The humoral and cellular immune response to the administration of OrthopoxVac vaccine to volunteers

S. N. Shchelkunov; Щелкунов С. Н.; E. Yu. Prudnikova; Прудникова Е. Ю.; A. A. Shestakova; Шестакова А. А.; S. N. Yakubitskiy; Якубицкий С. Н.; S. A. Pyankov; Пьянков С. А.; A. E. Nesterov; Нестеров А. Е.; S. V. Usova; Усова С. В.; M. P. Bogryantseva; Богрянцева М. П.; E. A. Nechaeva; Нечаева Е. А.; T. V. Tregubchak; Трегубчак Т. В.; A. P. Agafonov; Агафонов А. П.

doi:10.32607/actanaturae.27654

Гуморальный и клеточный иммунный ответ на введение добровольцам вакцины ОртопоксВак

Авторы: Щелкунов С.Н.¹, Прудникова Е.Ю.¹, Шестакова А.А.¹, Якубицкий С.Н.¹, Пьянков С.А.¹, Нестеров А.Е.¹, Усова С.В.¹, Богрянцева М.П.¹, Нечаева Е.А.¹, Трегубчак Т.В.¹, Агафонов А.П.¹
Учреждения:
1. Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Выпуск: Том 17, № 3 (2025)
Страницы: 104-118
Раздел: Экспериментальные статьи
URL: https://journal-vniispk.ru/2075-8251/article/view/348470
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.27654
ID: 348470

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Первая в мире противооспенная вакцина четвертого поколения ОртопоксВак, получившая государственную регистрацию в 2022 году, в процессе клинических исследований, проходивших в течение 6 месяцев, проявила себя как безопасная слабо реактогенная по сравнению с живой оспенной вакциной первого поколения, но сохранившая на том же уровне иммуногенные свойства. В представленной работе анализировали уровни специфичного гуморального и Т-клеточного иммунных ответов на внутрикожное введение добровольцам вакцины ОртопоксВак однократно в дозе 10⁷ ООЕ или двукратно в дозе 10⁶ООЕ через 1.5, 3 и 5 лет после вакцинации. Т-хелперный ответ на иммунизацию добровольцев вакциной ОртопоксВак однократно в дозе 10⁷ ООЕ сохранялся на относительно высоком уровне в течение трех лет, а затем значительно снижался. При иммунизации добровольцев этой же вакциной, но двукратно в дозе 10⁶ ООЕ, резкое снижение уровня Т-хелперов детектировали после 1.5 лет. После 1.5 лет от момента иммунизации вакциной ОртопоксВак у части пациентов происходило снижение титров вируснейтрализующих антител (ВНА). При этом при иммунизации ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ достоверных различий между группами во временных точках 1.5, 3 и 5 лет не наблюдали, а в группах, вакцинированных двукратно в дозе 10⁶ ООЕ, уровень титров ВНА после 1.5 лет достоверно снижался. На основании полученных результатов можно заключить, что вакцина ОртопоксВак при внутрикожном одноразовом введении в дозе 10⁷ ООЕ обеспечивает выраженный специфичный гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ в течение, по крайней мере, трех лет.

Ключевые слова

натуральная оспа, оспа обезьян, вирус осповакцины, вакцинация, антитела, Т-клетки

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОЕ – бляшкообразующая единица; ВНА – вируснейтрализующие антитела; ВОВ – вирус осповакцины; ВОЖ – вакцина оспенная живая; ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения; КИ – клинические исследования; ООЕ – оспообразующая единица; GMT – среднегеометрический титр; PBMC – мононуклеарные клетки периферической крови.

ВВЕДЕНИЕ

Натуральная оспа – одно из наиболее опасных и смертоносных, высококонтагиозных инфекционных заболеваний человека, а также единственное заболевание человека, которое под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) было ликвидировано в результате глобальной кампании по противооспенной вакцинации и противоэпидемическому надзору. Это достижение остается одним из величайших триумфов медицинской науки [1].

Большая часть противооспенных вакцин первого поколения, применявшихся для массовой вакцинации в рамках программы ликвидации оспы, была приготовлена из вируса осповакцины (ВОВ), выращенного на коже живых животных, главным образом телят, и в меньшей степени овец, буйволов и кроликов. Один из существенных недостатков этих вакцин – большое число тяжелых поствакцинальных осложнений, особенно среди людей с иммунодефицитом, атопическим дерматитом и у пожилых людей, ранее не вакцинированных против оспы [1, 2].

Примерно у 20–30% привитых вакциной против оспы первого поколения развивается одна или несколько побочных реакций, которые различаются по распространенности и тяжести. Более распространенные побочные реакции включают субфебрильную температуру, головную боль, лимфаденопатию, фолликулит и недомогание, в то время как значительно меньшее число вакцинированных испытывают более серьезные заболевания, включая экзему, генерализованную или прогрессирующую вакцинию, энцефалит и миоперикардит. Серьезные побочные заболевания возникают только у нескольких сотен пациентов на миллион вакцинированных, а смертельный исход может быть у одного-двух пациентов на миллион [1, 3]. Учитывая тяжелые поствакцинальные осложнения при использовании классической живой вакцины и подтверждение ликвидации натуральной оспы в 1980 г., ВОЗ настоятельно рекомендовала всем странам вакцинацию против данной инфекции в дальнейшем не проводить [1, 2].

Следует отметить, что в природных резервуарах находятся близкородственные вирусу натуральной оспы зоонозные ортопоксвирусы, такие как вирус оспы обезьян, вирус оспы коров и другие, способные инфицировать людей [4]. Прекращение противооспенной вакцинации привело к тому, что за прошедшие годы большая часть человечества (прежде всего, в возрасте до 45 лет) не имеет иммунитета против любых ортопоксвирусных инфекций. Многочисленные вспышки зоонозных ортопоксвирусных инфекций среди людей стали регистрироваться в последние годы в разных географических регионах [2, 4]. Особую озабоченность вызывает инфицирование людей вирусом оспы обезьян, которое привело к эпидемии данного ортопоксвирусного заболевания, распространившейся в 2022-2023 годах на все континенты и поразившей население более ста стран [5]. В настоящее время сложная ситуация с распространением оспы обезьян среди людей сохраняется прежде всего в Африке [6]. Это заставляет с новой силой вернуться к рассмотрению вопроса о возможном возврате оспы или подобного опасного заболевания в результате естественной эволюции агентов зоонозных ортопоксвирусных инфекций [7, 8].

