Verification etiology of chronic infectious-inflammatory pulmonary diseases exacerbations in children

全文:

Введение До 40-50-х годов XX века ведущим этиологическим фактором обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) считался пневмококк. В 1960-е годы появляются исследования, в которых ведущую роль в возникновении и поддержании воспалительного процесса в бронхах отводят микрофлоре, в норме, обитающей в верхних дыхательных путях, особенно стафилококкам. В 1980-1990-е годы на основании клинико-микробиологических и клинико-иммунологических данных, а также экспериментальных исследований наряду с пневмококком была показана этиологическая роль Haemophilus influenzae в развитии обострения ХИВЗЛ [4]. Воспалительный процесс при обострении ХИВЗЛ у детей реализуется и поддерживается, как доказано исследователями, бактериальной флорой, среди которой, в первую очередь, этиологическую роль играют следующие микроорганизмы: H. influenzae и Streptococcus pneumoniae, а также недооцененный ранее - Moraxella catarrhalis [2, 3, 9, 12, 15, 17, 21]. В последние десятилетия в этиологической структуре обострений ХИВЗЛ отмечено увеличение удельного веса заболеваний, вызванных грамотрицательными неферментирующими бактериями, энтеробактериями и неспорообразующими анаэробами [1, 14, 16]. Кроме того, у пациентов с хроническими бронхолегочными заболеваниями обнаружена связь в ассоциативном взаимодействии микробной флоры между бактериальными и вирусными, бактериальными и грибковыми патогенами [5, 19, 20]. Микроорганизмы-ассоцианты взаимно влияют на основные биологические свойства друг друга. Например, стафилококки активируют факторы патогенности дрожжеподобных грибов и этим повышают их устойчивость к антимикотическим препаратам. Грибы рода Candida усиливают размножение Pseudomonas aeruginosa [5, 13, 18]. Из-за трудностей, связанных с выделением, в частности, труднокультивируемых, анаэробных бактерий, вирусов и необходимым для этого временем, антимикробная терапия проводится без своевременно начатого процесса этиологического подтверждения, что приводит к последующим новым обострениям хронического инфекционно-воспалительного процесса, и, в конечном итоге, существенно ухудшает качество жизни растущего организма. В этих условиях роль ранней этиологической диагностики обострений ХИВЗЛ чрезвычайно высока. Цель исследования - определить роль основных инфекционных агентов и условно-патогенных бактерий, а также состав микробных ассоциаций, участвующих в этиологии обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей с помощью различных лабораторных методов. Материалы и методы Для решения поставленной цели 45 детей в возрасте от года до 17 лет, проходившее лечение в ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» г. Екатеринбурга, с обострением бронхоэктатической болезни и хронического бронхита обследованы комплексом методов: культуральным, полимеразной цепной реакцией (ПЦР), непрямой иммунофлюоресценции, газожидкостной хроматографии (ГЖХ), иммуноферментным анализом. В контрольную группу были включены дети без инфекционной бронхолегочной патологии (воронкообразная деформация грудной клетки, инородное тело дыхательных путей, атрезия пищевода, рубцовый стеноз пищевода, стеноз трахеи, у которых не выявлены признаки воспаления клинико-лабораторными методами; n = 45). Материалом для культурального исследования у детей с обострением ХИВЗЛ служили образцы бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ, n = 25), полученного при бронхоскопии с помощью жесткого бронхоскопа типа «Storz» (Германия), мокроты (n = 10), плеврального выпота (острая гнойно-деструктивная пневмония с экссудативным плевритом, возникшая на фоне обострения хронического бронхита, n = 10). У детей без инфекционной бронхолегочной