Развивающийся мозг как объект изучения становления оксидантных и антиоксидантных систем

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что дифференцировка структур, тканей и систем мозга происходит постепенно. Значения отдельных биохимических констант варьируют в зависимости от сроков эмбрионального, раннего и позднего постнатального периода развития. В этом отношении интерес представляют системы оксидации/антиоксидации, они многокомпонентны и поэтому созревают неодновременно [1]. От степени зрелости отдельных систем во многом зависит и биологический ответ на физиологические раздражители и фармакологические агенты.

Традиционным объектом исследования являются крысы, беременность которых составляет 21–22 дня. Однако известно [2], что нейромедиаторные механизмы головного мозга к моменту рождения во многом незрелы и не могут обеспечить адекватной поведенческой реакции новорожденного животного. Крысята рождаются голыми и слепыми, и только к 9–10-му дню они прозревают и начинают вести себя активно, а способны к самообеспечению только с 17-го дня постнатального развития [3]. Это послужило основанием для проведения экспериментов с выделением так называемых критических периодов развития организма животных, когда их отсаживают от матери и выращивают в одиночных клетках в условиях полной внутривидовой и частичной сенсорной изоляции. Этими и аналогичными исследованиями было доказано [4, 5], что у крыс 3-й триместр беременности и ранний постнатальный период, обычно рассматриваемый до 14–21-го дня жизни, наиболее уязвимы для воздействия экстремальных факторов среды (в эксперименте это гипоксия, введение нейротоксинов и т. д. ). Данные показывают, что процесс созревания биохимических систем головного мозга растягивается во времени, затрагивая как пренатальный, так и постнатальный период. Исходя из известной схемы созревания головного мозга [6], основанной в основном на нейрогистологических исследованиях (рис. 1), выделяют 7 основных морфогенетических процессов (пролиферация, миграция, дифференцировка, синаптогенез, апоптоз, глиогенез и миелинизация), с помощью которых можно достаточно подробно охарактеризовать созревание структур центральной нервной системы.

 

Рис. 1. Основные морфогенетические процессы, происходящие в развивающемся мозге крыс [6, с изменениями]. Центральная вертикальная черта разделяет пренатальный и постнатальный периоды развития. По центральной оси абсцисс указаны дни развития в пренатальный и постнатальный периоды

Fig. 1. Basic morphogenetic processes occurring in the developing rat brain [6, as modified]. A central vertical line separates the prenatal and postnatal periods of development. The central abscissa axis indicates the days of development in the prenatal and postnatal periods

 

Эти процессы протекают, как правило, параллельно по законам взаимодействия и взаимопроникновения, тем не менее каждый из них можно охарактеризовать как отдельно, так и во взаимодействии с другими процессами. Морфологи объединяют эти процессы в гисто- и органогенез, но подобные понятия малопригодны для объяснения биохимических процессов, протекающих внутри клетки и на уровне синаптических контактов (синтез медиатора, его аксональный транспорт, депонирование в везикулах, высвобождение под влиянием нервного импульса, выделение в синаптическую щель, взаимодействие с рецепторами, распад или обратный захват пресинаптическим окончанием и т. д. ). В еще меньшей степени можно охарактеризовать такие процессы, как созревание ферментных систем, участвующих в синаптической передаче, и систем поддержания процессов оксидации/антиоксидации, которые вовлекают многие субстратные и ферментные системы.

Поэтому в качестве цели исследования мы выбрали изучение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню малонового альдегида и антиоксидантной защиты (АОЗ) головного мозга (активность супероксиддисмутазы и уровень восстановленного глутатиона) эмбрионов и потомства крыс в разные сроки пре- и постнатального развития.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Протокол исследования предполагал изучение головного мозга эмбрионов и потомства самок крыс Вистар, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Были отобраны 39 беременных самок массой 220–250 г, от которых получено 176 эмбрионов и крысят разного пола и возраста, включая эмбрионы 3-го триместра беременности (13–17-й дни гестации) и крысят в возрасте от 1 до 14 нед. Самок и потомство содержали в условиях вивария при инвертированном свете в режиме 8:00–20:00 при температуре 22 ± 2 °С. Животные получали ad libitum сухой брикетированный корм и воду. В каждую группу животных включали по 10–12 особей.

В биохимических исследованиях исследовали цельный мозг эмбрионов или мозг крысят, полученных после эвтаназии. Головной мозг выделяли, освобождали от оболочек, промывали Na-фосфатным буфером (50 мМ при рН = 7,4), далее проводили гомогенизацию в том же буфере в соотношении 1 : 4–6 в пересчете на массу и объем буфера. Полученный гомогенат головного мозга центрифугировали в течение 25 мин при 4000 g. Осадок удаляли, а супернатант повторно центрифугировали в течение 60 мин при 15 000 g. Полученный супернатант использовали для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) и уровня малонового диальдегида (МДА) как показателя ПОЛ. Для определения активности каталазы промежуточный осадок митохондриальной фракции один раз обрабатывали Na-фосфатным буфером (50 мМ при рН = 7,4) и проводили гомогенизацию в 1 % растворе Triton Х-100 в качестве детергента в объеме, равном объему первоначально взятого гомогената. Отобранный гомогенат центрифугировали в течение 40 мин при 15 000 g. Активность каталазы определяли в супернатанте и выражали в мкМ Н2О2 / мин · мг белка.