Чтобы предотвратить развитие локальных вспышек инфекции в распространенные эпидемии и уменьшить риск возникновения в результате естественной эволюции высокопатогенного для человека ортопоксвируса, усилия исследователей должны быть направлены на создание безопасных живых вакцин новых поколений на основе ВОВ. Все это обусловливает научный и практический интерес и необходимость нового подхода к вакцинопрофилактике инфекций, вызванных ортопоксвирусами.

С развитием методов генетической инженерии стало возможным создавать модифицированные варианты ВОВ с помощью направленного введения целевых последовательностей в вирусный геном, удаления или нарушения конкретных генов вирулентности самого вируса [9, 10], не затрагивая гены, обеспечивающие функции размножения вируса в культуре клеток. Выключение генов вирулентности способно существенно снизить патогенные свойства ВОВ. Одним из наиболее перспективных направлений таких работ является создание методами генетической инженерии высокоаттенуированных вариантов ВОВ, обладающих иммуногенностью и протективностью, сравнимой с уровнями данных показателей у классической противооспенной вакцины первого поколения, но при этом характеризующихся существенно меньшей патогенностью.

Вариантом такой вакцины является полученная нами вакцина четвертого поколения ОртопоксВак – живая вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций на основе штамма VAC∆6 с шестью нарушенными генами (C3L, N1L, J2R, A35R, A56R и B8R), выращенного в перевиваемой культуре клеток 4647 [2, 11].

Проведение работ по исследованию длительности поствакцинального иммунного ответа у лиц, иммунизированных вакциной ОртопоксВак, в сравнении с ранее используемой в России «Вакциной оспенной живой» [12] имеет важное значение, так как это позволит определить необходимость и сроки ревакцинации при иммунизации людей вакциной четвертого поколения.

Целью данной работы было выполнение пострегистрационного исследования напряженности и длительности противооспенного гуморального и Т-клеточного иммунитета у лиц, принимавших участие в проведении I и II/III фаз клинических исследований вакцины ОртопоксВак (Вакцина для профилактики натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций на основе вируса осповакцины живая культуральная).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Общий дизайн исследования

Проведено открытое сравнительное рандомизированное исследование в параллельных группах, в котором приняли участие 76 мужчин и женщин в возрасте от 25 до 40 лет, соответствующих критериям включения и не имеющих критериев невключения, ранее принимавших участие в клинических исследованиях (КИ) вакцины ОртопоксВак I фазы (КИ VAC∆6-01/18) и II/III фаз (КИ VAC∆6-01/20) (рис. 1).

Рис. 1. Схема распределения добровольцев по группам

Группа 1 представлена 15 здоровыми добровольцами (7 мужчин и 8 женщин), принимавшими участие в клиническом исследовании VAC∆6-01/20 и вакцинированными однократно внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ.

Группа 2 представлена 15 здоровыми добровольцами (6 мужчин и 9 женщин), принимавшими участие в клиническом исследовании VAC∆6-01/20 и вакцинированными двукратно c интервалом 28 дней внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ.

Группа 3 (положительный контроль, ПК) представлена 7 здоровыми добровольцами (4 мужчины и 3 женщины), работавшими с вирусами рода ортопоксвирусов и привитыми двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной ОспаВир и через 7 дней Вакциной оспенной живой (ВОЖ) на основе штамма Л-ИВП ВОВ («Микроген», Россия) как описано [13] (ОспаВир + ВОЖ, 2020 г.).

Группа 4 (отрицательный контроль, ОК) представлена 10 здоровыми добровольцами (6 мужчин и 4 женщины), не вакцинированными ранее противооспенными вакцинами, не имевшими контакта с пациентами, вакцинированными противооспенными вакцинами, и не работавшими с вирусами рода ортопоксвирусов.

Группа 5 представлена 9 здоровыми добровольцами (3 мужчин и 6 женщин), принимавшими участие в клиническом исследовании VAC∆6-01/18 и вакцинированными однократно внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ.

Группа 6 представлена 10 здоровыми добровольцами (7 мужчин и 3 женщины), принимавшими участие в клиническом исследовании VAC∆6-01/18 и вакцинированными двукратно c интервалом 28 дней внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ.

Группа 7 (ПК) представлена 10 здоровыми добровольцами (5 мужчин и 5 женщин), принимавшими участие в клиническом исследовании VAC∆6-01/18 и вакцинированными двухэтапным методом ОспаВир + ВОЖ.

До выполнения всех процедур данного исследования от каждого пациента было получено письменное информированное согласие на включение в исследование.

Вирусы, культура клеток

В работе использовали штаммы Л-ИВП [9] и VAC∆6 ВОВ [11], а также перевиваемую линию клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1 из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Забор образцов крови у добровольцев

Забор крови проводили из локтевой вены в условиях стационара и прививочного кабинета с соблюдением правил асептики и антисептики. За один забор отбирали 30–35 мл крови, использовали вакуумные пробирки (вакутейнеры). Работа проведена на клинической базе Федерального государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Медико-санитарная часть № 163 Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУЗ МСЧ-163 ФМБА России).

Исследование получило одобрение Этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (выписка из протокола № 10 заседания Этического комитета от 14.02.2024 г.).

Для оценки гуморального иммунитета из образцов крови получали сыворотку путем осаждения форменных элементов с помощью центрифугирования в течение 10 мин при 1000 g и 4°С. Полученные сыворотки выдерживали при температуре 56°C в течение 30 мин и хранили при температуре минус 20°С.

Иммуноферментный анализ сывороток крови

Титр специфических антител определяли в ИФА c использованием медицинского изделия «Набор реагентов для иммуноферментного выявления антител класса G к антигенам поксвирусов ”Вектор ИФА Покс-IgG” по ТУ 21.10.60-096-05664012-2022» как описано [14].

