Effect of endophytic strains of Bacillus subtilis on mycorrhization of wheat roots under salt stress

Full Text

Введение

Засоленность почвы является одним из жестких факторов, который ведет к большим экономическим потерям и угрожает продовольственной безопасности во всем мире, поскольку сокращает пригодные для выращивания большинства сельскохозяйственных культур площади пахотных земель [1]. Засоление почвы является глобальной проблемой, по данным ФАО, примерно 7% мировых сельскохозяйственных угодий подвержены засолению, и их доля постоянно увеличивается [2]. Причинами засоления могут быть как глобальное изменение климата, так и неправильное использование агротехники, усиленное и неконтролируемое орошение и чрезмерное использование химических удобрений [1, 2]. Высокая засоленность в основном связана с высокими концентрациями Na⁺ и Cl^– в почве, которые образуют гиперосмотические и гипертонические растворы, препятствующие поглощению растениями воды и питательных веществ [2]. Солевой стресс нарушает биохимические и физиологические процессы в растениях и может вызывать ионный и/или осмотический стресс. На клеточном уровне он вызывает метаболическую токсичность, влияет на фотосинтез, приводит к продукции активных форм кислорода (АФК), вызывает разрушение мембран и даже запрограммированную гибель клеток [1, 2]. На уровне растений эффекты становятся видимыми со временем (от нескольких суток до месяцев) из-за ограниченной способности клеток накапливать ионы. Также обнаруживаются некоторые физиологические изменения, такие как тяжелые некротические поражения листьев, снижение роста, уменьшение количества листьев и нарушение репродукции растений [1, 2].

Физиологические и биохимические изменения растений при стрессе анализируют детально, однако на реакцию симбиотически связанных с растениями организмов, в частности, эндомикоризных грибов обращают меньше внимания. Эти грибы участвуют в мутуалистических ассоциациях с корнями сосудистых растений, обеспечивая растение водой и питательными веществами, получая взамен углеводы [3]. Считается, что реакция микоризных грибов на стресс может также влиять на растения-партнеры, и стрессоустойчивость грибов может снижать стресс растений [3]. Из-за своей неподвижности при постоянном стрессе окружающей среды растения не только развивают свои адаптивные механизмы, но и совместно с почвенными микроорганизмами вырабатывают сложные механизмы сопротивления стрессу [4].

В связи с активным применением в агрохимической практике препаратов на основе эндофитных бактерий, малоизученными остаются тройственные симбиозы, которые могут формировать растительные организмы, эндофитные бактерии и микоризообразующие грибы. Некоторые эндофитные штаммы бактерий активно используют в качестве основной части препаратов для защиты растений от фитопатогенов, например, Bacillus subtilis 26Д – основа биофунгицида “Фитоспорин” [5]. Эти штаммы подавляют рост и развитие грибов, и такой же антогонизм они могут проявлять в отношении к грибным микроорганизмам, формирующим везикулярно-арбускулярную микоризу (ВАМ), однако в условиях стресса характер таких отношений может меняться [6–9]. В связи с этим цель работы – изучение влияния инокуляции семян яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) эндофитными антагонистическими штаммами бактерий B. subtilis на микоризацию корней растений в условиях солевого стресса.

Методика исследования

Объектом исследования служили растения мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Омская-35. Посев производили калиброванными с помощью сита семенами одинакового размера. Семена обрабатывали суспензией спор (10⁶ клеток/мл) эндофитных штаммов бактерий B. subtilis 26Д (коллекция ВНИИСХМ, № 128), B. subtilis 11ВМ (ВНИИСХМ, № 519) из расчета 20 л суспензии/семян. Растения выращивали в почве (выщелоченный чернозем), отобранной с поля, на котором выращивали яровую пшеницу. Для этого 1 кг воздушно-сухой почвы предварительно освобождали от пожнивных остатков и помещали в пластиковый контейнер.

Солевой стресс имитировали однократным поливом почвы раствором NaCl в концентрациях 3, 4, 5, 6 г/кг почвы после посева семян растений. Контрольные растения поливали дистиллированной водой. Через 60 сут растения извлекали из земли, не повреждая корней и листьев, промывали в проточной воде, подсушивали на фильтровальной бумаге и определяли морфометрические показатели. Корни затем отделяли и проводили количественный учет ВАМ по методу Травло [10]. Для этого корни осветляли в растворе 10%-ного KОН, затем промывали 2%-ным раствором НСl и окрашивали трепановым синим. При определении степени колонизации микоризы использовали стандартную технику световой микроскопии окрашенных корней.