патологии - БАЛ (n = 10) и отделяемое со слизистой зева (n = 35). Сбор и доставку клинических материалов проводили согласно МУ 4.2.2039-05 [10]. Методика посева и набор питательных сред определялись видом исследуемого клинического материала. Диагностический титр для мокроты ≥ 106 КОЕ/мл, БАЛ ≥ 104 КОЕ/мл. Каждая партия питательных сред подлежала внутреннему контролю согласно нормативным документам [6, 8]. У выделенных микроорганизмов проводили видовую идентификацию классическими бактериологическими методами и с использованием тест-систем для полуавтоматического (ATB Expression, bioMerieux, Франция) и автоматического (MicroScan WalkAway 96, Siemens, Германия) анализаторов. IgM и IgG определяли методом непрямой иммунофлюоресценции к основным вирусным и труднокультивируемым бактериальным агентам инфекционных заболеваний респираторного тракта - пневмотропам: Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3; Influenza A, B; Respiratory Syncytial Virus; Adenovirus; Chlamidophyla pneumoniae; Mycoplasma pneumoniae; Coxiella burnetii; Legionella pneumophila, серогруппа 1 (Vircell microbiologists, pneumoslide, Испания) в сыворотке крови 45 детей с обострением ХИВЗЛ. Исследование проводилось согласно инструкции производителя, с обязательной постановкой отрицательной и положительной контрольной сыворотки, входящих в состав наборов pneumoslide IgM и IgG. Методом иммуноферментного анализа в парных сыворотках крови 45 детей с обострением ХИВЗЛ и 45 детей без инфекционной бронхолегочной патологии определяли уровень IgG к полирибозилрибитолфосфату H. influenzae типа b и к бактериальным антигенам, полученным из клеток микроорганизмов: бескапсульного штамма H. influenzae; S. pneumoniae; Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; P. aeruginosa. Использовали скрининговые иммуноферментные тест-системы для определения IgG к условно-патогенным бактериям и «ИФА-IgG-АТ HIB» (ООО «Навина», Россия) [11]. Первая проба крови забиралась в начале обострения (3-4-й день госпитализации), а вторая в конце второй недели c соблюдением всех правил асептики и антисептики. Материалы для исследования взяты у детей, не вакцинированных против H. influenzae типа b и S. pneumoniae. Методом ПЦР исследована мокрота (n = 10), плевральный выпот (n = 10), БАЛ (n = 25) у детей с обострением ХИВЗЛ и БАЛ (n = 10) у детей без инфекционной бронхолегочной патологии. Для выявления ДНК H. influenzae и S. pneumoniae применяли набор реагентов для выделения ДНК микроорганизмов следующих родов Neisseria, Haemophilus, Streptococcus в клиническом материале методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле «АмлиСенс Neisseria spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp. - EPh», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва. Методом ГЖХ исследована мокрота (n = 10), плевральный выпот (n = 10), БАЛ (n = 25) у детей с обострением ХИВЗЛ и БАЛ (n = 10) у детей без инфекционной бронхолегочной патологии. Газожидкостный хроматографический анализ проводили по методике предложенной М. Д. Ардатской с соавт. [7]. Способ определения короткоцепочечных жирных кислот (КЖК, С2-С6 с изомерами) в биосубстратах складывался из двух этапов: процесса пробоподготовки и непосредственно анализа на газовом хроматографе модели 6890 фирмы Hewlett Packard (США). В пробах, определяли следующие продукты микробного метаболизма (маркеры): С2 - уксусная кислота; С3 - пропионовая кислота; iС4 - изомасляная кислота; С4 - масляная кислота; iС5 - изовалериановая кислота; C5 - валериановая кислота; iC6 - изокапроновая кислота; C6 - капроновая кислота. Исследование одобрено локальным комитетом по этическим вопросам при ГБУЗ СО «ОДКБ № 1» протокол № 24 от 30.10.2012 года. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA ® (Data analysis software system, StatSoft) версия 6.0. Результаты исследования и их обсуждение Результаты комплексного использования методов диагностики для установления этиологии обострений ХИВЗЛ у детей показаны на рисунке 1 и 2. Как видно из рисунка 2, обострения ХИВЗЛ у детей связаны как с монокультурами: аэробных, в том числе факультативно-анаэробных, бактерий (H. influenzae - 15,6 %; S. pneumoniae - 6,7 %; M. catarrhalis - 6,7 %; S. aureus - 2,2 %; C. pneumoniae - 4,4 %; M. pneumoniae - 2,2 %; L. pneumophila, серогруппа 1-2,2 %), неспорообразующих анаэробных бактерий (Bacteroides spp. - 6,7 %; Fusobacterium nucleatum - 6,7 %; Peptostreptococcus spp. - 4,4 %) и вирусами (Parainfluenza серотипы 1, 2, 3-2,2 %; Influenza А - 2,2 %), так и с ассоциациями микроорганизмов: бактериально-бактериальными (S. pneumoniae ± H. influenzae - 2,2 %; M. pneumoniae ± H. influenzae - 2,2 %; Propionibacterium spp. ± P. aeruginosa ± E. coli - 4,4 %; Bacteroides spp. ± S. pneumoniae - 4,4 %; Peptostreptococcus spp. ± Bacteroides ureolyticus ± S. aureus - 2,2 %), бактериально-вирусными (Stenotrophomonas maltophilia ± Influenza A - 4,4 %; Enterobacter cloacae ± Influenza B - 2,2 %; Eubacterium spp. ± Respiratory Syncytial Virus - 2,2 %), бактериально-грибковыми (E. coli ± Candida glabrata ± Candida krusei ± Candida tropicalis - 2,2 %). Таким образом, ХИВЗЛ у детей характеризуются полиэтиологичностью обострений. Обнаружение микробных ассоциаций при обострениях ХИВЗЛ приводит к необходимости оценки результатов их чувствительности только в совокупности. Так как, например, наличие в ассоциации одного из микроорганизмов, обладающего каким-либо механизмом резистентности к β-лактамам, которые наиболее часто используются как стартовые антибиотики, может привести к неудачам в терапии данным классом антимикробных препаратов. Интерес представляла также оценка диагностической значимости примененных лабораторных методов в определении этиологической роли разных микроорганизмов при обострениях ХИВЗЛ у детей (рис. 3). Установлено, что при использовании только культурального исследования возбудитель обнаружен у 51,1 % пациентов. При этом лидируют следующие монокультуры микроорганизмов: на первом месте H. influenzae - 15,6 %, на втором S. pneumoniae - 6,7 %, на третьем M. catarrhalis - 6,7 %. В свою очередь, применение только метода непрямой иммунофлюоресценции (IgМ) позволило выявить патоген у 24,4 % детей: C. pneumoniae (4,4 %), M. pneumoniae (4,4 %), Respiratory Syncytial Virus (2,2 %), Influenza A (6,7 %), Influenza В (2,2 %), Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3 (2,2 %), L. pneumophila, серогруппа 1 (2,2 %). Во всех случаях IgМ выявлены только к одному из перечисленных выше возбудителей. В свою очередь IgG обнаруживались с большей частотой и к следующим микроорганизмам: M. pneumoniae (8,8 %), C. pneumoniae (8,8 %), Adenovirus (40 %), Respiratory Syncytial Virus (57,8 %), Influenza A (26,7 %), Influenza В (31,1 %), Parainfluenza, серотипы 1, 2, 3 (28,9 %). Как правило, у пациентов одновременно встречались IgG к двум и более возбудителям - 53,3 % случаев. В связи с тем, что у детей и без инфекционной бронхолегочной патологии возможно выделение пневмококка и гемофильной палочки из отделяемого со слизистой зева и даже из БАЛ в недиагностическом титре, возникает вопрос о значимости этих возбудителей при конкретном обострении. Несмотря на трудности в выявлении специфического иммунного ответа удалось выяснить, что у детей с обострением ХИВЗЛ наблюдалась сероконверсия IgG к: H. influenzae типа b в 15,6 % случаев, бескапсульному штамму H. influenzae - 6,7 %, S. pneumoniae - 11,1 %, E. coli - 2,2 %, P. aeruginosa - 2,2 %, S. aureus - 4,4 %. При этом одновременное обнаружение сероконверсии IgG сразу к двум микроорганизмам, в