8 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде, в условиях 12-часовой освещенности в плексигласовых клетках по 6 особей. Все манипуляции с животными проводились в утренние часы. Исследование проводилось с разрешения этического комитета ФГБОУ ВО “Астраханский государственный университет им В. Н. Татищева” (проректор по науке – д. ф. н., профессор Л. В. Баева). Эксперименты осуществляли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (2010/63/ЕU) и ФЗ РФ от 21 ноября 2011 г.

У самок стандартным методом [15] определяли стадию эстрального цикла, при обнаружении эструса к самке подсаживали самца. Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов в мазке крысы. В качестве модели стресса была выбрана иммобилизация в пластиковых пеналах, ограничивающих подвижность животных в период с 16 по 19 дни беременности по 3 ч в утренние часы. Самок контрольной группы негативным воздействиям не подвергали.

Определение уровня NO-метаболитов производили у взрослых (4-месячных) потомков обоего пола – у 40 самок и 20 самцов. Половозрелых самок тестировали с учетом стадий эстрального цикла. Для этого у них брали влагалищные мазки и формировали группы самок, находящихся на стадиях эструса и диэструса. После формирования групп животных наркотизировали этаминалом натрия из расчета 4 мг на 100 г веса и декапитировали. Головной и спинной мозг выделяли на холоде, готовили 10%-ные гомогенаты на 0,1М-фосфатном буфере с добавлением ЭДТА. Уровень метаболитов NO оценивали в гомогенатах ткани коры больших полушарий (сенсомоторная область), гипоталамуса, коры мозжечка и поясничного отдела спинного мозга, перед постановкой реакции гомогенаты центрифугировали 5 мин при 1.5 тыс. об/мин, проводили депротеинизацию материала с применением этанола с последующим повторным центрифунированием при 3 тыс. об/мин. В процессе метаболизма NO образуются его продукты, нитрат- и нитрит-анионы, содержание которых характеризует образование NО в ходе NО-синтaзной реакции из аминокислоты L-аргинина. Уровень суммарной концентрации нитрат- и нитрит-анионов определяли путем восстановления нитратов до нитритов хлоридом ванадия (III) и окрашиванием раствора реактивом Грисса в течение 30 мин при температуре 37^°С с последующим фотометрическим определением нитритов при длине волны 520 нм [16]. Работу проводили не позднее 2-х недель с момента выделения ткани и приготовления гомогенатов, изучаемый материал хранили при температуре –20^°С с добавлением ЭДТА.

Обработку полученных результатов осуществляли в программах Microsoft Excel 2013 и Statistica 10.0. Так как объемы полученных выборок не были достаточны для проведения анализа на соответствие распределения законам нормального, полученные результаты обрабатывали с применением однофакторного (для самцов) и двухфакторного (для самок) дисперсионного анализа ANOVA, при опровержении нулевой гипотезы о равенстве средних использовали попарное сравнение с применением критерия Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05, р < 0.01 по таблицам Гублера и Генкина [17].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В контрольной группе половозрелых самцов уровень метаболитов NO значительно менялся в зависимости от уровня ЦНС (рис. 1, 2): максимальный уровень был отмечен в гипоталамусе, затем следовала кора больших полушарий, спинной мозг и мозжечок, сила влияния фактора составила 40%, р < 0.001. Пренатальный стресс оказал влияние на исследуемый параметр, но эти изменения имели разнонаправленный характер в зависимости от уровня ЦНС. В спинном мозге после перенесенного пренатального стресса отмечено увеличение метаболитов NO (р < 0.05), а в мозжечке и гипоталамусе – снижение (р < 0.05 и р < 0.01 соответственно), на уровень метаболитов NO в коре больших полушарий пренатальный стресс влияния не оказал.

 

Рис. 1. Уровень NO-метаболитов в отделах мозга пренатально стрессированных самцов крыс, нмоль/мл. Примечание: статистически значимые различия между сравниваемыми группами р < 0.05 – *, р < 0.01 – **, U-критерий Манна – Уитни.

