Оптимизация условий для продукции шаперонов Hsp70 в клетках Saccharomyces cerevisiae

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Молекулярные шапероны регулируют правильную укладку белков в клетке. Члены семейства Hsp70, включая белок Ssa1, — это молекулярные шапероны, которые предотвращают агрегацию белков, способствуют их правильному сворачиванию и деградации, они являются наиболее распространенными среди различных шаперонов, высококонсервативными и присутствуют в различных организмах.

Цель — оптимизация методов продукции, выделения и очистки белка Ssa1 из клеток Saccharomyces cerevisiae.

Материалы и методы. Последовательности генов SSA1-4 были клонированы в вектор под контролем промоторагена TEF1 и слиты с последовательностью, кодирующей His6-тэг. Штаммы дрожжей с различным генетическим фоном трансформировали полученными конструкциями и оценивали продукцию белков Ssa1-4 при различных условиях культивирования. Для очистки белка Ssa1 использовали методы аффинной и ионообменной хроматографии. Для подтверждения локализации рекомбинантных белков Ssa, слитых с TagRFP-T, в цитоплазме применяли флуоресцентную микроскопию.

Результаты и заключение. Оптимизированы методы продукции, выделения и очистки белка Ssa1 из дрожжевых клеток. Этот же подход может быть в дальнейшем использован для очистки других белков семейства Hsp70 и адаптирован для получения различных белков из эукариотических клеток.

Об авторах

Андрей Георгиевич Матвеенко

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: a.matveenko@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9458-0194
SPIN-код: 9877-5352

кандидат биологических наук

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Алексеевич Цветков

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: st096303@student.spbu.ru
ORCID iD: 0009-0007-3673-7310
Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Михайловна Рогоза

Санкт-Петербургский государственный университет; Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Email: t.rogoza@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2981-0421
SPIN-код: 7582-1519

кандидат биологических наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Юрий Александрович Барбитов

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: barbitoff@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-3222-440X
SPIN-код: 1053-6164

кандидат биологических наук

Россия, Санкт-Петербург

Галина Анатольевна Журавлева

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: g.zhuravleva@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-3013-4662
SPIN-код: 3132-6884