Повторность опыта трехкратная. Представлены средние значения и их стандартные отклонения. Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с использованием Microsoft Offis Excel. Для оценки значимости различий средних значений применяли t-критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Корни контрольных растений пшеницы, выросших в отсутствие стресса из семян, неинокулированных эндофитными штаммами бацилл, характеризовались высокой частотой встречаемости микоризы – >84,2% (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние засоления почвы на показатели микоризации корней растений пшеницы сорта Омская 35, обработанных эндофитными бактериями

Вариант	NaCl, г/кг почвы
	0	3	4	5	6
Частота микоризации в корневой системе*, F%
Без обработки	84.2 ± 2.7	68.4 ± 3.5	53.8 ± 2.5	31.6 ± 1.0	16.3 ± 1.8
B. subtilis 26Д	60 ± 2*	73.7 ± 2.9	57.9 ± 3.8	39.1 ± 2.6*	20.0 ± 1.6
B. subtilis 11 ВМ	59.8 ± 2.1*	71.2 ± 3.0	58.4 ± 3.7	38.5 ± 2.0*	21.9 ± 1.2*
Интенсивность колонизации микоризы в корневой системе*, M%
Без обработки	3.6 ± 0.9	2.0 ± 0.5	0.54 ± 0.03	0.32 ± 0.07	0.14 ± 0.01
B. subtilis 26Д	2.2 ± 0.7	2.7 ± 0.3	1.0 ± 0.03	0.8 ± 0.06	0.25 ± 0.02
B. subtilis 11 ВМ	2.1 ± 0.3	2.5 ± 0.2	0.99 ± 0.04	0.79 ± 0.05	0.24 ± 0.02
Интенсивность колонизации микоризы в корневом фрагменте*, m%
Без обработки	3.9 ± 0.9	2.9 ± 0.5	1.7 ± 0.03	1.2 ± 0.07	0.9 ± 0.01
B. subtilis 26Д	3.2 ± 0.7	3.7 ± 0.3	2.0 ± 0.2	1.5 ± 0.06	1.3 ± 0.02
B. subtilis 11 ВМ	3.0 ± 0.3	3.5 ± 0.2	2.1 ± 0.1	1.3 ± 0.05	1.3 ± 0.01
Изобилие арбускул в корневой системе*, A%
Контроль	21.1 ± 1.1	11.9 ± 0.9	7.8 ± 0.2	5.4 ± 0.3	1.0 ± 0.1
B. subtilis 26Д	15.9 ± 0.8	14.9 ± 0.9	9.8 ± 0.3	7.3 ± 0.2	3.1 ± 0.1
B. subtilis 11 ВМ	16.0 ± 1.0	15.0 ± 0.7	9.5 ± 0.4	6.6 ± 0.1	2.8 ± 0.1
Изобилие арбускул в микоризованной части корневого фрагмента*, a%
Без обработки	3.1 ± 0.3	2.4 ± 0.02	1.6 ± 0.1	0.9 ± 0.01	0.3 ± 0.01
B. subtilis 26Д	2.7 ± 0.2	2.6 ± 0.2	1.9 ± 0.1	1.1 ± 0.1	0.5 ± 0.01
B. subtilis 11 ВМ	2.5 ± 0.2	2.4 ± 0.1	1.7 ± 0.1	1.0 ± 0.1	0.3 ± 0.01

* Различия между показателями обработанных и необработанных бактериями растений при разной степени засоленности почвы достоверны при p <0.05. То же в табл. 2.

