Effectiveness of rodenticides based on bromadiolone against the common vole Microtus arvalis Pall. in laboratory conditions

Full Text

Введение

В зависимости от численности и распространения мышевидных грызунов в России от этих вредителей обрабатывают от 1.5 до 4.5 млн га сельскохозяйственных угодий в год − наибольший объем обработок (в основном родентицидами антикоагулянтного действия) приходится на Южный федеральный округ. Если в начале 2000-х гг. в основном применяли антикоагулянты первого поколения (1.3-индандионы на основе д.в. этилфенацина и изопропилфенацина), то в 2010-х гг. стали больше вносить приманок с антикоагулянтами 2-го поколения (д.в. – бродифакум и бромадиолон). С 2021 г. в список пестицидов, разрешенных для применения на территории РФ, входят антикоагулянтные препараты лишь на основе 4-оксикумаринов 2-го поколения с д.в. бродифакум и бромадиолон. Повышение устойчивости мышевидных грызунов к антикоагулянтам 1-го поколения отмечали уже с 2004 г., когда на некоторых полях проводили до 5-ти повторных обработок [1]. В полевых опытах эффективность обработки родентицидами на основе бромадиолона составляла против обыкновенной полевки 80, против общественной – ≈60% [2]. В 2006 г. при плотности популяций грызунов >1000 жилых нор/га эффективность обработки родентицидами на основе бромадиолона против сообщества мышевидных грызунов (доля обыкновенной полевки составляла ≈60%) составила лишь 40%. При плотности поселений до 64 жилых нор/га и доле обыкновенной полевки в сообществе грызунов 90–100% эффективность приманок с бромадиолоном на опытных площадках менялась от 70 до 84% [3]. Обыкновенные полевки, доставленные в лабораторию ВИЗР из мест интенсивных обработок, показывали бóльшую устойчивость к этилфенацину по сравнению с линиями полевки, не сталкивавшимися с антикоагулянтами [4]. В дальнейшем был показан рост устойчивости линий обыкновенной полевки и к бромадиолону [5].

Все антикоагулянтные родентициды имеют сходный механизм действия, впервые установленный при изучении варфарина – антикоагулянта 1-го поколения из класса 4-оксикумаринов. Было показано, что резистентность к варфарину у крыс определяется в основном наследуемыми мутациями гена VKORC1, отвечающего за встраивание молекулы антикоагулянта в комплекс К-эпоксидредуктазы, обеспечивающего в ходе цикла витамина К выработку факторов свертываемости крови [6]. Из-за способности снижать свертываемость крови варфарин применяют в медицине для лечения и профилактики тромбоэмболий. Медицинские исследования показали, что у пациентов, кроме особенности генотипа VKORC1, имеют значение разные аллели гена CYP2C9 ферментов цитохрома Р450, которые определяют разный уровень метаболизма варфарина в печени, с чем связана индивидуальная чувствительность к антикоагулянтам [7]. У полевок ведущим предполагается механизм резистентности, связанный именно с системой цитохрома P450, определяющий повышение метаболизма и выведения токсиканта. В частности, значение цитохромов было выявлено у рыжей полевки [8]. Повышение метаболизма, связанного с системой цитохрома P450, показали исследования приобретенной устойчивости к обработкам против серых полевок родентицидом на основе дифацинона (из группы 1,3-индандионов) [9]. В устойчивых к бромадиолону линиях серой крысы была показана бóльшая экспрессия генов цитохрома Р450 по сравнению с чувствительными выборками, что дало основание предполагать комбинированное влияние мутаций VKORC1 и уровня метаболизма антикоагулянтов на резистентность к бромадиолону, хотя ранее на варфарин-резистентных линиях значение цитохромов не подтверждали [10]. Пищеварительная и ферментативная системы полевок рассчитаны на зеленоядный тип питания, обеспечивающий высокое содержание в организме витамина К1. У водяной полевки Arvicola terrestris было выявлено сезонное повышение устойчивости к антикоагулянтам в связи с изменением количества витамина К в организме [11].

