Использование атомно-силовой микроскопии в комплексной оценке органов и тканей при сахарном диабете

Полный текст

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) в современной биологии и медицине все больше претендует на роль одного из важнейших бионанотехнологичных методов, что дает возможность работать с наноразмерными структурами [1]. Она относится к разряду проксимальной зондовой микроскопии. Во время работы в пределах около одного анастрема между атомами образца и кантилевера образуются силы отталкивания, а на отдалении – притяжения. При использовании может быть как контактный режим, так и бесконтактный. Применение АСМ делает уникальным исследования биологических объектов без применения фиксации, что сохраняет структуру и форму. Данный метод активно применялся нами для изучения различных тканей и органов в норме и патологии для визуализации с большим разрешением и объективной оценки механических свойств изучаемого объекта для выполнения как фундаментальных, так и диагностических задач в биологии и медицине [1, 2].

Эндокринопатии играют одну из превалирующих ролей в структуре заболеваемости в мире [3]. Сахарный диабет (СД) – это одна из патологий данной группы, которой в ближайшее десятилетие будет страдать до 10 % всех живущих на земле людей [3, 4]. АСМ раскрывает новые горизонты для ее исследования морфофункциональных особенностей данного заболевания, обеспечивая получение 3D-отображений поверхностных структур с возможным молекулярным разрешением, происходящих в режиме настоящего времени и в физиологических параметрах. Это является важным аспектом, дающим в дальнейшем возможность для разработки способов профилактики и лечения [5].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучение различных тканей (мышечной, на примере миометрия матки, костной – зубов, кровяной – эритроцитов) при СД для дополнения и уточнения имеющихся сведений по данной патологии.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфологические исследования выполнялись на кафедре патологии медицинского института НИУ БелГУ, в Научно-образовательном и инновационном центре «Наноструктурные материалы и технологии» НИУ БелГУ, кафедре патологической анатомии КГМУ.

Производился забор тканей пациентов с СД 2-го типа: зубы пациентов с СД 2-го типа (n = 15) и контрольной группы (n = 5), удаленные по поводу косметических дефектов, а также миометрий матки, полученный при операции кесарево сечение (12 образцов от женщин с СД 2-го типа, 5 – от пациентов контрольной группы). Миометрий, после стандартной обработки, заливали в парафиновые блоки. Зубы обработке не подвергались Работу выполняли в контактных режимах прерывистого, а также постоянного профиля с применением Si или SiN кантилеверов, с использованием низкого вакуума атмосферы. Дальнейший анализ и получение атомно-силового изображения произведены при помощи стандартного программного обеспечения NOVA и ImageAnalysis компании «НТ-МДТ».

Также с помощью атомно-силовой микроскопии произведено исследование эритроцитов (12 – с СД 2-го типа и 5 – контрольной группы). После забора крови у пациентов с СД 2-го типа (n = 12) и пациентов контрольной группы (n = 5) приготавливались образцы, состоящие из суспензии эритроцитов, предварительно отмытых от плазмы. После чего образцы поочередно размещали на обезжиренном предметном стекле и располагали во влажной камере Ntegra-Aura для проведения сканирования. Использование способа позволяет, помимо сокращения времени самого исследования, получать сканы клеток с высоким разрешением без нарушения их жизнедеятельности, формы и нативных размеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении эритроцитов с применением АСМ было отмечено, что у пациентов контрольной группы они имели дисковидную биконическую форму с умеренной глубиной полости (рис. 1). При этом площадь сечения частицы на уровне половины высоты эритроцита составляла (44,1 ± 3,3) μm², объём – (4,69 ± 0,41) μm³, значение локального максимума – (0,52 ± 0,08) μm, периметр сечения – (33,22 ± 1,40) μm, эффективный диаметр, определяемый как диаметр окружности, площадь которой равна площади сечения – (7,41 ± 1,39) μm (табл.). Это были в основном дискоциты, в виде овала, преимущественно свободно располагающиеся.

 

Рис. 1. Эритроциты больного с СД 2-го типа при атомно-силовой микроскопии: а – гемолиз в отдельных клетках, форма части клеток изменена, глубина их полости увеличена; б – графическое изображение рис. 1а (двухмерное изображение); в – трехмерное изображения структуры эритроцитов; г – фрагмент рис. 1в

 

Состояние эритроцитов в венозном русле у больных с сахарным диабетом 2-го типа

Исследуемые группы	n	Area, μm2	Volume, μm3	MaxZ, μm	Perimeter, μm	Diameter, μm
Контроль 36–59 лет	5	44,10 ± 3,3	4,69 ± 0,41	0,52 ± 0,08	33,22 ± 1,40	7,41 ± 1,39
СД 2-го типа 36–59 лет	12	32,50 ± 1,12*	4,10 ± 0,21*	0,69 ± 0,11*	44, 09 ± 2,03*	6,35 ± 0,20*

Примечание: Area – площадь сечения частицы на уровне половины высоты эритроцита; Volume – объем частицы; Max Z – значение локального максимума, высота эритроцита, отсчитанная от общего нулевого уровня; Perimeter – периметр сечения; Diameter – эффективный диаметр, определяемый как диаметр окружности, площадь которой равна площади сечения. * p < 0,05 по отношению к контрольной группе.