Определение титра вируснейтрализующих антител в сыворотках крови

Для определения титра вируснейтрализующих антител (ВНА) проводили реакцию подавления бляшкообразования ВОВ штамм Л-ИВП на культуре клеток CV-1. Для анализа готовили четыре последовательных разведения образцов сывороток крови добровольцев с шагом два, начиная с 1:10 – 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80, при уточнении титров ВНА для образцов с нейтрализующей активностью сывороток, выходящей за пределы 1:80, дополнительно использовали двукратные разведения 1:160–1:1280. К полученным разведениям сывороток добавляли равный объем разведения ВОВ с титром около 400 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл (около 40 БОЕ/лунка). Полученные смеси инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Все разведения сывороток и вируса выполняли с использованием поддерживающей питательной среды: питательная среда ДМЕМ/F-12 (1:1) с 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФСК), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Далее 200 мкл смеси разведения сыворотки с ВОВ наносили на 90–100% монослой культуры клеток CV-1, выращенный в 24-луночном культуральном планшете, используя по три лунки на каждое разведение сыворотки. Проводили сорбцию вируса в течение 1 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СO₂, после чего добавляли поддерживающую питательную среду (1 мл/лунка) и инкубировали в течение еще 48 ч при 37°С и 5% СO2. По окончании периода инкубации культуральную среду удаляли, а клетки фиксировали и окрашивали в течение 15 мин, добавляя раствор 0.2% кристаллического фиолетового в водном растворе 9.6% этанола с 2% формальдегидом (около 0.2 мл/лунка), после чего краску удаляли, а культуральный планшет высушивали при комнатной температуре.

Подсчитывали количество бляшек (очаги разрушенного монослоя клеток округлой формы в виде белых пятен на синем фоне) в монослое культуры клеток CV-1 и определяли разведения сывороток, подавляющие образование 50% БОЕ по сравнению с количеством БОЕ в лунках с неиммунной сывороткой (группа отрицательного контроля). Расчеты проводили по методу Спирмена–Кербера, результаты выражали в виде 50% бляшкоподавляющего нейтрализующего титра.

Выделение мононуклеаров периферической крови (PBMC)

Венозную кровь добровольцев отбирали в пробирки с гепарином (10 ЕД/мл). PBMC выделяли в градиенте плотности фиколла (1.077 г/мл). Полученную суспензию клеток трижды отмывали средой ДМЕМ/F12, содержащей 5% ФСК, клетки осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 350 g и температуре (10 ± 2)°С. Осадок клеток ресуспендировали в среде ДМЕМ/F12, содержащей 15% ФСК. Далее готовили суспензию клеток с концентрацией 10 млн кл./мл и вносили по 100 мкл суспензии в лунки 96-луночного плоскодонного культурального планшета (1 × 10⁶ кл./лунка).

Внутриклеточное окрашивание клеток на цитокины

Клеточно-опосредованный иммунный ответ оценивали с помощью внутриклеточного окрашивания на цитокины после стимуляции РВМС антигеном. Каждый образец оценивали с помощью нестимулированных клеток (клетки без стимуляции, фоновый контроль), клеток, стимулированных вируссодержащим материалом (очищенный вирус осповакцины штамм VACΔ6 – 4.0 мкг общего белка), и положительного контроля, клетки после стимуляции форбол-12-миристат-13-ацетатом 50 нг/мл (Sigma-Aldrich, США) и ионофором 0.5 мкг/мл (Calcium Ionophore A23187, Sigma-Aldrich). Клетки инкубировали при температуре 37°С в атмосфере 5.0% СО₂ в течение 8 ч, далее в каждую лунку добавляли GolgiPlug (BD Biosciences, США) согласно рекомендациям производителя и дополнительно инкубировали при 37°С в атмосфере 5.0% СО₂ в течение ночи. После стимуляции клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 2% КРС. Далее клетки окрашивали в течение 40 мин при 4°С красителем Fixable Viability Stain 780 и моноклональными антителами CD3 (клон SK7, BV786), CD4 (клон RPA-T4, PerCP-Cy 5.5), СD8 (клон RPA-T8, Alexa Fluor 700), CD45RA (клон HI100, BV510), CCR7 (CD197) (клон 3D12, PE-Cy7) (BD Biosciences). Затем клетки трижды промывали 2% фосфатно-солевым буферным раствором и инкубировали в течение 20 мин со 100 мкл раствора для фиксации и пермеабилизации клеток (Fixation/Permeabilization solution, BD Biosciences). По окончании инкубации трижды промывали 1× промывочным буфером (BD Perm/Wash™ Buffer, BD Biosciences) и в течение 40 мин окрашивали моноклональными антителами к интерлейкину-2 (IL-2, клон MQ1 17H12, APC), фактору некроза опухоли (TNF, клон MAb11, PE), интерферону-γ (IFN-γ, клон B27, BV421, BD Biosciences). Клетки трижды промывали 1× промывочным буфером и фиксировали в 300 мкл 1× буфера (BD CellFix, BD Biosciences). Фиксированные клетки анализировали на проточном цитометре ACEA NOVOCite Quanteon 4025 (Agilent Technologies, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения NovoExpress версия 1.5.0.

При выполнении цитометрического анализа использовали следующий порядок гейтирования (рис. 2). В координатах прямого и бокового светорассеяния выделяли лимфоцитарную фракцию (рис. 2А), далее отделяли синглеты (одиночные клетки): по оси абсцисс – интегральный сигнал прямого светорассеяния, по оси ординат – пиковый сигнал прямого светорассеяния (рис. 2Б). Из одиночных клеток выделяли живые клетки, негативные по APC-Cy7 (рис. 2В). По уровню экспрессии CD3 гейтировали Т-клетки, позитивные по BV786 (рис. 2Г). Дифференциацию цитотоксических Т-лимфоцитов (фенотип CD3+CD8+) от Т-хелперов (фенотип CD3+CD4+) проводили согласно гистограмме на рис. 2Д. На графике рис. 2Е указаны Т-хелперы, позитивные по цитокинам TNF и IFN-γ.

Рис. 2. Тактика гейтирования для идентификации основных популяций Т-клеток (см. пояснения в тексте)

Статистический анализ данных

Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для трех и более групп. Сравнение между двумя группами проводили при помощи F-критерия. Различия в полученных результатах считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение в ИФА антител, специфичных к ВОВ

Надежным критерием эффективности вакцинации является использование в качестве сравнительного эталона титров антител в образцах контрольных групп: в группе образцов отрицательного контроля (ОК), полученных от добровольцев, не вакцинированных оспенными вакцинами, не имевших контакта с пациентами, вакцинированными оспенными вакцинами, и не работавших с вирусами рода ортопоксвирусов; в группе образцов положительного контроля (ПК), полученных от добровольцев, вакцинированных препаратом первого поколения, через 3 года и 5 лет после вакцинации.