В литературе имеются сведения о действии бромадиолона на ряд видов грызунов. Для чувствительных линий грызунов эффективная доза бромадиолона (снижающая показатель свертываемости крови с 1 до 5 МНО (международное нормализованное отношение − стандартизированный показатель свертываемости крови, рассчитываемый на основании протромбинового времени)) составляет для самцов и самок (♂♂/♀♀) серой крысы 0.47/0.62, для домовой мыши – 1.96/1.68 мг/кг [12]. В лабораторных испытаниях в Финляндии при подаче приманки с бромадиолоном 8 из 10 особей водяной полевки Arvicola terrestris погибли от дозы 0.9 ± 0.5 мг/кг, 6 из 10 – от дозы 0.4 ± 0.2 мг/кг. Более устойчивой была пашенная полевка Microtus agrestis: в опытах с выбором и без выбора (сhoice – no сhoice) с однократной и двухкратной подачей приманки пережитые дозы по бромадиолону варьировали от 2.7 ± 0.6 до 12.4 ± 1.5 мг/кг [13]. Для водяной полевки Arvicola terrestris shermani с горных лугов Швейцарии при определении ЛД₅₀ в соответствие методикой EPPO [14] как при введении препарата перорально, так и при поступлении с приманкой, этот показатель составил 3 мг/кг [15]. По совокупности свойств более высокой токсичности в сравнении с антикоагулянтами 1-го поколения и относительно высокими дозами ЛД₅₀ для нецелевых видов бромадиолон стал основным препаратом для полевых обработок в Европе: считали, что подлежащие контролю грызуны не набирают доз, которые составят опасность вторичных отравлений. В опытах с серой крысой после потребления в течение 1-х сут приманки 0.05 г бромадиолона/кг, концентрация д.в. в организме грызуна составляла 2.08 мг/кг, а через 3 сут – 0.6 мг/кг [16]. Тем не менее, были опубликованы свидетельства гибели лис и канюков после обработок против водяной полевки [17]. Массовая гибель нецелевых видов после авиационной обработки пастбищ приманками с бромадиолоном против полевки Microtus brandti произошла в 2001–2003 гг. в Монголии [18]. Важна высокая кумулятивность действия бромадиолона. Хотя для собак и койотов острая ЛД₅₀ бромадиолона равна 10 мг/кг, хроническая ЛД₅₀ после 5 сут воздействия существенно меньше – 0.5 мг/кг/сут, самая низкая смертельная доза для собак составляет 0.15 мг/кг/сут в течение 5 сут [19]. Набору летальной дозы хищником может способствовать повышенная резистентность целевых видов. Для серой крысы и домовой мыши было установлено, что в линиях определенных мутаций гена VKORC1 чувствительность к бромадиолону снижается в десятки раз. Коэффициенты резистентности (RF) показывают во сколько раз у резистентных линий отличается эффективная доза к антикоагулянтам 2-го поколения по отношению к чувствительным линиям (табл. 1) [20].

Таблица 1. Коэффициенты резистентности (RF) к бромадиолону для распространенных мутаций серой крысы и домовой мыши (RRAC guidelines on Anticoagulant Rodenticide Resistance Management)

В лабораторных опытах с домовой мышью Mus musculus носители мутации Y139C перенесли опыт без выбора (no choice) с предложением в течение 21 сут приманки (0.05 г бромадиолона/кг). Диапазон перенесенных доз бромадиолона составил для самок домовой мыши 218−299 мг/кг, для самцов – 177−244 мг/кг. Из 19 особей, прошедших исследование ДНК, все мыши были носителями мутации Y139C, у 8-ми особей она сочеталась с мутацией L128S. Против носителей этих мутаций был эффективен бродифакум [21].

Для водяной полевки было подтверждено изменение в активности гена VKORC1 в популяциях из провинций Франции, где эффективность обработок была снижена после 20 лет интенсивного применения бромадиолона [22].

Многократное поступление бромадиолона в организм хищника обеспечивает кумулятивное действие антикоагулянта. Кроме этого, важно, какой изомер бромадиолона сохраняется в тушке грызуна. Промышленный концентрат бромадиолона представляет из себя смесь цис- и транс-изомеров, причем доля последнего составляет до 70%. Было показано сохранение в течение 10–30 сут в печени водяной полевки остатков транс-изомера бромадиолона, в то время как цис-изомер быстро выводился из организма. Вторичные отравления хищников были связаны именно с остатками транс- изомера бромадиолона [23].

Планируя расширение ассортимента средств защиты растений от грызунов за счет родентицидов на основе бромадиолона, цель работы –объективная оценка эффективности этого действующего вещества в первую очередь против наиболее массового вредителя растений – обыкновенной полевки Microtus arvalis Pall., а также возможность и условия отбора устойчивых к бромадиолону популяций грызунов.

Методика исследования

Обыкновенных полевок Microtus arvalis вывозили из Краснодарского края. Отловы основателей линий, потомство которых тестировали для определения ЛД₅₀ по бромадиолону проведены на подъеме численности грызунов до проведения обработок. Основатели линий, потомство которых отбирали по устойчивости к антикоагулянтам и использовали в тестировании приманок, отловлены в остаточных поселениях полевок, переживших родентицидные обработки в поле. В разведении полевок использовали террариумы из стекла 50×30×25 см³ с металлическими перфорированными крышками. Использовали подстилку из мелких березовых опилок, гнездовой материал − сено, режим освещения – естественный, температура – 10–20°C, относительная влажность – ≈70%. Стандартная диета при размножении животных состояла из травы, сена, свежих овощей, овса или замоченной пшеницы. В возрасте 14–20 сут детеныши получали индивидуальную метку и их рассаживали по 5♂♂ и 5♀♀ особей в террариуме. В течение 2–3 нед животные адаптировались к своим группам и их затем отбирали в лабораторные опыты, которые проводили на базе вивария ВИЗР (Санкт-Петербург–Пушкин).