 

Рис. 2. Уровень NO-метаболитов в отделах мозга пренатально стрессированных самок крыс, нмоль/мл. Примечание: статистически значимые различия между сравниваемыми группами р < 0.05 – *, р < 0.01 – **, U-критерий Манна – Уитни; ПС – пренатальный стресс; Э – эструс; ДЭ – диэструс.

 

У самок по сравнению с самцами во всех рассмотренных отделах ЦНС отмечен более высокий уровень метаболитов NO (р < 0.01) вне зависимости от стадии эстрального цикла. Максимальный уровень метаболитов NO у самок был отмечен в гипоталамусе, а минимальный – в спинном мозге, сила влияния фактора – 90%, р < 0.001. Уровень метаболитов NO у самок был ниже на стадии диэструса в спинном мозге (р < 0.05), сила влияния фактора – 70%, р < 0.001, и в мозжечке (р < 0.05). На уровне метаболитов NO в гипоталамусе и коры больших полушарий различий обнаружено не было.

Пренатальный стресс повлиял на уровень метаболитов NO в спинном мозге ((вне зависимости от стадии эстрального цикла уровень метаболитов увеличился, р < 0.01), сила влияния фактора – 5%, р < 0.01) и в мозжечке ((отмечено уменьшение показателя только на стадии эструса, р < 0.05), сила влияния фактора – 15%, р < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Оксид азота (NO) вырабатывается в головном мозге из L-аргинина тремя изоформами синтазы NO (NOS). Нейрональная NOS конститутивно экспрессируется в цитозоле нейронов и глиальных клетках, индуцибельная NOS обнаруживается в цитозоле глиальных клеток, эндотелиальная NOS конститутивно экспрессируется в эндотелиальных клетках в связанном с мембраной состоянии. В норме нейрональная форма присутствует в основном в нейронах мозжечка, гипоталамуса, коре мозга, стриатуме и гиппокампе, при этом наиболее высокая активность фермента обнаружена в нейронах мозжечка. Индуцибельная NO-синтаза преимущественно обнаруживается в астроцитах и микроглие, присутствует в нейронах коры и мозжечка. Активность эндотелиальной формы выявлена в нейрональных популяциях и астроцитах.

Существуют несколько путей, посредством которых пренатальный стресс может изменять уровень NO в тканях ЦНС. Известно, что пренатальный стресс оказывает существенное влияние на функциональное состояние организма через эпигенетические механизмы – изменение степени метилирования ДНК, модификации гистонов и действие малых “некодирующих РНК”. Интенсивность продукции NO зависит от экспрессии генов NO-синтазы и активности этих ферментов, которая в свою очередь регулируется эпигенетическими механизмами [18]. На уровень свободнорадикального гомеостаза может оказывать влияние пренатальный материнский кортикостерон. При высоких уровнях гормона его избыток во время беременности может проникать через плацентарный барьер к плоду и подвергать плод воздействию, это может привести к задержке внутриутробного роста и повреждению головного мозга у потомства [19, 20]. Модулирующее влияние на функциональное состояние ЦНС может оказывать и изменение концентрации NO во время пренатального стресса. На ранних стадиях нейрогенеза NO участвует в развитии нейронов и способствует пролиферации клеток [21]. Есть данные, подтверждающие, что во время пренатального стресса в мозге плодов стрессированных самцов уровень NO уменьшается по сравнению с контрольными животными [22].

В нашем эксперименте в разных отделах ЦНС взрослых животных уровень метаболитов NO значительно изменился после перенесенного пренатального стресса как у самцов, так и у самок (табл. 1). В целом, более существенные изменения после перенесенного пренатального стресса были характерны для самцов и проявлялись в основном в мозжечке, спинном мозге и гипоталамусе. У самок уровень метаболитов азота изменился только в спинном мозге и мозжечке на стадии диэструса. Были отмечены и общие черты эффектов пренатального стресса на уровень метаболитов NO в рассмотренных отделах ЦНС самцов и самок: вне зависимости от пола наблюдалось существенное увеличение уровня метаболитов NO в ткани спинного мозга и снижение метаболитов NO в мозжечке (у самок проявившееся только на стадии эструса). В коре больших полушарий как у самцов, так и у самок изменений исследуемого параметра обнаружено не было.

