Immunohistochemical evaluation of apoptosis inducing factor in missed abortion after IVF

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Известно, что апоптоз играет важную роль в циклической трансформации эндометрия в течение менструального цикла и функциональной активности эндометрия, являясь строго контролируемым генетически детерминированным процессом, а нарушение баланса пролиферации — апоптоза — лежит в основе неопластической трансформации ткани.

Экспериментальные и клинические исследования расширили наше понимание о молекулярных механизмах апоптоза в эмбриональном процессе, установив, что апоптоз — важный компонент процесса имплантации и плацентации. Именно роль апоптоза становится решающей для имплантации бластоцисты в пределах эндометрия, поскольку трофобласт имеет крайне высокий инвазивный потенциал [8, 9, 11, 12, 14].

По литературным данным, диагностически значимым маркером для оценки апоптоза является апоптоз-индуцирующий фактор (apoptosis inducing factor, AIF). AIF — межмембранный митохондриальный белок, который участвует в метаболизме митохондрий и окислительно-восстановительном контроле. Экспрессия AIF была выявлена в ткани плаценты с высоким уровнем экспрессии в ворсинчатом трофобласте и с невысокой экспрессией AIF в ядрах клеток. Некоторые авторы предположили, что ядерная транслокация AIF может приводить к апоптотическим особенностям, связанным с дифференцировкой трофобластов, а также может быть обязательным условием для продолжения дифференцировки клеток [15]. Кроме дифференцировки трофобласта, апоптоз играет одну из ключевых ролей в патогенезе задержки внутриутробного развития плода [16].

Несмотря на закономерную роль апоптоза при неразвивающейся беременности, ряд вопросов остается открытым. При нормальном кариотипе ворсин хориона, отсутствии инфекционного или эндокринного фактора в этиологии неразвивающейся беременности активация патологического апоптоза первична? Или нарушение секреторной трансформации эндометрия на фоне дисбаланса рецепторного профиля эндометрия при эндометриальной дисфункции и хроническом воспалении служит инициатором патологической активации апоптоза? Известно, что патология эндометрия, а именно эндометриальная дисфункция, играет значимую роль в патологии имплантации и плацентации и, как следствие, приводит к гибели эмбриона [2, 3, 6].

Исследование AIF при неразвивающейся беременности, наступившей после ЭКО, позволит изучить его роль в генезе репродуктивных потерь I триместра, ставшими краеугольным камнем в современной медицине. Необходимо констатировать, что около 20 % репродуктивных потерь ранних сроков и 80 % этого количества приходится на неразвивающуюся беременность независимо от способов ее наступления и не имеет тенденции к снижению, что приобретает не только медицинское, но социальное значение [1, 4, 5, 17].

Цель исследования — изучение экспрессии AIF при неразвивающейся беременности после ЭКО в зависимости от вариантов гравидарной трансформации эндометрия.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование проведено на 77 образцах абортивного материала при неразвивающейся беременности 5–8 нед. эмбриогистологического срока после ЭКО и 15 образцах абортивного материала прогрессирующей беременности на аналогичных сроках. Группы абортивного материала после ЭКО были сформированы по разработанным Т.Г. Траль и соавт. [7] вариантам гравидарной трансформации эндометрия: I группа — полноценная гравидарная трансформация стромы и желез эндометрия (n = 20); II группа — полноценная гравидарная трансформация стромы с железами секреторного типа (n = 15); III группа — неполноценная гравидарная трансформация стромы с железами секреторного типа (n = 15); IV группа — неполноценная гравидарная трансформация стромы с железами пролиферативного типа (n = 15); V группа — неполноценная секреторная трансформация с железами секреторного и пролиферативного типа (n = 12). Контрольная группа — n = 15.

Гистологическое исследование

Операционный материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине (рН 7,2), после стандартной гистологической проводки в гистопроцессоре Leica TP1020 (Leica, Германия) заливали в парафин на приборе модульной системы заливки TES99 (Medite, Германия). Из полученных блоков изготавливали срезы толщиной 3–4 мкм на микротоме Rotary 3002 (PFM, Германия) и окрашивали их гематоксилином и эозином («БиоВитрум», Россия). Исследование проводили на микроскопе Olympus CX31 (Япония) при увеличении ×100, ×400.

Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах по стандартной методике с одноэтапным протоколом демаскировки антигена. В качестве системы визуализации использовали abcam Mouse and Rabbit Specific HRP Plus (ABC) Detection IHC Kit (Ready To Use) [ab93697] (Abcam, Великобритания). Иммуногистохимический метод исследования включал качественную и количественную оценку экспрессии AIF с использованием первичных моноклональных кроличьих антител к рецепторам Anti-AIF(Е 20)[клонab 32516–100] в стандартном разведении (1 : 200) производства Abcam (Великобритания). Визуализацию экспрессии данного маркера проводили на микроскопе Olympus BX46 и программном обеспечении CellSens 47 Entry. Экспрессию изучаемого маркера рассчитывали с помощью программы ВидеоТест-Морфология 5.2 (Россия).

Статистическое исследование

Статистический материал обрабатывали в программе SPSS v.23.0. Параметры распределения в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Данные представлены в виде среднего (95 % доверительный интервал) — М (95 % ДИ). Для определения статистически значимых различий между количественными параметрами нормально распределенных данных исследуемых групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с расчетом 95 % доверительного интервала. Различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия AIF верифицирована в железах и стромальном компоненте гравидарного эндометрия. В железах гравидарного эндометрия контрольной группы выявлено достоверное снижение экспрессии по сравнению с основными группами, независимо от вариантов гравидарной трансформации эндометрия (табл. 1).