Схемы опытов. Поступление бромадиолона в организм полевок обеспечивали пероральным введением концентрата в определенных дозах и кормовыми опытами с выбором (сhoice) в 2-х вариантах: а – групповое тестирование с альтернативным влажным кормом, б – индивидуальное тестирование с альтернативным влажным кормом. Подачу приманок в зависимости от целей опытов проводили с экспозицией в 1, 2 и 3 сут. Опыты с группами полевок по 5♂♂ и 5♀♀ на террариум проводили в больших террариумах объемом 50×30×25 см³. Опыты с индивидуальной рассадкой проводили в металлических перфорированных террариумах 34×22×14 см³. Приманку предлагали в присутствии сочных кормов. На время экспозиции родентицида зерновой корм убирали [24]. Проведены серии опытов в присутствии и в отсутствии источника витамина К (зеленых кормов).

Расчет полученной дозы. При введении per os каждого зверька взвешивали и в зависимости от массы рассчитывали индивидуальный объем препарата для введения по формуле

$X\left(мл\right)=\frac{m\left(г\right)*D(мг/кг)}{a(г/л)*1000}$, где

$X(мл$) – объем введенного препарата, $m(г$) – масса полевки в г, $D(мг/кг$) – доза по д.в., которую получит тестируемая особь, $a(г/л)$ – содержание д.в. в препарате.

Расчет дозы, полученной грызунами при поедании родентицидной приманки, проводили по формуле:

D (мг/кг) = (Z (г) × а × 1000))/m (г), где D (мг/кг) – средняя доза, Z (г) – средняя масса съеденной приманки, а (г/кг) –содержание д.в. в приманке, m (г) – масса полевки.

При групповом тестировании определяли средние (для ♂♂ и ♀♀) дозы на основе средней массы тела самцов и самок, в индивидуальной рассадке дозу определяли для каждой особи.

При определении ЛД₅₀ бромадиолона дозы родентицида вводили перорально. Тестировали небольшие группы полевок возрастающими дозами бромадиолона. Так как явных отличий по полу выявлено не было, при анализе результатов данные самцов и самок были объединены.

Пробит-анализ. С чувствительными линиями обыкновенной полевки проводили тестирование возрастающими дозами бромадиолона. Для проведения пробит-анализа по экспериментальным данным составляли таблицу, содержащую летальные дозы (мг/кг), и доли летальных исходов (л.и.) (%) от числа грызунов, получивших эти дозы. Доли л.и. преобразовывали в пробиты по Блиссу, летальные дозы – в десятичные логарифмы в соответствие с руководствами [14, 25]. Получали показатели ЛД_50, ЛД₁₆ и ЛД₈₄. Стандартную ошибку ЛД₅₀ определяли по формуле: S_ЛД50 = (ЛД₈₄ – ЛД₁₆)/(√_2N), где N – количество животных в группах, использованных для испытания доз, которые находятся в пределах величин пробитов от 3.5 до 6.5.

Результаты и их обсуждение

Определение ЛД₅₀ чувствительной линии обыкновенной полевки Microtus arvalis. Основатели линии были отловлены в Краснодарском крае в начале подъема численности до проведения обработок и не проходили отбор на устойчивость к антикоагулянтным родентицидам. По результатам введения рассчитанных доз препарата, составили таблицу, объединив данные для ♂♂ и ♀♀ особей обыкновенной полевки, т.к. изменения чувствительности полов были мало различимы (табл. 2). Расчетная величина ЛД₅₀ для обыкновенной полевки Microtus arvalis составила 3.3 ± 0.85 мг/кг.

Таблица 2. Результаты перорального введения концентрата бромадиолона обыкновенной полевке Microtus arvalis

Лабораторное тестирование приманок с д.в. бромадиолон. Основатели линий полевок, которых использовали для тестирования приманок, были отловлены в Краснодарском крае в остаточных поселениях полевок, переживших родентицидные обработки в поле. В лаборатории полевки проходили отбор на устойчивость к этилфенацину. В опытах с индивидуальной и групповой рассадкой проверяли возможность получения приемлемой эффективности при разных сроках экспозиции приманки (0.05 г бромадиолона/кг) (табл. 3).

Таблица 3. Тестирование гранул (0.05 г бромадиолона/кг) на обыкновенной полевке Microtus arvalis

^* Летальный исход (n)/тестировано(n). То же в табл. 4.