доктор биологических наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Liu Q, Liang C, Zhou L. Structural and functional analysis of the Hsp70/Hsp40 chaperone system. Protein Sci. 2020;29(2):378–390.doi: 10.1002/PRO.3725
  2. Kampinga HH, Craig EA. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(8):579–592. doi: 10.1038/NRM2941
  3. Kominek J, Marszalek J, Neuvéglise C, et al. The complex evolutionary dynamics of Hsp70s: a genomic and functional perspective. Genome Biol Evol. 2013;5(12):2460–2477. doi: 10.1093/GBE/EVT192
  4. Boorstein WR, Ziegelhoffer T, Craig EA. Molecular evolution of the HSP70 multigene family. J Mol Evol. 1994;38(1):1–17. doi: 10.1007/BF00175490
  5. Lotz SK, Knighton LE, Nitika, et al. Not quite the SSAme: unique roles for the yeast cytosolic Hsp70s. Curr Genet. 2019;65(5):1127–1134.doi: 10.1007/S00294-019-00978-8
  6. Werner-Washburne M, Craig EA. Expression of members of the Saccharomyces cerevisiae hsp70 multigene family. Genome. 1989;31(2):684–689. doi: 10.1139/G89-125
  7. Stone DE, Craig EA. Self-regulation of 70-kilodalton heat shock proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1990;10(4):1622–1632. doi: 10.1128/MCB.10.4.1622-1632.1990
  8. Christiano R, Nagaraj N, Fröhlich F, Walther TC. Global proteome turnover analyses of the yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 2014;9(5):1959–1965. doi: 10.1016/J.CELREP.2014.10.065
  9. Zhouravleva GA, Bondarev SA, Trubitsina NP. How big is the yeast prion universe? Int J Mol Sci. 2023;24(14):11651. doi: 10.3390/IJMS241411651
  10. Barbitoff YA, Matveenko AG, Zhouravleva GA. Differential interactions of molecular chaperones and yeast prions. J Fungi. 2022;8(2):122.doi: 10.3390/JOF8020122
  11. Schwimmer C, Masison DC. Antagonistic interactions between yeast [PSI+] and [URE3] prions and curing of [URE3] by Hsp70 protein chaperone Ssa1p but not by Ssa2p. Mol Cell Biol. 2002;22(11):3590–3598.doi: 10.1128/MCB.22.11.3590-3598.2002
  12. Matveenko AG, Barbitoff YA, Jay-Garcia LM, et al. Differential effects of chaperones on yeast prions: CURrent view. Curr Genet. 2018;64(2):317–325. doi: 10.1007/S00294-017-0750-3
  13. Allen KD, Wegrzyn RD, Chernova TA, et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: Novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 2005;169(3):1227–1242.doi: 10.1534/genetics.104.037168
  14. Barbitoff YA, Matveenko AG, Moskalenko SE, et al. To CURe or not to CURe? Differential effects of the chaperone sorting factor Cur1 on yeast prions are mediated by the chaperone Sis1. Mol Microbiol. 2017;105(2):242–257.doi: 10.1111/MMI.13697
  15. Sharma D, Masison DC. Functionally redundant isoforms of a yeast Hsp70 chaperone subfamily have different antiprion effects. Genetics 2008;179(3):1301–1311. doi: 10.1534/GENETICS.108.089458
  16. Sharma D, Martineau CN, Le Dall MT, et al. Function of SSA subfamily of Hsp70 within and across species varies widely in complementing Saccharomyces cerevisiae cell growth and prion propagation. PLoS One.2009;4(8):e6644. doi: 10.1371/JOURNAL.PONE.0006644
  17. Bush GL, Meyer DI. The refolding activity of the yeast heat shock proteins Ssa1 and Ssa2 defines their role in protein translocation. J Cell Biol. 1996;135(5):1229–1237. doi: 10.1083/JCB.135.5.1229
  18. Deshaies RJ, Koch BD, Werner-Washburne M, et al. A subfamily of stress proteins facilitates translocation of secretory and mitochondrial precursor polypeptides. Nature. 1988;332(6167):800–805. doi: 10.1038/332800A0
  19. Gilbert CS, van den Bosch M, Green CM, et al. The budding yeast Rad9 checkpoint complex: chaperone proteins are required for its function.EMBO Rep. 2003;4(10):953–958. doi: 10.1038/SJ.EMBOR.EMBOR935
  20. McClellan AJ, Endres JB, Vogel JP, et al. Specific molecular chaperone interactions and an ATP-dependent conformational change are required during posttranslational protein translocation into the yeast ER. Mol Biol Cell. 1998;9(12):3533–3545. doi: 10.1091/MBC.9.12.3533
  21. Krzewska J, Melki R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Sup35p, an in vitro study. EMBO J. 2006;25(4):822–833.doi: 10.1038/SJ.EMBOJ.7600985
  22. Grant GN, Jessee J, Bloom FR, Hanahan D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. PNAS. 1990;87(12):4645–4649. doi: 10.1073/PNAS.87.12.4645
  23. Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor; 1994.
  24. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual. 2nd edit. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press;Cold Spring Harbor; 1989.
  25. Inge-Vechtomov SG. Identification of some linkage groups of Peterhof breeding stocks of yeast. Genetika. 1971;7(9):113–124. (In Russ.)
  26. Gietz RD. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. In: Xiao W, editor. Yeast Protocols. New York: Springer New York; 2014. P. 33–44. doi: 10.1007/978-1-4939-0799-1_4
  27. Chernoff YO, Lindquist SL, Ono BI, et al. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [PSI+]. Science. 1995;268(5212):880–884. doi: 10.1126/SCIENCE.7754373
  28. Newnam GP, Wegrzyn RD, Lindquist SL, Chernoff YO. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hsp104 and Hsp70 in prion curing. Mol Cell Biol. 1999;19(2):1325–1333. doi: 10.1128/MCB.19.2.1325
  29. Agaphonov M, Alexandrov A. Self-excising integrative yeast plasmid vectors containing an intronated recombinase gene. FEMS Yeast Res. 2014;14(7):1048–1054. doi: 10.1111/1567-1364.12197
  30. Matveenko AG, Ryzhkova VE, Zaytseva NA, et al. Processing of fluorescent proteins may prevent detection of prion particles in [PSI+] cells. Biology. 2022;11(12):1688. doi: 10.3390/BIOLOGY11121688
  31. Okamoto A, Hosoda N, Tanaka A, et al. Proteolysis suppresses spontaneous prion generation in yeast. J Biol Chem. 2017;292(49):20113–20124. doi: 10.1074/JBC.M117.811323.
  32. Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 1998;14(2):115–132. doi: 10.1002/(SICI)1097-0061(19980130)14:2
  33. Sikorski RS, Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 1989;122(1):19–27. doi: 10.1093/GENETICS/122.1.19
  34. James P, Pfund C, Craig EA. Functional specificity among Hsp70 molecular chaperones. Science. 1997;275(5298):387–389. doi: 10.1126/SCIENCE.275.5298.387
  35. Malcova I, Farkasovsky M, Senohrabkova L, et al. New integrative modules for multicolor-protein labeling and live-cell imaging in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 2016;16(3): fow027. doi: 10.1093/FEMSYR/FOW027
  36. Kushnirov VV. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 2000;16(9):857–860. doi: 10.1002/1097-0061(20000630)16:9<857::AID-YEA561>3.0.CO;2-B
  37. Zhang T, Lei J, Yang H, et al. An improved method for whole protein extraction from yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2011;28(11):795–798. doi: 10.1002/YEA.1905
  38. Kushnirov VV, Alexandrov IM, Mitkevich OV, et al. Purification and analysis of prion and amyloid aggregates. Methods. 2006;39(1):50–55. doi: 10.1016/J.YMETH.2006.04.007
  39. Drozdova PB, Barbitoff YA, Belousov MV, et al. Estimation of amyloid aggregate sizes with semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis and its limitations. Prion. 2020;14(1):118–128.doi: 10.1080/19336896.2020.1751574
  40. Hines JK, Higurashi T, Srinivasan M, Craig EA. Influence of prion variant and yeast strain variation on prion-molecular chaperone requirements. Prion. 2011;5(4):238–244. doi: 10.4161/PRI.17818