Состояние АОЗ головного мозга характеризовали 3 показателями: активностью СОД, каталазы и уровнем восстановленного глутатиона (ВГ), который определяли в 10 % гомогенате мозга, используя 25 мМ трис-НСl с 175 мМ КСl буфером при рН 7,4. Активность СОД определяли методом [7] по степени угнетения восстановления нитросинего тетразолия в присутствии феназинметасульфата и НАДН, соотнося с содержанием белка в пробах, оцененных унифицированным методом [8], и выражали в А/мг белка. Концентрацию ВГ измеряли по его реакции с избытком аллоксана [9] и выражали в мкМ/г. Уровень МДА как продукта ПОЛ определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [10] и выражали в мкМ/г белка.

Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи пакета программ «GraphPad Prism 6» (Graphpad Software Inc., США). Для сравнения контрольной и экспериментальных групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA и t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для представления полученных данных использовали среднее арифметическое значение и стандартную ошибку среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Активность ПОЛ в головном мозге эмбрионов, оцененная по содержанию МДА в ткани мозга, характеризовалась сравнительно низкими значениями, не превышающими 1–2 мкМ/г белка. Через 1–3 нед. после рождения уровень МДА в ткани мозга резко возрастал, постепенно снижаясь к 7–14-й неделе постнатального развития (рис. 2, а). Сходная, но менее выраженная закономерность зарегистрирована и для показателей АОЗ, в частности активности СОД (рис. 2, b) и уровня ВГ (рис. 2, d). В этих исследованиях показано, что в течение 1-й недели постнатального развития исследуемые показатели возрастают, но не так резко, как в случае с МДА. И прямо противоположную реакцию наблюдали в случае с каталазой, активность которой в головном мозге в пренатальный период была высокой (30–40 мкМ Н2О2/ мин · мг белка), а после рождения значимо снижалась (рис. 2, с).

 

Рис. 2. Динамика показателей оксидации/антиоксидации (M ± m) в головном мозге эмбрионов и потомства крыс разного возраста. По оси ординат — исследованные показатели; по оси абсцисс — время (дни, недели): а — малоновый диальдегид (мкмоль/г белка); b — супероксиддисмутаза (А/мг белка); c — каталаза (мкмоль Н2О2/мин · мг белка), d — восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Fig. 2. Dynamics of oxidation/antioxidation parameters (M ± m) in the brain of embryos and offspring of rats of different ages. The ordinate and abscissa show the studied indicators and time (days, weeks), respectively: a — malonic dialdehyde (μmol/g protein); b — superoxide dismutase (A/mg protein); c — catalase (µmol Н2О2/min · mg protein), d — reduced glutathione (µmol/g)

 

Следовательно, рождение крысят и 1-я неделя их жизни характеризуются скачкообразным повышением уровня МДА, мягким увеличением активности СОД и уровня ВГ, но значительным падением активности каталазы в ткани головного мозга. Период дальнейшего постнатального развития вплоть до половозрелости (14 нед., или 3-месячный возраст) не приводит к существенным изменениям в активности СОД, каталазы и концентрации ВГ, но вызывает 2-кратное падение уровня МДА в мозге, то есть уже в первые месяцы жизни у крыс складывается вполне стабильный статус ПОЛ и АОЗ мозговой ткани.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Приступая к обсуждению полученных результатов, прежде всего надо ответить на 2 основных вопроса:

• насколько развивающийся мозг отличается от взрослого по показателям ПОЛ и АОЗ;
• в какой мере можно перенести полученные результаты на традиционный подход к изучению функций головного мозга (двигательных, когнитивных, эмоциональных), основанный на оценке главным образом нейромедиаторных систем головного мозга?

На первый вопрос сразу напрашивается очевидный ответ: да, отличается, и значимо. Изучение динамики выбранных показателей ПОЛ и системы АОЗ показывает, что разные компоненты изученных систем по-разному изменяются в процессе созревания структур головного мозга. Так, касательно МДА, основного и традиционного лабораторного показателя ПОЛ, эти изменения достаточно драматичны, причем резкий скачок вверх мы регистрировали в 1-ю неделю постнатального периода, который составил возрастание показателя МДА в 3–3,5 раза в сравнении с пренатальным периодом (конец беременности).