В опытных группах КИ II/III фаз через 3 года после вакцинации число добровольцев с титрами ИФА ≥ 1:100 составило 86.7% при однократной вакцинации ОртопоксВак в дозе 10⁷ООЕ и 92.8% – при двукратной вакцинации в дозе 10⁶ООЕ. Через 5 лет в группах добровольцев КИ I фазы образцов сывороток с титрами ниже 1:100 не выявлено.

Установлено, что величина среднегеометрического титра (GMT) выявляемых методом ИФА специфических IgG составила 46 в группе ОК с диапазоном погрешности от 36 до 58 для 95% доверительного интервала.

Аналогичные величины в остальных контрольных и экспериментальных группах значительно отличались и имели намного большие диапазоны погрешности. Так, через 3 года от момента вакцинации значения GMT составили 212 (от 121 до 372), 292 (от 155 до 555) и 518 (от 137 до 1952) в группах 10⁷, 2 × 10⁶ и ПК соответственно. Через 5 лет после вакцинации величины GMT составили в таких же группах соответственно 1131 (от 619 до 2065), 510 (от 251 до 1038) и 379 (от 204 до 704). Логарифмическая интерпретация полученных данных приведена на рис. 3.

Рис. 3. Логарифмы титров ИФА специфичных IgG к антигенам ВОВ в сыворотках крови добровольцев, участвующих в клинических испытаниях вакцины ОртопоксВак. ОК – группа сравнения (отрицательный контроль) – добровольцы, не вакцинированные оспенными вакцинами, не имевшие контакта с пациентами, вакцинированными оспенными вакцинами, и не работавшие с вирусами рода ортопоксвирусов; ПК – группа положительного контроля – группа добровольцев, привитых двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной ОспаВир и через 7 дней Вакциной оспенной живой на основе штамма Л-ИВП ВОВ (Микроген); 10⁷ – группа добровольцев, привитых однократно внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ/0.2 мл; 2×10⁶ – группа добровольцев, привитых двукратно с интервалом 28 дней внутрикожно в дозе 10⁶ ООЕ/0.2 мл. Значимость различий между группами определяли по F-критерию. Каждая точка соответствует одному добровольцу. Горизонтальные линии – значения GMT каждой группы

Достоверные отличия выявлены только в группе ОК по отношению к другим трем группам через 3 года и через 5 лет после вакцинации (рис. 3). В остальных парах групп отличия недостоверны.

Определение титров вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации ВОВ

Важную роль в формировании протективного иммунитета против оспы и других ортопоксвирусных инфекций играют вируснейтрализующие антитела [15, 16]. Определяемая величина титров ВНА может зависеть от пары вирус–культура клеток и особенностей используемой методики. Поэтому надежным критерием эффективности вакцинации по данному показателю является использование вакцины первого поколения в качестве контрольной, эффективность которой против натуральной оспы была показана ранее.

Выполненные нами исследования показали (рис. 4), что через 1.5 года после иммунизации как вакциной ОртопоксВак, так и ВОЖ во всех группах вакцинированных добровольцев уровень ВНА был достоверно выше, чем у добровольцев группы ОК, тогда как достоверных различий в величинах титров ВНА между сравниваемыми группами привитых добровольцев не выявлено.

Рис. 4. Нейтрализующая активность сывороток крови добровольцев, вакцинированных в рамках I и II/III фаз клинических исследований вакцины ОртопоксВак. Титры вируснейтрализующих антител определены с помощью реакции подавления бляшкообразования ВОВ (штамм Л-ИВП) на культуре клеток CV-1. Данные представлены в виде –lg; каждая точка соответствует одному добровольцу; горизонтальные линии – уровни GMT антител в группах; значимость различий между группами определяли по F-критерию. Представлены данные по титрам ВНА через 1.5, 3 и 5 лет для: А – группа добровольцев, привитых однократно внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ/0.2 мл; Б – группа добровольцев, привитых двукратно с интервалом 28 дней внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ/0.2 мл; В – группа положительного контроля (добровольцы, привитые двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной ОспаВир и через 7 дней Вакциной оспенной живой); ОК – группа сравнения (отрицательный контроль) – добровольцы, не вакцинированные оспенными вакцинами, не имевшие контакта с пациентами, вакцинированными оспенными вакцинами, и не работавшие с вирусами рода ортопоксвирусов

При анализе сывороток крови пациентов группы ОК с использованием реакции торможения бляшкообразования величина GMT ВНА составляла 1:7.

В опытных группах КИ II/III фаз через 1.5 года после вакцинации число добровольцев с титрами ВНА ≥ 1:10 составило 60.0% при однократной вакцинации ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ и 73.3% – при двукратной вакцинации в дозе 10⁶ ООЕ. У всех добровольцев, привитых ВОЖ, титр ВНА был выше 1:10.

В этих же группах число добровольцев с титрами ВНА от 1:10 и более через 3 года составило 53.3% при однократной иммунизации вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ и 57.1% – при двукратной вакцинации в дозе 10⁶ ООЕ, что указывает на постепенное снижение титра ВНА с течением времени после вакцинации. У всех изученных добровольцев, привитых ВОЖ, титр ВНА превышал 1:10.

Число добровольцев, участвовавших в КИ I фазы, с титрами ВНА ≥ 1:10 через 5 лет составило 77.8% при однократной вакцинации ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ и 67.7% – при двукратной вакцинации в дозе 10⁶ ООЕ. Число добровольцев, вакцинированных двухэтапным методом вакциной первого поколения, с титрами ВНА от 1:10 и более через 5 лет составило 88.9% (рис. 4).

Через 3 года и 5 лет после иммунизации в группах лиц, двукратно вакцинированных ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ, наблюдали достоверное снижение уровней ВНА по сравнению с уровнем, определенным через 1.5 года после вакцинации (рис. 4Б). В группах добровольцев, привитых ОртопоксВак однократно в дозе 10⁷ ООЕ, наблюдали некоторое снижение титров ВНА через 3 года и 5 лет, но без достоверных отличий от титров ВНА через 1.5 года после вакцинации (рис. 4А).

Не выявлено достоверных различий в титрах ВНА между группами пациентов, привитых двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной, а затем ВОЖ, через 1.5, 3 года и 5 лет (рис. 4В).