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Сравнение уровней продукции Ssa1 в различных штаммах дрожжей с помощью иммуноблоттинга. Для трансформации использовали плазмиды pTEF-SSA1 (a) или pTEF-SSA1-21 (b). Общий белок визуализировали с помощью окрашивания мембран Кумасси R250. log, культура дрожжей в логарифмической (OD₆₀₀ = 0,7–1,0), stat, в стационарной (OD₆₀₀ = 2) фазе роста. Использовали антитела против His6 и против Hsp70. Штаммы, выбранные для дальнейшего анализа, отмечены звездочками. Порядок штаммов на панели A следующий (слева направо): OT56, 74-D694, P2.1.1-yAO121, yAO121, 2-yAO121, prb1Δ0-P-74-D694,prb1Δ0-2-74-D694, yAO066, prb1Δ-BY4741, BY4742, yAO066 (стат), prb1Δ-BY4741(стат), BY4742(стат). Порядок штаммов на панели B следующий (слева направо): OT56, 74-D694, P2.1.1-yAO121, yAO121, 2-yAO121, prb1Δ0-P-74-D694, prb1Δ0-2-74-D694, prb1Δ-BY4741, BY4742, yAO066 (стат), prb1Δ-BY4741(стат), BY4742(стат).

Скачать (157KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Сравнение уровней продукции Ssa1 в выбранных штаммах при различных условиях: а) трансформанты yAO121 и prb1Δ-BY4741 из рис. 1 сначала выращивали при 30°C до середины логарифмической фазы (OD₆₀₀ = 0,4–0,6), а затем инкубировали при указанных температурах в течение 4 часов: б) штамм prb1Δ-BY4741 трансформировали плазмидами pTEF-SSA1, pTEF-SSA1-21 или pRS316 (e.v., пустой вектор); выбранные трансформанты выращивали в средах SC-Ura (SC) или Min-Ura (Min) при 30°C до поздней логарифмической фазы. В каждом случае показаны два независимых трансформанта. Показаны результаты анализа вестерн-блоттинга. Общий белок визуализировали с помощью окрашивания мембран Кумасси R250.

Скачать (179KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Выбор среды для продукции Ssa2, Ssa3 и Ssa 4. Штамм prb1Δ-BY4741 был трансформирован pTEF-His6-SSA2, pTEF-His6-SSA3 и pTEF-His6-SSA4; отобранные трансформанты выращивались в средах SC-Ura (SC) или Min-Ura (Min) при 30°C до достижения OD₆₀₀ = 0,8–1,1, а затем подвергались экстракции белка и вестерн-блоттингу.

Скачать (86KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ внутриклеточного распределения белков Ssa. Штаммы OT56 ([PSI⁺]) и 74-D694 ([psi⁻]) были трансформированы серией плазмид pTEF-His₆-yTagRFP-T-SSA. Полученные трансформанты были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. BF, светлое поле.

Скачать (144KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Очистка белка Ssa1 из лизатов дрожжевых клеток: a, SDS-PAGE фракций аффинной хроматографии дрожжевых лизатов, продуцирующих His₆-Ssa1 в неденатурирующих условиях. Показано окрашивание Кумасси R250 гелей, загруженных фракциями элюции. Фракции, взятые для последующего концентрирования и очистки ионообменной хроматографией, отмечены линией, фракции, отмеченные одной и двумя стрелками, использовались для иммуноблоттинга; b, Вестерн-блот репрезентативных фракций (отмечены одной и двумя стрелками на панели A) после аффинной очистки; c, анализ SDS-PAGE фракций ионообменной хроматографии, окрашенных Кумасси R250.

Скачать (179KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».