 

Таблица 1. Изменения уровня метаболитов NO на разных уровнях ЦНС пренатально стрессированных самцов и самок крыс

Параметр	Группа
	ПС самцы, n = 10	ПС самки Э, n = 10	ПС самки ДЭ, n = 10
Спинной мозг	↑	↑↑	↑↑
Мозжечок	↓	↓	=
Гипоталамус	↓↓	=	=
Кора больших полушарий	=	=	=

Примечание: направления изменений в уровня метаболитов NO в разных отделах ЦНС пренатально стрессированных животных и их статистическая значимость: ↑ – р < 0.05, ↑↑ – р < 0.01, ↓ – р < 0.05, ↓↓ – р < 0.01 (критерий Манна – Уитни), = – отсутствие статистически значимых изменений между контрольной и опытной группами; ПС – пренатальный стресс; Э – эструс; ДЭ – диэструс.

 

Таким образом, более устойчивыми к влиянию пренатального стресса оказались филогенетически более молодые структуры (кора больших полушарий), а менее устойчивыми – филогенетически старые (спинной мозг). Такая специфика, вероятно, связана с большими адаптационными возможностями более молодой структуры. Устойчивость разных отделов ЦНС к стрессу и базовый уровень свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты во многом отличаются и зависят от интенсивности систем генерации активных форм кислорода и наличия субстрата окисления [23], а также от процентного соотношения нейронов и нейроглии [24]. Детальный анализ полученных данных показал, что у самцов, перенесших стресс с 16-го по 19-й день пренатального развития, отмечено снижение продуктов окисления NO в ткани мозжечка и гипоталамуса (p ≤ 0.05 и p ≤ 0.01 соответственно) и увеличение в спинном мозге (p ≤ 0.05). Известно, что уровень нейронов, экспрессирующих нейрональную NOS, в гипоталамусе выше, чем в других отделах мозга [25]. Возможно, такие различия связаны с полифункциональностью гипоталамических ядер и структур мозжечка, вовлеченностью гипоталамуса в развертывание адаптационных процессов и стресс-реакций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показали существенные изменения в уровне метаболитов NO у пренатально стрессированных животных, эти изменения имели половые особенности. У самцов отмечено снижение продуктов NO в мозжечке и гипоталамусе и увеличение в спинном мозге, связанные, вероятно, с морфофункциональными особенностями этих отделов. Уровень метаболитов NO в пределах изученных отделов ЦНС самок в контроле был выше, после перенесенного пренатального стресса изменился мало, значительные изменения были отмечены только в спинном мозге независимо от стадии эстрального цикла и в мозжечке на стадии эструса. Вне зависимости от пола наиболее устойчивым по отношению к пренатальному стрессу оказался уровень метаболитов NO в филогенетически более молодом отделе ЦНС – коре больших полушарий, где рассматриваемый параметр оставался без изменений. На филогенетически более древнем уровне – в ткани спинного мозга – у пренатально стрессированных животных независимо от пола и стадии эстрального цикла было отмечено существенное увеличение метаболитов NO. Учитывая значение NO как ключевой сигнальной молекулы в ЦНС, любые изменения его уровня под влиянием пренатального стресса могут нести как существенное адаптивное значение, так и иметь негативные последствия для функционального состояния ткани.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Внешнее финансирование отсутствует.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое одобрение. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Исследование проводилось с разрешения этического комитета ФГБОУ ВО “Астраханский государственный университет им В.Н. Татищева”. Эксперименты осуществляли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (2010/63/ЕU) и ФЗ РФ от 21 ноября 2011 г.

Об авторах

О. Н. Кулешова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования “Астраханский государственный университет”

Автор, ответственный за переписку.
Email: pozdniakova_olga@list.ru
Россия, Астрахань

Д. Д. Теплый

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования “Астраханский государственный университет”

Email: pozdniakova_olga@list.ru
Россия, Астрахань

Е. Д. Бажанова

Федеральное государственное бюджетное учреждение “Научно-клинический центр токсикологии имени академика С. Н. Голикова Федерального медико-биологического агентства”; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки “Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской академии наук”

Email: pozdniakova_olga@list.ru
Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы