Оценка степени повреждения побегов краснолистных и зеленолистных сортов яблони морозом с использованием системы визуализации флуоресцентных изображений их срезов

Полный текст

Введение

Неблагоприятные условия в период перезимовки – один из главных факторов, лимитирующих распространение, продуктивность и долговечность сортов яблони в средней зоне садоводства РФ. Сильные морозы, резкие снижения температуры, особенно после оттепелей, наносят серьезный урон насаждениям плодовых растений. Поэтому подтвержденная зимостойкость – один из ключевых параметров для успешной интеграции нового сорта в технологическую схему производственного процесса. В связи с невозможностью прогнозирования наступления пороговых значений повреждающих факторов и множественностью потенциальных факторов повреждения при диагностике уровня зимостойкости общепринят метод прямого лабораторного промораживания (Тюрина и др., 2002; Кичина, 2011, Ожерельева и др., 2019). Этот метод дает возможность оперативно получить информацию о зимостойкости генотипов по основным ее компонентам. Степень устойчивости тканей при этом оценивается визуально, по степени их побурения после искусственного промораживания и отращивания. При этом глазомерная оценка зеленолистных сортов яблони обычно затруднений не вызывает, но при изучении краснолистных форм, в побегах которых содержится антоциан, маскирующий побурение поврежденных тканей, возникают определенные сложности. Трудно определить, является ли буровато-красный цвет древесины побега следствием воздействия низких температур или же эта окраска характерна для него изначально. Указанная проблема особенно важна в селекции декоративных форм при оценке большого количества гибридов. Поэтому представляется актуальным поиск новых подходов по определению степени повреждения тканей побега морозом.

К настоящему времени большую популярность в физиологических исследованиях по оценке функционального состояния растений получил метод визуализации флуоресценции хлорофилла, зарекомендовавший себя как надежный инструмент выявления реакции растений на изменения окружающей среды (Oxborough, 2004; Woo et al., 2008; Gorbe, Calatayud, 2012; Murchie, Lawson, 2013; Chen et al., 2014; da Silva, 2016; Yao et al., 2018). Данный метод сыграл как важную роль в понимании фундаментальных механизмов фотосинтеза, так и в изучении прикладных его аспектов. Обычно в качестве объекта таких исследований используют листья. Однако в ряде работ отечественных исследователей (Волгушева и др., 2009; Орехов, Козлов, 2010; Орехов, Калабин, 2013) показана перспективность выявления экологической пластичности хвойных и лиственных пород по флуоресцентным характеристикам одревесневших тканей. Отмечено наличие взаимосвязи между функционированием фотосинтетического аппарата в покое и амплитудно-кинетической характеристикой индукции флуоресценции хлорофилла (Соловченко и др, 2022). В наших исследованиях, проведенных ранее, установлено достоверное снижение фотосинтетической активности в хлорофилл содержащих тканях побегов (максимальный квантовый выход на 14,9…64,4%; скорость электронного транспорта на 3,0…98,0%) у промороженных побегов яблони и груши (Юшков и др., 2012).

В этой связи целью наших исследований являлась оптимизация способа оценки повреждений после искусственного промораживания по уровню угнетения фотосинтетической активности тканей однолетних побегов.

 

Материалы и методика

Работа выполнена в 2021…2023 годах на базе Селекционно-генетического центра ФГБНУ ФНЦ им. И.В. Мичурина, расположенного в г. Мичуринске Тамбовской области. Исследования проводились на трех зеленолистных (Антоновка обыкновенная, Вымпел, Рашид) и трех краснолистных (Ola, Royalty, 54-118) формах яблони, существенно различающихся по зимостойкости. Изучение устойчивости указанных генотипов к морозу проводилось методом прямого лабораторного промораживания, предложенным М.М. Тюриной, Г.А. Гоголевой (1978), М.М. Тюриной с сотрудниками (2002).Температура промораживания – минус 40°С (второй компонент зимостойкости). Стандартную закалку побегов проводили в климатической камере MLR-350 Sanyo, потенциал зимостойкости определялся в климатической камере тепла и холода СМ-60/100-250ТХ. Уровень повреждений оценивали анатомическим методом по степени естественного побурения тканей с учетом площади повреждений и их интенсивности согласно общепринятой балльной шкале: 0 баллов – признаки повреждения отсутствуют, 5 баллов – ткань полностью погибла. Параллельно с глазомерной оценкой повреждений проводилась диагностика фотосинтетической активности срезов однолетних побегов до и после промораживания. Как и в варианте с глазомерной оценкой по методике М.М. Тюриной, Г.А. Гоголевой (1978) оценивали по пять побегов одного сорта, при этом на каждом побеге выполняли измерения оптических характеристик на трех срезах (верхняя, средняя и нижняя часть побега).

Флуоресцентные исследования осуществляли с помощью системы визуализации флуоресцентных изображений IMAGING-PAM-series и прикладной программы ImagingWin (HeinzWalzGmbH). Использовался метод импульсной амплитудно-модулированной флуориметрии, подробно описанный U. Schreiber (2004). Объекты подвергали воздействию серии насыщающих импульсов (12 импульсов по 60 мс, длительностью 720 мс, интенсивностью 2700 мкмоль/м²с, интервал между вспышками 20 с). Параметры измерительного света – 0,5 мкмоль/м²с, 450 нм, 1 Гц.

Оценку проводили по параметру «квантовый выход нефотохимического тушения флуоресценции», так как в исследованиях, проведенных нами ранее, была подтвержена информативность этого показателя при оценке засухоустойчивости (Юшков и др., 2023).

 

Результаты и их обсуждение

Методом искусственного промораживания была проведена оценка устойчивости исходных форм яблони по максимальной устойчивости в середине зимы. Кора и камбий в закаленном состоянии обладают высокой устойчивостью и не повреждались у всех изученных форм. Выявлены существенные различия по устойчивости древесины (таблица 1).

Таблица 1 – Степень повреждения тканей исходных форм яблони после искусственного промораживания при температуре минус 40ºС

Сорт, форма	Кора	Камбий	Древесина	Сердцевина	Почки	Средний балл повреждения
54-118	0	0	1,8	1,6	1,1	0,85
Антоновка обыкновенная	0	0	0,5	0,2	0,6	0,18
Вымпел	0	0	2,0	0,7	1,7	0,68
Ola (Ола)	0	0	1,7	1,2	1,1	0,73
Рашида	0	0	2,7	1,9	3,2	1,20
Royalty (Роялти)	0	0	1,8	1,6	1,9	0,85
НСР0,05	0	0	0,11	0,09	0,15	0,10

Примечание: статистическая обработка проводилась в соответствии с методикой М.М. Тюриной, Г.А. Гоголевой (1978)

 

Из данных, представленных в таблице 1 следует, что наибольшей устойчивостью древесины характеризовалась Антоновка обыкновенная – отмечены небольшие повреждения до 0,5 балла). Почки у этого сорта также повреждались незначительно (0,6 балла). Меньшей морозоустойчивостью тканей и почек характеризовались сорта и формы Вымпел, Ola, Royalty, 54-118 (подмерзание древесины 1,7…2,0 балла, почек – 1,7…2,0 балла). Максимальные повреждения отмечены у киргизского сорта Рашида (подмерзание древесины 2,7 балла, почек – 3,2 балла), что представляется вполне закономерным, учитывая его происхождение от незимостойких сортов (Апорт Александр × Jonathan).

Как уже отмечалось, наряду с визуальной оценкой повреждений по их площади и интенсивности побурения тканей проводилось изучение флуоресцентной активности срезов однолетних побегов в сравнении с контрольным вариантом (рисунок 1).

 

Рисунок 1 – Визуализация квантового выхода нефотохимического тушения флуоресценции яблони Royalty, (метод «световой кривой», после искусственного промораживания при температуре минус 40ºС, срезы однолетних побегов, часть выборки)

В результате проведенных исследований установлено, что повреждение тканей побега оказывает существенное влияние на параметры флуоресценции хлорофилла. Так, максимальное снижение квантового выхода, регулируемого нефотохимического тушения флуоресценции отмечено у наиболее чувствительного к морозу сорта из изученных (Рашида), минимальное – у самого зимостойкого (Антоновка обыкновенная) (рисунок 2).

 

Рисунок 2 – Снижение квантового выхода нефотохимического тушения флуоресценции у зимостойкого (а) и незимостойкого (б) сортов яблони после промораживания при температуре минус 40ºС (горизонтальная ось – количество насыщающих вспышек, вертикальная уровень квантового выхода нефотохимического тушения флуоресценции, усредненные данные)

 

На рисунке 2 представлены кривые, характеризующие динамику квантового выхода нефотохимического тушения флуоресценции фотосистемы II для контрольных и промороженных однолетних побегов. В варианте «а» отсутствие значимых различий между кривыми свидетельствует о минимальном влиянии мороза на фотосинтезирующие ткани, в варианте «б» наглядно видно снижение фотосинтетической активности после воздействия этого повреждающего фактора на побеги незимостойкого сорта.