 

При СД 2-го типа регистрировались изменения площади сечения эритроцитов на уровне половины высоты и составляли соответственно: (32,5 ± 1,12) μm², (4,10 ± 0,21) μm ³, (0,69 ± 0,11) μm, (44, 09 ± 2,03) μm, (6,35 ± 0,20) μm (табл., рис. 1). Форма эритроцитов у пациентов с СД 2-го типа была нарушена при неизменном строении пор на их поверхности. Начало гемолиза, не определяемое другими методами, по данным АСМ было выражено в (21,3 ± 2,5) % эритроцитов. (3,5 ± 0,7) % клеток были с явными признаками данных изменений. Наблюдался стаз и сладж эритроцитов. В этих участках в эритроцитах выявлялось значительное нарушение формы, а также увеличение содержания выростов плазмолеммы.

При топографическом анализе наружной части эмали зуба больных с СД 2-го типа с применением АСМ нами было выявлено нарушение поверхности, не выявляемое макроскопически, с нарушением микрорельефа, даже без наличия кариеса, когда зубы удалялись в связи с патологической подвижностью (рис. 2). Цемент был в виде хорошо выраженных волокон, которые представляют собой коллагеновые фибриллы. При трехмерной визуализации ткани зуба при СД видна разница его структуры в сравнении с интактными образцами. При эндокринопатии наблюдались изменения в виде дефектов поверхности корня, выраженного бугристого рельефа. Причем такие поражения при данной патологии могут быть и при отсутствии поверхностного кариеса. Поверхностная часть корня зуба покрыта от шейки до верхушки слоем бесклеточного цемента. Данной слой находится в пределах от 21 до 38 мкм. Клеточный цемент занимает меньшую площадь: от 0,92 до 1,31 мм в контрольной группе. У людей с СД этот участок был меньше – от 14 до 29 мкм. Наиболее характерной особенностью при СД является утончение и даже потеря цементного слоя в верхней трети корня, что ведет к оголению дентина (рис. 2).

 

Рис. 2. Фрагменты коронки жевательного зуба 3.6 при СД 2-го типа. Эмаль. Отсутствие кариеса. Нарушение строение микрорельефа, особенно в районе корня зуба: а, б, в – атомно-силовая микроскопия коронки зуба; б – графическое изображение рис. 2а (двухмерное изображение); в – трехмерное изображение; г – корень (трехмерное изображение)

 

При СД 2-го типа в миометрии четко прослеживалась фрагментарная деструкция волокон с наличием между ними в отдельных участках диапедезных кровоизлияний в виде скопления эритроцитов с разрушением их формы, сладжем, тромбозом и гемолизом. Но наиболее характерными были изменения в сосудах.

Нарушения носили мозаичный характер с ишемией в одних участках с полнокровием и проявлением коагулопатии в других. Четко прослеживается изменения эндотелиоцитов с их утончением и уплощением поверхности за счет уменьшения содержания отростков плазмолеммы. Наблюдались альтеративные изменения, вплоть до фрагментарных некрозов. Именно в этих участках был виден выход эритроцитов за пределы сосудистой стенки. В полости наблюдалось прилипание эритроцитов, преимущественно с нарушением цитоархитектоники, к наружной поверхности эндотелиоцитов, также преимущественно в участках повреждения. Преимущественно в венозном отделе формировались тромбы и отдельные нити и пласты фибрина (рис. 3).

 

Рис. 3. Фрагменты миометрия матки женщин с СД 2-го типа. Начало образования тромба в спиральной артерии матки (а, б, в) и его наличие (г). Атомно-силовая микроскопия. Б – графическое изображение рис. 3а (двухмерное изображение)

 

Рис. 3 (окончание). Фрагменты миометрия матки женщин с СД 2-го типа. Начало образования тромба в спиральной артерии матки (а, б, в) и его наличие (г). Атомно-силовая микроскопия. В – трехмерное изображение; г – трехмерное изображение

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, использование АСМ позволяет изучить любые ткани как в норме, так и при патологии, в частности при СД, как в нативном состоянии, так и на фиксированном материале, что дает возможность создавать целостную картину в трехмерном изображении для описания структуры материала с целью дальнейшей разработки профилактики, диагностики и лечения.

Об авторах

Ирина Ивановна Поваляева

Детская областная клиническая больница, Белгород

Email: irina87iva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7231-6010

заместитель главного врача

Россия, Белгород

Татьяна Васильевна Павлова

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Email: Pavlova@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2360-2875

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии

Россия, Санкт-Петербург

Антон Николаевич Каплин

Курский государственный медицинский университет

Email: drkaplin46@gmail.com

кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии

Россия, Курск

Хазем Хсейно

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: Hossino@bsu.edu.ru

аспирант кафедры стоматологии общей практики, Медицинский институт

Россия, Белгород

Игорь Юрьевич Гончаров

Белгородский государственный технологический университет имени В.Г. Шухова

Email: goncharov@bsu.edu.ru

кандидат физико-математических наук, доцент кафедры физики, Белгородский государственный технологический университет имени В.Г. Шухова, научный сотрудник Центра коллективного пользования

Россия, Белгород

Любовь Арнольдовна Павлова

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: Lpavlova1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5537-2157

доктор медицинских наук, профессор кафедры патологии, Медицинский институт

Россия, Белгород

Мария Алексеевна Затолокина

Курский государственный медицинский университет; Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева

Автор, ответственный за переписку.
Email: marika1212@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9553-1597

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, Курский государственный медицинский университет; заведующая кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева

Россия, Курск; Орел

Алексей Владимирович Тверской

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: tverskoy@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1537-6564

кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой анатомии и гистологии человека, Медицинский институт

Россия, Белгород

Список литературы

Дополнительные файлы