По логике, на возрастание ПОЛ должны реагировать и системы АОЗ, чтобы компенсировать данные изменения в оксидантном статусе. Однако этого мы не наблюдаем, а видим мягкое повышение активности СОД и уровня ВГ в этот период. Что же касается активности каталазы, то она, напротив, резко падает приблизительно в 4 раза. Эти указывает либо на недостаточную зрелость систем оксидации/антиоксидации, либо на еще не до конца сформированную гармонию биохимического управления этими процессами. По-видимому, оба допущения верны, на что указывают работы, выполненные как в нашей лаборатории [1, 3–5], так и других исследованиях [11]. По крайней мере, наш вывод относительно достаточно быстрого во времени формирования стабильного статуса систем ПОЛ и АОЗ в первые 3 нед. постнатального периода, по-видимому, имеет достаточно оснований.

Второй поставленный вопрос касается соотношения внутриклеточных процессов оксидации/антиоксидации и традиционных нейромедиаторных механизмов, которые привлекают для объяснения реализации разных функций головного мозга (моторной, когнитивной, эмоционально-мотивационной). С помощью введения разных нейротоксинов, избирательно разрушающих дофаминергические (6-гидроксидофамин) и серотонинергические (5,7-дигидрокситриптамин) терминали головного мозга, было показано, что критическими периодами в развитии этих нейротрансмиттерных систем являются 13–14-й дни пренатального периода и 4–10-й дни постнатального периода [12]. Поскольку моноаминергические нейромедиаторные системы определяют в большей степени эмоционально-мотивационные реакции животных и человека, их нарушения в рассматриваемые периоды времени следует оценить как критические для формирования девиантного поведения, связанного с употреблением психоактивных средств [13]. Холинергическая нейротрансмиттерная система головного мозга в большей степени вовлекается в когнитивные процессы, в частности в процессы памяти, внимания, а также в осуществление моторных функций. Так как холинергическая система в головном мозге делокализована и не представлена специализированными проводящими путями, как дофамин-, норадрен- и серотонинергические системы, она выполняет более универсальные функции и в большей степени сопряжена с процессами оксидации/антиоксидации. Специальные исследования В. И. Тиханова [14] показали, что холинергические механизмы тесно связаны с оксидативным статусом человека. К сожалению, В. И. Тиханов не рассматривал онтогенетические проблемы, связанные с холинергическими системами организма. Тем не менее в его исследованиях убедительно продемонстрировано, что активация М- и Н-холинергических механизмов активирует и систему оксидации/антиоксидации, а блокада этих рецепторов, напротив, умеренно ее подавляет [15, 16].

Приведенные данные в значительной степени подтверждают положение, что системы оксидации/антиоксидации в онтогенезе развиваются параллельно с нейромедиаторными системами головного мозга и во многом обусловливают их работу. Тогда становятся понятными и критические периоды в развитии обеих систем, и возможность сопоставления полученных данных с материалами по изучению становления нейромедиаторных систем головного мозга [3, 13, 17]. Привлечение же нейроморфологических представлений о становлении (гистогенезе) отдельных процессов, которые мы рассмотрели выше, к сожалению, мало приближает нас к проблеме функционального параллелизма в развитии нейромедиаторных и оксидативных систем головного мозга.

ВЫВОДЫ

1. Головной мозг эмбрионов характеризуется низкими значениями уровней малонового диальдегида, концентрация которого резко возрастает сразу после рождения крысят.
2. Сходная, но менее выраженная закономерность регистрируется и для показателей антиоксидантной защиты (активности СОД и уровня восстановленного глутатиона).
3. Прямо противоположная реакция наблюдается в случае с каталазой, активность которой в головном мозге в пренатальный период была высокой, а после рождения значимо снижалась.
4. В период дальнейшего постнатального развития вплоть до половозрелости (14 нед., или 3-месячный возраст) не происходит существенного изменения в активности СОД, каталазы и концентрации восстановленного глутатиона, но выявляется 2-кратное падение уровня малонового диальдегида в мозге, то есть уже в первые месяцы жизни у крыс складывается вполне стабильный статус ПОЛ и систем антиоксидантной защиты мозговой ткани.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: П. Д. Шабанов, И. В. Зарубина — написание статьи, анализ данных; П. Д. Шабанов — разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. The contribution of each author: P. D. Shabanov, I. V. Zarubina — manuscript drafting, writing and pilot data analyses; P. D. Shabanov — general concept discussion.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Об авторах

Петр Дмитриевич Шабанов

Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-код: 8974-7477

доктор мед. наук, профессор, профессор кафедры фармакологии

Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Ирина Викторовна Зарубина

Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова

Email: i.v.zarubina@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-7670-2864
SPIN-код: 1902-3574

доктор биол. наук, профессор, старший преподаватель

Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Список литературы

Дополнительные файлы