Для количественной оценки степени снижения квантового выхода нефотохимического тушения флуоресценции поврежденных морозом побегов по сравнению с контролем был проведен кластерный анализ и попарно рассчитаны евклидовы расстояния между световыми кривыми (контрольными и опытными). Это позволило выявить степень угнетения фотосинтетической активности в хлорофиллсодержащих тканях побегов и отразить ее в условных единицах. Данные, полученные на основе сопоставления ковариационной матрицы с результатами промораживания, представлены в таблице 2.

 

Таблица 2 – Влияние степени повреждения морозом однолетних побегов яблони на квантовый выход нефотохимического тушения флуоресценции

Сорт, форма	Повреждение древесины	Средний балл повреждений по тканям	Евклидово расстояние
54-118	1,8	0,85	0,46
Антоновка обыкновенная	0,5	0,18	0,21
Вымпел	2,0	0,68	0,36
Ola	1,7	0,73	0,61
Рашида	2,7	1,20	2,12
Royalty	1,8	0,85	0,53

Примечание: Евклидово расстояние между «световыми кривыми» контрольного и опытного вариантов, сформированных на основе визуализации квантового выхода нефотохимического тушения флуоресценции

Из данных таблицы 2 видно, что более поврежденным морозом сортам соответствует и больший показатель расстояния, т.е. степень угнетения активности фотосинтетического аппарата. Для подтверждения взаимосвязи между степенью повреждения однолетних побегов и рассчитанным показателем евклидового расстояния были определены коэффициенты ранговой корреляции (таблица 3). Отмечены высокие и статистически достоверные (P<0,05) значения коэффициентов корреляции между квантовым выходом, уровнем повреждения древесины (0,95) и средним баллом повреждения тканей (0,82).

 

Таблица 3 – Матрица корреляций зависимости между степенью повреждения побегов яблони и квантовым выходом нефотохимического тушения (Y(NPQ)) после искусственного промораживания (II компонент зимостойкости, минус 40ºС)

	Повреждение древесины	Средний балл повреждений по тканям	Y(NPQ))
Повреждение древесины	1
Средний балл повреждений по тканям	0,87*	1
NPQ	0,95*	0,82*	1

Примечания: * – достоверно при уровне значимости 0,05 (критическое значение p_0,05 = 0,47)

 

Таким образом, проведенные исследования показали возможность успешной оценки повреждений побегов яблони морозом по изменению их флуоресцентных характеристик. При этом очевидна необходимость дальнейших исследований для более подробного изучения вопроса взаимосвязи между повреждением тех или иных тканей и показателями флуоресценции хлорофилла.

 

Выводы

В результате проведенных исследований установлено, что повреждение тканей побега оказывает существенное влияние на параметры флуоресценции хлорофилла. Выявлена степень повреждения ряда зеленолистных и краснолистных сортов и форм яблони в условиях искусственного промораживания по флуоресцентным изображениям срезов однолетних побегов, сформированных на основе визуализации квантового выхода нефотохимического тушения. Предложенный способ позволяет более объективно по сравнению с глазомерной оценкой определять уровень зимостойкости сортов и форм, что особенно актуально для краснолистных генотипов яблони.

 

Финансирование

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «FGSU-2022-0001 Провести скрининг генетических ресурсов культурных растений, диких видов и их производных с целью формирования исследовательско-селекционных коллекций садовых культур. Выявить вариабельность экономически важных и селекционно-значимых признаков, выделить перспективные для дальнейшего использования генотипы».

 

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в публикации, принадлежат исключительно авторам и соавторам. ФГБНУ ВНИИСПК и редакция журнала снимают с себя ответственность за любой ущерб людям и/или имуществу в результате использования любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте.

Об авторах

Андрей Николаевич Юшков

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр им. И.В. Мичурина»

Автор, ответственный за переписку.
Email: a89050489146@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2180-0045
SPIN-код: 2987-1191

доктор с.-х. наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией физиологии устойчивости и геномных технологий

Россия, 393770 Россия, г. Мичуринск, Тамбовская область, ул. Мичурина, 30.

Надежда Вячеславовна Борзых

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр им. И.В. Мичурина»

Email: n-bor@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4938-2743
SPIN-код: 1948-6372

кандидат с.-х. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии устойчивости и геномных технологий

Россия, 393770 Россия, г. Мичуринск, Тамбовская область, ул. Мичурина, 30.

Список литературы

Дополнительные файлы