Оценка Т-клеточного противооспенного иммунитета

Клеточно-опосредованный иммунный ответ определяли, используя протокол внутриклеточного окрашивания цитокинов, который выявляет специфичные Т-клетки благодаря их способности продуцировать цитокины, включая IFN-γ, TNF и IL-2, после костимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) штаммом VACΔ6 ВОВ ex vivo (см. раздел «Экспериментальная часть»).

Через 1.5 года после вакцинации в образцах РВМС цитометрически выявили присутствие специфичных для ВОВ клеток – как Т-хелперов (CD4+), так и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). После 20-часовой стимуляции РВМС штаммом VACΔ6 ВОВ наблюдали увеличение количества CD4+IFN-γ+ и CD8+IFN-γ+ Т-клеток. При этом до 80–90% антигенспецифичных клеток приходилось на клетки с тройной (CD4+IFN-γ+TNF+IL-2+) или двойной (CD8+IFN-γ+TNF+) экспрессией цитокинов.

У большинства добровольцев групп, вакцинированных ОртопоксВак (как однократно в дозе 10⁷ ООЕ, так и двукратно в дозе 10⁶ ООЕ), выявляли специфичные к ВОВ CD8+ Т-клетки. При этом до 90% клеток популяции CD8+IFN-γ+TNF+ были отрицательными по маркеру CD57, что свидетельствует о том, что эти Т-клетки не достигли состояния терминальной дифференцировки/истощения. В обеих группах добровольцев, иммунизированных ОртопоксВак, уровень клеток CD8+IFN-γ+TNF+ достоверно превосходил аналогичные показатели для группы положительного контроля – добровольцев, иммунизированных противооспенной вакциной первого поколения (рис. 5).

Рис. 5. Процентное содержание ВОВ-специфичных CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ и TNF, в образцах PBMC от добровольцев, вакцинированных противооспенной вакциной в рамках клинических исследований, через 1.5 года после вакцинации. ОК – группа сравнения (отрицательный контроль) – добровольцы, не вакцинированные оспенными вакцинами, не имевшие контакта с пациентами, вакцинированными оспенными вакцинами, и не работавшие с вирусами рода ортопоксвирусов; ПК – группа положительного контроля, состоящая из добровольцев, привитых двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной ОспаВир и через 7 дней Вакциной оспенной живой на основе штамма Л-ИВП ВОВ (Микроген); 10⁷ – группа добровольцев, привитых однократно внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ/0.2 мл; 2×10⁶ – группа добровольцев, привитых двукратно с интервалом 28 дней внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ/0.2 мл. Значимость различий между группами определяли по F-критерию. Каждая точка соответствует одному добровольцу

Через 1.5 года уровень Т-хелперов CD4+IFN-γ+TNF+IL-2+ в обеих группах добровольцев, привитых ОртопоксВак, не имел достоверных отличий от группы, иммунизированной Вакциной оспенной живой первого поколения (рис. 6).

Рис. 6. Процентное содержание ВОВ-специфичных CD4+ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, TNF и IL-2, в образцах PBMC от добровольцев, вакцинированных противооспенной вакциной в рамках клинических исследований. А – группы добровольцев, привитых однократно внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ/0.2 мл; Б – группы добровольцев, привитых двукратно с интервалом 28 дней внутрикожно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ/0.2 мл. ОК – группа сравнения (отрицательный контроль) – добровольцы, не вакцинированные оспенными вакцинами, не имевшие контакта с пациентами, вакцинированными оспенными вакцинами, и не работавшие с вирусами рода ортопоксвирусов; ПК – группа положительного контроля – группа добровольцев, привитых двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной ОспаВир и через 7 дней Вакциной оспенной живой на основе штамма Л-ИВП ВОВ (Микроген). Значимость различий между группами определяли по F-критерию. Каждая точка соответствует одному добровольцу

Дополнительно анализировали экспрессию маркеров памяти CCR7 (CD197) и CD45RA в специфичных к ВОВ CD4+ и CD8+ Т-клетках. В популяции ВОВ-специфичных CD4+ Т-клеток доля эффекторных клеток памяти ТЕМ (CCR7-CD45RA-) составляла в основном 80–90%, клеток центральной памяти TCM (CCR7+CD45RA-) – 5–10%, терминально дифференцированных эффекторных клеток памяти TEMRA (CCR7-CD45RA+) – 2–5% и до 1% популяции представлена наивными Т-клетками (CCR7+CD45RA+) (табл. 1).

Таблица 1. Распределение специфичных к вирусу осповакцины полифункциональных CD4+ Т-клеток по экспрессии маркеров CCR7 (CD197) и CD45RA через 1.5 года после вакцинации противооспенными вакцинами