том числе к H. influenzae типа b и бескапсульному штамму H. influenzae, выявлено у троих детей, таким образом, применение иммуноферментного анализа позволило достоверно подтвердить этиологическую роль возбудителя у 35,6 % детей с обострением ХИВЗЛ. Одновременно ДНК H. influenzae и S. pneumoniae в БАЛ обнаружено у одного ребенка; всего методом ПЦР в материале из нижних дыхательных путей ДНК гемофильной палочки и пневмококка выявлены у 28,9 % детей с обострением ХИВЗЛ. В БАЛ у детей без инфекционной бронхолегочной патологии ДНК H. influenzae и S. pneumoniae не обнаружена. Основными маркерами (метод ГЖХ), выделяемыми аэробными, в том числе и факультативно-анаэробными микроорганизмами, являются уксусная (С2), а анаэробными - пропионовая (С3) и масляная (С4) кислоты. Анаэробный индекс - это отношение суммы концентраций пропионовой и масляной кислот к уксусной кислоте. Результаты собственных исследований, подтвержденные посевами образцов на питательные среды, приведенные в таблице 1 и 2, и анализ данных литературы [1, 7] позволили установить, что увеличение уксусной кислоты и изокислот свидетельствуют о наличии в клиническом материале аэробных микроорганизмов. И наоборот преимущественное повышение пропионовой и/или масляной кислот, а следовательно, и смещение анаэробного индекса в более отрицательные значения указывают на анаэробные микроорганизмы. При этом, например, преобладание в образцах пропионовой кислоты говорит в пользу присутствия в клиническом материале бактерий рода Bacteroides. В то время как превалирование масляной кислоты о более вероятном содержании бактерий рода Fusobacterium. Совместное повышение уксусной, пропионовой, масляной кислот и изомеров КЖК указывает на ассоциацию микроорганизмов (аэробных и анаэробных) в клиническом материале. Маркеры микроорганизмов обнаружены хроматографически у 84,5 % детей, таким образом, наибольшую эффективность имеет ГЖХ. С одной стороны, хроматографический метод позволяет выявить обострения ХИВЗЛ, в которых принимают участие анаэробы - в 31 % случаев, тогда как культуральный - только в 13,3 % (p = 0,03). Но, с другой стороны, достоверных различий в обнаружении аэробных бактерий данными методами нет (p > 0,05). Таким образом, использование ГЖХ не отменяет культуральное исследование, но может применяться в совокупности с ним для ускоренного (в течение одного часа от момента доставки клинического материала в лабораторию) выявления маркеров бактериальных возбудителей обострений ХИВЗЛ, в первую очередь анаэробных микроорганизмов, значительно сокращая время, необходимое для их выделения. Выводы Использование описанных методов как общепринятых, так и инновационных технологий в обследовании детей позволяло верифицировать этиологию инфекции в 88,6 % случаев обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких, из них ассоциации микроорганизмов - 26,4 %, а в монокультуре - 62,2 %. При этом лидируют следующие монокультуры микроорганизмов: на первом месте H. influenzae - 15,6 % , на втором S. pneumoniae - 6,7 %, на третьем M. catarrhalis - 6,7 %. Кроме того, следует отметить, что помимо основных пневмотропных микроорганизмов, неспорообразующие анаэробы вызывают обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких в 31 % случаев, среди которых превалируют как в монокультуре, так и в составе ассоциаций Bacteroides spp.

作者简介

Lyubov Boronina

Ural State Medical University

Email: boroninalg@odkb.ru
MD, PhD, Dr. Med. Sci., Professor of the Clinical Laboratory and Bacteriology Diagnosis Department, Faculty of Postgraduate Education

Elena Samatova

Ural State Medical University

Email: lavrinenko@eka-net.ru
Post-graduate Student of the Clinical Laboratory and Bacteriology Diagnosis Department, Faculty of Postgraduate Education

参考

补充文件