 

Таблица 1. Экспрессия апоптоз-индуцирующего фактора в железах гравидарного эндометрия / Table 1. AIF expression in glands of decidualized endometrium

Группа / Group	Среднее значение / Average meaning	95 % доверительный интервал для среднего значения / 95 % confidence interval formean		F-statistic	p-value
		нижняя граница / lowerbound	верхняя граница / upperbound
Контрольная группа / Control group (n = 15)	4,08	3,42	4,75	26,72	pк–1 < 0,001 pк–2 < 0,001 pк–3 < 0,0001 pк–4 < 0,001 pк–5 < 0,0001 p1–2 < 0,001 p1–3 = 1,000 p1–4 < 0,001 p1–5 < 0,001 p2–3 < 0,001 p2–4 = 1,000 p2–5 = 1,000 p3–4 = 0,013 p3–5 = 0,417 p4–5 = 1,000
I группа / Group I (n = 20)	9,76	8,75	10,77
II группа / Group II (n = 15)	15,02	13,15	16,88
III группа / Group III (n = 15)	10,88	9,36	12,40
IV группа / Group IV (n = 15)	16,99	14,13	19,80
V группа / Group V (n = 12)	16,25	14,69	17,81

 

Следует отметить, что в I группе при полноценной гравидарной трансформации желез и стромы эндометрия после ЭКО верифицировано достоверное снижение экспрессии по сравнению со II группой при полноценной гравидарной трансформации стромы с железами секреторного типа (p < 0,001), с IV группой при неполноценной гравидарной трансформации стромы с железами пролиферативного типа (p < 0,001) и с V группой при неполноценной гравидарной трансформации стромы с железами секреторного и пролиферативного типа (p < 0,001). При оценке экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора в строме компактного слоя эндометрия также выявлена достоверно низкая экспрессия в контрольной группе по сравнению со всеми основными группами (табл. 2). Результат согласуется с работой других авторов, где была показана достоверно высокая экспрессия апоптоза в железах эндометрия и незначительная экспрессия в стромальных клетках при нарушении его секреторной трансформации, а также снижении пролиферативной активности эндометрия [13].

 

Таблица 2. Экспрессия апоптоз-индуцирующего фактора в строме гравидарного эндометрия / Table 2. AIF expression in stroma of decidualized endometrium

Группа / Group	Среднее значение / Average meaning	95 % доверительный интервал для среднего значения / 95 % confidence interval formean		F-statistic	p-value
		нижняя граница / lowerbound	верхняя граница / upperbound
Контрольная группа / Control group (n = 15)	5,01	4,32	5,70	32,96	pк–1 < 0,0001 pк–2 = 0,170 pк–3 = 0,003 pк–4 < 0,0001 pк–5 < 0,0001 p1–2 < 0,0001 p1–3 = 0,092 p1–4 = 1,000 p1–5 < 0,001 p2–3 < 1,000 p2–4 = 0,035 p2–5 < 0,0001 p3–4 < 0,035 p3–5 < 0,001 p4–5 = 0,044
I группа / Group I (n = 20)	15,63	14,19	17,08
II группа / Group II (n = 15)	8,97	7,62	10,33
III группа / Group III (n = 15)	11,25	9,33	13,15
IV группа / Group IV (n = 15)	16,56	14,70	18,42
V группа / Group V (n = 12)	21,53	19,32	23,73

 

Исследования маркера в строме гравидарного эндометрия показали, что в I группе при полноценной гравидарной трансформации эндометрия верифицирована достоверно низкая экспрессия по сравнению со II группой при полноценной гравидарной трансформации стромы с железами секреторного типа (p < 0,001). При сравнении с III группой при неполноценной гравидарной трансформации стромы с железами секреторного типа и IV группой при неполноценной гравидарной трансформации стромы с железами пролиферативного типа статистически значимых различий не выявлено. Следует отметить, что максимальная экспрессия данного маркера верифицирована в V группе при неполноценной гравидарной трансформации с железами секреторного и пролиферативного типа и была достоверно выше по сравнению с I группой (p < 0,001), II группой (p < 0,0001) и III группой (p < 0,001). По данным исследователей, у пациенток с привычным выкидышем экспрессия AIF в децидуальных клетках была значительно выше, по сравнению с другими группами, а в эндометрии экспрессия AIF была выше в секреторной фазе цикла по сравнению с пролиферативной [18].

Известно, что инициация апоптоза и нарушение секреторной трансформации эндометрия происходит в результате гипоксии, вследствие хронического воспалительного процесса в эндометрии [10]. Полученные результаты свидетельствуют, что у пациенток с неразвивающейся беременностью после методов ЭКО на фоне эндометриальной дисфункции вследствие хронического эндометрита формируется нарушение секреторной трансформации, децидуализации и неполноценной плацентации, которые, вероятно, служат причиной активации апоптоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, комплексное морфологическое исследование экспрессии AIF в абортивном материале при разных вариантах гравидарной трансформации эндометрия (полноценной и неполноценной) выявило достоверно высокую экспрессию по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об активации данного процесса у пациенток с исходной патологией эндометрия.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

About the authors

Tatiana G. Tral

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology; St. Petersburg State Pediatric Medical University

Author for correspondence.
Email: ttg.tral@yandex.ru

MD, PhD, Senior researcher, Pathomorphology Department

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Gulruchsor Kh. Tolibova

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology; North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: gulyatolibova@yandex.ru

MD, PhD, Dr. Med. Sci., Leading Scientist, Head of the Pathomorphology Department

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Igor Yu. Kogan

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology

Email: ikogan@mail.ru

MD, PhD, Dr. Med. Sci., Director

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files