Группы	№ сыворотки крови	Т_CМ – клетки центральной памяти CCR7+CD45RA-	Наивные Т-клетки CCR7+CD45RA+	Т_ЕМ – клетки эффекторной памяти CCR7-CD45RA-	T_EMRA CCR7-CD45RA+
Группа «ОртопоксВак, 10⁷ однократно»	0-4-12	6.8±3.6	нд*	89.4±4.1	3.8±0.6
	0-4-17	7.5±0.5	1.7±0.8	28.0±1.0	62.8±1.8
	0-4-8	14.7±6.4	нд	85.3±6.4	нд
	0-4-15	8.2±0.3	нд	87.0±0.3	4.7±0.6
	0-4-3	5.3±0.2	0.6±0.8	85.2±3.1	8.9±4.1
	0-4-16	7.2±0.1	нд	92.5±0.7	нд
	0-4-10	5.9±2.6	нд	90.0±3.3	4.2±5.9
	0-4-11	6.0±2.9	нд	92.1±2.9	2.0±0.1
	0-4-13	9.1±0.5	нд	88.7±0.1	2.2±0.3
	0-4-14	4.2±5.9	нд	92.0±0.5	3.8±0.4
	0-4-1	6.1±2.1	0.5±0.7	88.1±0.3	5.3±1.1
	0-4-2	7.8±4.6	нд	89.9±1.4	2.3±3.2
	0-4-5	4.4±1.2	нд	91.2±4.1	4.4±2.9
	0-4-9	13.8±3.2	нд	84.2±3.2	2.0±0.1
	0-4-6	4.9±1.0	нд	93.1±2.0	2.1±2.9
Группа «ОртопоксВак, 10⁶ двукратно»	0-5-3	5.6±0.9	нд	88.8±1.8	5.6±0.9
	0-5-16	4.9±0.9	нд	85.3±2.2	9.8±1.1
	0-5-4	14.0±2.2	нд	84.9±3.7	1.1±0.1
	0-5-5	8.2±2.5	1.4±2.0	80.8±17.3	8.6±1.6
	0-5-6	3.8±1.4	нд	95.7±4.7	нд
	0-5-8	5.3±0.8	2.9±4.2	81.1±6.5	10.6±1.1
	0-5-9	8.8±2.3	0.3±0.4	87.3±2.1	3.6±2.1
	0-5-11	6.1±3.4	0.6±0.3	90.1±2.0	3.2±0.3
	0-5-12	7.6±6.4	нд	90.9±8.6	1.5±1.1
	0-5-17	12.7±0.8	1.3±1.9	84.8±2.3	1.1±0.1
	0-5-18	10.4±2.0	3.3±0.1	75.8±0.8	10.5±1.1
	0-5-1	6.8±0.8	нд	86.2±3.5	7.0±2.7
	0-5-2	7.3±0.4	1.0±0.1	91.2±0.4	0.5±0.7
	0-5-10	6.3±0.1	0.8±0.4	92.4±0.3	0.5±1.1
	0-5-7	9.5±2.1	0.4±2.1	86.0±1.5	2.0±2.8
Группа «положительный контроль»	0-2-34	6.3±1.3	5.3±0.9	77.1±3.2	11.4±1.2
	0-2-32	1.9±0.8	нд	93.1±1.1	5.1±2.3
	0-2-2	12.2±0.2	1.2±0.1	72.5±2.8	14.1±2.1
	0-2-3	9.0±2.7	2.2±0.1	59.6±1.6	29.3±3.3
	0-2-30	7.3±2.8	нд	90.9±5.4	1.9±0.6
	0-2-36	4.2±1.2	1.7±0.2	79.6±4.4	14.6±3.1

* Примечание: нд – не детектировали (ниже уровня чувствительности метода).

В популяции ВОВ-специфичных CD8+ Т-клеток доля Т_ЕМ (CCR7-CD45RA-) составляла около 20%, а T_EMRA (CCR7-CD45RA+) – до 80%.

Через 3 года и 5 лет после иммунизации как ВОЖ, так и вакциной ОртопоксВак в препаратах РВМС добровольцев после костимуляции ВОВ уровень специфичных CD8+ Т-клеток был ниже предела обнаружения в используемом методе.

У пациентов, иммунизированных ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ, через 3 года продукция Т-хелперов CD4+IFN-γ+TNF+IL-2+ сохранялась на прежнем уровне, но через 5 лет значительно снизилась (рис. 6А). У добровольцев, привитых двукратно вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ, уже к третьему году после вакцинации уровень ВОВ-специфичных Т-хелперов существенно снизился и сохранялся на низком уровне до 5 лет (рис. 6Б).

Через 3 года после иммунизации во всех группах добровольцев в популяции ВОВ-специфичных CD4+ Т-клеток доля эффекторных клеток памяти Т_ЕМ (CCR7-CD45RA-) в основном составляла 80–90%, клеток центральной памяти T_CM (CCR7+CD45RA-) – 5–10%, T_EMRA (CCR7-CD45RA+) – 2–10% и до 1% – наивных Т-клеток (CCR7+CD45RA+) (табл. 2). Такое распределение клеток по маркерам памяти CCR7 (CD197) и CD45RA характерно как для добровольцев, иммунизированных вакциной четвертого поколения ОртопоксВак, так и для добровольцев, вакцинированных двухэтапным методом Вакциной оспенной инактивированной и затем ВОЖ первого поколения.

Таблица 2. Распределение специфичных к вирусу осповакцины полифункциональных CD4+ Т-клеток по экспрессии маркеров CCR7 (CD197) и CD45RA через 3 года после вакцинации противооспенными вакцинами

Группы	№ сыворотки крови	Т_CМ – клетки центральной памяти CCR7+CD45RA-	Наивные Т-клетки CCR7+CD45RA+	Т_ЕМ – клетки эффекторной памяти CCR7-CD45RA-	T_EMRA CCR7-CD45RA+
Группа «ОртопоксВак. 10⁷ однократно»	155	6.6±2.2	0.5±0.1	87.2±0.9	5.8±0.7
	158	5.8±3.0	нд*	91.6±6.7	2.6±0.6
	164	12.9±4.1	нд	87.1±4.1	нд
	166	7.5±1.0	нд	82.8±4.7	6.7±1.7
	199	7.0±0.2	0.6±0.2	86.9±0.1	5.6±0.1
	206	11.3±5.2	нд	86.8±6.1	1.9±0.9
	209	10.2±0.5	нд	86.4±1.5	1.3±1.8
	216	10.9±2.7	0.7±0.1	85.4±2.4	3.1±0.4
	222	10.8±2.2	нд	86.1±0.8	3.1±3.0
	223	14.2±1.9	1.7±0.6	82.3±4.0	1.8±2.5
	229	7.7±0.1	нд	54.6±0.5	36.7±0.4
	246	8.8±2.9	нд	87.9±7.5	3.3±1.6
	249	7.6±1.5	1.1±0.3	85.7±0.9	5.6±2.1
	246	11.0±1.0	0.8±1.1	85.6±5.4	2.7±0.5
	259	8.0±0.6	нд	89.7±1.4	2.3±0.7
Группа «ОртопоксВак. 10⁶ двукратно»	059	9.2±3.1	2.2±1.1	82.6±3.8	6.0±0.2
	089	3.5±4.9	нд	88.8±3.6	7.8±2.5
	095	6.1±1.2	2.6±0.7	89.6±0.1	1.7±0.3
	098	7.1±0.1	нд	92.4±9.4	0.1±0.1
	108	3.8±1.7	0.6±0.3	85.8±2.1	9.8±2.1
	106	8.0±0.2	нд	88.2±2.5	3.8±1.2
	105	6.0±1.3	1.1±0.4	90.6±1.2	2.3±0.1
	104	7.1±1.2	0.6±0.2	88.4±1.2	3.9±0.2
	103	9.0±2.8	нд	81.2±1.7	9.8±2.9
	178	4.1±3.2	0.9±0.3	87.6±4.9	7.4±2.4
	177	9.6±1.3	нд	90.8±9.3	2.6±0.1
	109	6.7±0.1	нд	86.4±1.8	6.8±1.8
	255	6.5±0.7	нд	90.5±0.7	3.0±0.1
	256	7.3±0.4	нд	91.8±0.4	2.0±0.1
	257	6.0±1.4	нд	93.9±7.1	2.5±1.3
Группа «положительный контроль»	BLV	7.1±1.6	0.5±0.7	90.5±3.9	1.9±0.5
	DGV	5.9±0.8	0.7±0.1	75.7±0.6	17.7±1.3
	RAS	5.0±0.1	0.4±0.5	79.3±2.9	15.3±2.4
	GTA	13.0±2.6	0.3±0.4	83.6±3.4	3.2±0.8
	FEN	7.7±2.9	нд	68.3±9.5	24.0±1.4
	NIN	9.8±1.6	2.9±1.2	87.2±1.4	нд
	LMP	7.9±1.7	3.7±0.1	67.1±1.6	21.3±3.4

* Примечание: нд – не детектировали (ниже уровня чувствительности метода).

ОБСУЖДЕНИЕ

Сложность получения новой безопасной оспенной вакцины заключается в необходимости снижения вирулентности вакцинного штамма ВОВ при одновременной индукции достаточного и долговременного уровня гуморального и клеточного иммунного ответа. Критерии оценки уровня иммунитета, развившегося у человека в ответ на противооспенную вакцинацию и обеспечивающего полную защиту от ортопоксвирусных инфекций, до сих пор не установлены. Имеются лишь единичные разрозненные работы, в которых сделана попытка выявить такие критерии.

Исторически первым критерием оценки иммунного ответа на инфекцию ВНО или вакцинацию ВОВ было определение уровня ВНА в сыворотках крови пациентов. Mack и соавт. [17] показали, что люди с титром ВНА к ВОВ <1:32 более чувствительны к инфицированию при контакте с больными (20% контактных пациентов заболели) по сравнению с теми, у кого титр ВНА был ≥1:32 (заболел 1% контактных пациентов). Показано также, что во время эпидемии оспой заболели 14% контактных, ранее не вакцинированных пациентов с титром ВНА к ВОВ <1:20, в то время как пациенты с титром ВНА ≥1:20 оспой не заразились [18]. При этом следует отметить, что все вакцинированные ранее пациенты, в том числе с титром ВНА <1:10, не заражались оспой при контакте с больными. Защитный эффект инъекционного препарата противооспенного иммуноглобулина (vaccinia immune globulin) позволил сделать вывод о том, что даже низкий уровень ВНА может обеспечивать достаточную степень защиты против оспы [19].

Протективный иммунитет к оспе обеспечивается не только ВНА, важную роль в защите от данной инфекции играет также клеточный иммунный ответ [15, 19–21]. Однако в период проведения мероприятий по ликвидации оспы методы анализа клеточно-опосредованного иммунного ответа еще не были достаточно развиты, поэтому критерии протективного уровня Т-клеточного ответа на противооспенную вакцинацию до сих пор не определены [16, 22].

Т-клетки участвуют в ранней идентификации и подавлении вирусных инфекций, а также поддерживают выработку антител В-клетками. Эта центральная роль Т-клеток делает их важной мишенью для оценки иммунного ответа на инфекцию или вакцинацию.

Вакцина против оспы индуцирует устойчивые клеточно-опосредованные иммунные ответы со стороны CD4+ и CD8+ Т-клеток, популяции которых достигают максимума через две–четыре недели после иммунизации, а затем сокращаются, сохраняя стабильные Т-клетки памяти [23, 24]. Следует отметить, что популяция CD8+ Т-клеток памяти снижается быстрее, чем популяция CD4+ Т-клеток памяти [25]. Потребность в CD4+ Т-клетках для защиты очевидна, поскольку антитела, специфичные к ВОВ, не формируются у животных, лишенных CD4+ Т-клеток [26, 27]. Также CD4+ Т-клетки необходимы для оптимальной функции цитотоксических T-лимфоцитов и формирования иммунологической памяти [28].

Основной трудностью доказательства эффективности новых противооспенных вакцин является невозможность напрямую продемонстрировать, что вновь созданные вакцины индуцируют защитный (протективный) иммунитет против оспы у людей. Так как натуральная оспа была ликвидирована, невозможно протестировать эффективность новых вакцин в отношении естественного заболевания. Вместо этого новые вакцины в клинических испытаниях должны тестироваться по доступным параметрам и сравниваться с ранее используемыми в период ликвидации оспы противооспенными вакцинами первого поколения [16, 23].

11 ноября 2022 года Министерство здравоохранения Российской Федерации зарегистрировало первую в мире противооспенную аттенуированную вакцину четвертого поколения ОртопоксВак (Вакцина для профилактики натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций на основе вируса осповакцины живая культуральная). Эта вакцина получена с использованием штамма Л-ИВП ВОВ, применяемого в России в качестве противооспенной вакцины первого поколения (Вакцина оспенная живая) [2, 11], в геноме которого методами генетической инженерии направленно инактивированы гены, кодирующие гамма-интерферонсвязывающий белок (B8R), комплементсвязывающий белок (C3L), Bcl-2-подобный ингибитор апоптоза (N1L), гемагглютинин (A56R), тимидинкиназу (J2R) и ген A35R, белковый продукт которого ингибирует представление антигенов главным комплексом гистосовместимости класса II, иммунное праймирование T-лимфоцитов и последующий синтез хемокинов и цитокинов. Созданный штамм ВОВ получил название VAC∆6 [11]. При проведении комплекса доклинических испытаний [29], а затем КИ фаз I и II/III было показано, что вакцина ОртопоксВак является слабо реактогенным и безопасным препаратом, иммунологическая активность которого сопоставима с активностью используемой в России противооспенной вакцины первого поколения.

Значения GMT ВНА в сыворотках крови добровольцев на 60, 90 и 180 сутки после двукратной иммунизации вакциной ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ составили 79.4, 75.9 и 69.2. После однократного введения ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ данные показатели были 138.0, 31.7 и 31.6 соответственно. Значения GMT ВНА в сыворотках крови добровольцев, привитых двухэтапным методом вакциной первого поколения, составляли в те же временные периоды 104.7, 52.5 и 63.1.

Как видим, постепенное снижение титров ВНА наблюдалось в течение 6 месяцев во всех изученных группах вакцинированных добровольцев.