При однократной подаче гранул (0.05 г бромадиолона/кг), при средней поедаемости 0.5–0.7 г/особь препарат был не эффективен, при поедаемости 0.7--0.9 г/особь (в расчете на среднюю массу полевки 20 г) эффективность достигала 40–80%. Устойчивый результат 100% получали при 2- и 3-суточном потреблении гранулированной приманки.

В опытах с индивидуальной рассадкой была проведена серия сравнительных опытов для определения эффективности капсулированной и зерновой приманок (0.05 г бромадиолона/кг) (табл. 4).

Таблица 4. Тестирование капсулированной и зерновой приманок (0.05 г бромадиолона/кг) на обыкновенной полевке Microtus arvalis

^* Максимально пережитая доза в группе.

В отсутствие зеленого корма была эффективна доза бромадиолона от 2 до 3 мг/кг. Максимальные дозы переживания у обыкновенной полевки для бромадиолона составили для капсул от 2.2 до 7.2 мг/кг, для зерновой приманки – от 2.8 до 13.7 мг/кг.

В серии опытов был выявлен более высокий уровень резистентности тестируемых выборок по сравнению с чувствительной линией обыкновенной полевки Microtus arvalis, для которой ЛД₅₀ по бромадиолону составила 3.3 ± 0.85 мг/кг.

Определение ЛД₅₀ на устойчивой линии обыкновенной полевки Microtus arvalis. По результатам перорального введения рассчитанных доз препарата составили таблицу, объединив данные для ♂♂ и ♀♀ (не показавших значительных отличий) обыкновенной полевки устойчивой линии (табл. 5).

Таблица 5. Определение ЛД₅₀ по бромадиолону обыкновенной полевки устойчивой линии

Максимальная доза переживания препарата составила 20 мг/кг. Точность расчетов была снижена из-за неравномерности результатов, но полученная оценка ЛД₅₀ = 5.2 мг /кг превышала показатель для чувствительной линии обыкновенной полевки Microtus arvalis, составивший 3.3 мг/кг.

Полученные показатели токсичности бромадиолона для устойчивых линий обыкновенной полевки сравнимы с известными в литературе данными для грызунов, отловленных на регулярно обрабатываемых сельскохозяйственных угодьях Сербии: набор доз обыкновенной полевкой при потреблении в лабораторных опытах приманки с бромадиолоном (сроки экспозиции менялись от 1 до 4 сут) составлял от 4.9 до 20.8 мг/кг, дозы переживания – от 4.9 до 15.7 мг/кг. Для мыши р. Apodemus из того же местообитания дозы переживания составили от 5.9 до 11.2 мг/кг [26]. По нашей оценке, в соответствие с методикой [25], ЛД₅₀ для обыкновенной полевки из Сербии составляла 8–9 мг/кг, что больше в 2–3 раза по сравнению с показателем 3.3 мг/кг для чувствительной линии обыкновенной полевки, полученной в настоящей работе. Опасность вторичных отравлений повышается в случае роста устойчивости популяции целевых грызунов, аккумулирующих большие дозы антикоагулянта. Благополучие агроэкосистем зависит в большой степени от соблюдения регламента применения родентицидов – в России разрешенная норма внесения приманок (0.05 г бромадиолона/кг) составляет 2 кг/га, т.е. 0.1 г бромадиолона/га [27]. Этот показатель в 10 раз меньше, чем разрешено во Франции при механической обработке против водяной полевки с распределением приманки в искусственные норы, где при норме внесения 20 кг приманки/га в посеве пшеницы (0.05 г бромадиолона/кг) токсическая нагрузка составляет 1 г бромадиолона/га [28]. Надо учитывать, что в местах постоянных обработок бромадиолоном резистентность к этому родентициду может повышаться. Родентицидные приманки на основе бромадиолона подходят для контроля численности сообществ мышевидных грызунов при доминировании обыкновенной полевки и проведении обработок в начале роста численности популяции.

Заключение

В лабораторных опытах был выявлен сравнительно высокий уровень резистентности обыкновенной полевки Microtus arvalis к бромадиолону. Возможность набора высоких доз бромадиолона целевыми объектами создает опасность вторичных отравлений миофагов. Применение родентицидов на основе бромадиолона в полевых условиях необходимо проводить при численности грызунов, соответствующей норме внесения 1 г бромадиолона/га с обязательным контролем эффективности. Альтернативой при ограниченном числе действующих веществ в списке разрешенных родентицидов остается бродифакум.

About the authors

N. V. Babich

Author for correspondence.
Email: natbabich@gmail.com
Russian Federation, sh. Podbelskogo 3, Saint Petersburg–Pushkin 196608; 196608 St. Petersburg-Pushkin, s./b. 5

References

Supplementary files