Следует отметить, что ОртопоксВак имеет более высокую иммуногенность по сравнению с получившей широкое распространение в последние годы противооспенной вакциной третьего поколения MVA [30]. Эта аттенуированная вакцина является нереплицирующейся в организме человека и поэтому для достижения удовлетворительного иммунного ответа вводится двукратно в высокой дозе. В клиническом исследовании было показано, что в сыворотках крови двух групп добровольцев после двукратной иммунизации препаратами жидкой или лиофильно высушенной форм MVA на 14 сут после второй инъекции значения GMT ВНА составили 45.2 и 77.6 соответственно, а на 180 сут снизились до 10.2 и 11.7 соответственно [31].

Согласно действующим в России методическим указаниям «Проведение вакцинопрофилактики натуральной оспы. МУ 3.3.1.2044-06» очередную ревакцинацию вакциной первого поколения людей из групп риска, кроме непосредственно работающих с вирусами натуральной оспы и оспы обезьян, проводят через 5 лет. Работающих с вирусами натуральной оспы и оспы обезьян ревакцинируют через 3 года.

Учитывая измененную генетическую программу штамма ВОВ VAC∆6 по сравнению с исходным штаммом Л-ИВП, важное значение имело изучение длительности и напряженности поствакцинального иммунного ответа у лиц, иммунизированных вакциной ОртопоксВак. В процессе выполненных ранее КИ развитие гуморального иммунного ответа оценивали лишь в течение 6 месяцев после вакцинации, продукцию ВОВ-специфичных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов при этом не измеряли. Нами оценены уровни гуморального и Т-клеточного ответа на внутрикожное введение ОртопоксВак через 1.5 и 3 года у добровольцев II/III фаз КИ и через 5 лет у добровольцев I фазы КИ в сравнении с лицами, привитыми оспенной вакциной первого поколения.

Для оценки гуморального иммунного ответа использовали общепринятые методики: определение титра специфических антител в ИФА и в реакции нейтрализации ВОВ на культуре клеток.

Оценка титров ВОВ-специфичных антител в ИФА (рис. 3) выявила значительные индивидуальные различия между добровольцами в каждой из сравниваемых групп, что соответствует опубликованным данным и может быть обусловлено полиморфизмом генов, связанных с функционированием иммунной системы пациентов [13, 32, 33]. Важно отметить, что выраженный ВОВ-специфичный гуморальный ответ регистрировался и через 3 года и через 5 лет после иммунизации как вакциной первого поколения, так и созданной вакциной четвертого поколения ОртопоксВак. При этом достоверных различий между сравниваемыми группами не выявлено.

После 1.5 лет от момента иммунизации вакциной ОртопоксВак у части пациентов происходило снижение титров ВНА (рис. 4А,Б). При этом следует отметить, что при иммунизации ОртопоксВак в дозе 10⁷ ООЕ достоверных различий между группами во временных точках 1.5, 3 года и 5 лет не наблюдали (рис. 4А), а в группах, вакцинированных двукратно в дозе 10⁶ ООЕ, уровень титров ВНА после 1.5 лет достоверно снижался (рис. 4Б).

Различия в проценте добровольцев с титром ВНА >1:10 в точках 3 года и 5 лет после вакцинации обусловлены тем, что в эти группы входят разные добровольцы, принявшие участие в КИ II/III фаз и I фазы соответственно.

Цитометрические исследования препаратов РВМС вакцинированных добровольцев через 1.5 года после иммунизации показали наличие специфичных к ВОВ Т-клеток как Т-хелперов (CD4+), так и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). При этом клеточно-опосредованный иммунный ответ Т-хелперов был более выражен, чем цитотоксических Т-лимфоцитов. Уровни CD8+ клеток в обеих группах добровольцев, иммунизированных ОртопоксВак, достоверно превышали показатели в группе положительного контроля (рис. 5), что, по-видимому, обусловлено различиями в генетических программах рекомбинантного VAC∆6 и исходного штамма Л-ИВП ВОВ.

Вакцина ОртопоксВак через 1.5 года после вакцинации индуцировала эффективный Т-хелперный клеточной иммунный ответ к ортопоксвирусам независимо от дозы и схемы применения (рис. 6).

При изучении внутриклеточных цитокинов после костимуляции аттенуированным штаммом VAC∆6 ВОВ препаратов РВМС добровольцев, привитых как вакциной первого поколения, так и вакциной четвертого поколения, через 3 года выявили специфичные к вирусу Т-клеточные иммунные ответы только со стороны Т-хелперов. Специфичные к ВОВ цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) детектировали только у одного добровольца после двукратного применения ОртопоксВак в дозе 10⁶ ООЕ.

Специфичные к ВОВ Т-хелперы детектировали как через 3 года, так и через 5 лет после вакцинации ОртопоксВак, однако интенсивность клеточно-опосредованного иммунного ответа варьировала в зависимости от дозы и схемы применения. Т-хелперный ответ на иммунизацию добровольцев вакциной ОртопоксВак однократно в дозе 10⁷ ООЕ сохранялся на относительно высоком уровне в течение 3 лет, а затем значительно снижался. При иммунизации пациентов этой же вакциной, но двукратно в дозе 10⁶ ООЕ резкое снижение уровня Т-хелперов детектировали после 1.5 лет (рис. 6). Специфичные Т-клетки в основном имели фенотип эффекторных клеток памяти (табл. 1, 2), что указывает на активное взаимодействие с антигеном.

Процент добровольцев с клеточно-опосредованным иммунным ответом к ВОВ после применения противооспенной вакцины четвертого поколения ОртопоксВак составил 100% как через 3 года, так и через 5 лет независимо от использованной дозы и схемы применения.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что вакцина ОртопоксВак при ее внутрикожном одноразовом введении в дозе 10⁷ ООЕ обеспечивает выраженный специфичный гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ в течение не менее 3 лет. Для выбора схемы ревакцинации вакциной ОртопоксВак с целью достижения более продолжительного протективного иммунитета против ортопоксвирусных инфекций необходимы дополнительные клинические исследования.

Работа выполнена в рамках государственного задания ГЗ-1/24 ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (номер государственного учета НИР Рег. № 124030100120-8).

Об авторах

С. Н. Щелкунов

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: snshchel@rambler.ru
Россия, Кольцово, Новосибирская область, 630559