 

Таблица 2. Влияние обработки семян бактериями на сырую массу надземной части (мг) 30-суточных растений пшеницы сорта Омская 35 при разной концентрации хлорида натрия в почве

Концентрация NaCl, г/кг почвы	Контроль	B. subtilis 26Д	B. subtilis 11ВМ
0	22.5 ± 0.9	26.9 ± 1.0*	33.1 ± 1.1*
3	21.1 ± 0.7	23.7 ± 0.7*	20.8 ± 0.9
4	18.4 ± 0.9	21.8 ± 0.8*	18.6 ± 0.7
5	18.0 ± 0.5	20.4 ± 0.7*	18.2 ± 0.6
6	17.0 ± 0.8	18.0 ± 0.9	17.3 ± 0.8

 

Обработка семян спорами обоих штаммов эндофитных бактерий снижала частоту микоризации корней пшеницы в среднем на 28.8%, что соответствовало полученным нами ранее данным [6– 8, 11]. Эндофитные штаммы бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ обладают антагонистической активностью к различным видам фитопатогенных грибов [12], с чем, вероятно, и связано их действие по отношению к ВАМ.

При выращивании растений пшеницы в почве с NaCl происходило угнетение развития микоризы в корневой системе растений. При внесении в почву NaCl в концентрации 3, 4, 5, 6 г/кг частота микоризации уменьшалась у неинокулированных бактериями растений на 18.7, 36.0%, в 2.6 и 5 раз соответственно. Плохое развитие микоризных грибов при росте растений на засоленных почвах связано, по мнению ряда авторов, с токсическим воздействием соли на развитие арбускулярных грибов [3, 13, 14]. Клетки ВАМ, так же как и растительные, при солевом стрессе испытывают осмотический стресс, нехватку питательных веществ и/или окислительный стресс [3].

У инокулированных бактериями растений частота микоризации также уменьшалась, но была больше, чем у неинокулированных при тех же концентрациях NaCl на 10, 7, 25, 25% соответственно.

Наличие соли в почве приводило к уменьшению и других показателей микоризации корней (интенсивности микоризации, обилия арбускул) в сравнении с контрольными растениями, выросшими без соли и необработанными эндофитными бактериями. Инокуляция семян эндофитными штаммами бактерий вызывала у растений, растущих в почве без соли, аналогично действию солевому стрессу, снижение других показателей микоризации в сравнении с неинокулированными растениями. В условиях засоления почвы показатели микоризации растений (интенсивность микоризации, обилие арбускул), инокулированных бактериями, были, как и показатели частоты микоризации, больше, чем у неинокулированных при тех же концентрациях NaCl.

Подтверждением влияния солевого стресса на физиологические процессы растений пшеницы является анализ биомассы растений. Масса побегов при концентрации NaCl 3, 4, 5, 6 г/кг уменьшалась соответственно на 6.2, 18.2, 20, 24.4% в сравнении с растениями, растущими в почве без соли (табл. 2).

Обработка семян пшеницы эндофитными штаммами бацилл достоверно увеличивала сырую массу побегов в отсутствие солевого стресса. Инокуляция семян бактериями не позволила предотвратить отрицательное влияние засоленности почвы на биомассу растений. В то же время масса побегов пшеницы, инокулированных бактериями и растущих в условиях засоленности почвы, в сравнении с неинокулированными растениями, растущими в тех же условиях, была достоверно больше. Защитные действия штамма B. subtilis 11ВМ на рост растений по сравнению со штаммом B. subtilis 26Д в условиях действия соли были выражены сильнее.

По литературным данным, засоленность почвы негативно сказывается как на растениях, так и на развитии ВАМ и соответственно на колонизации корневой системы растений эндомикоризными грибами [13, 14]. Полученные в модельной системе наши данные подтверждали эти сведения. Практически все показатели микоризации корней были меньше при выращивании растений в засоленной почве. Однако по данным литературы, несмотря на то что прорастание спор при засолении почв снижалось, видовое богатство микоризных грибов и концентрация их спор в почве в условиях засоленности могли и не уменьшаться [15]. В условиях солевого стресса инокуляция семян эндофитными штаммами бактерий B. subtilis не только не проявляли антагонистического эффекта, а наоборот, наблюдали обратный эффект “восстановления” показателей микоризации до величин, полученных при анализе корней растений, неикнокулированных эндофитами и растущих в почве без соли. Характер такого влияния эндофитных бактерий на взаимоотношения пшеницы с микоризными грибами в условиях солевого стресса можно объяснить протекторными свойствами исследованных штаммов бацилл по отношению к растениям при действии стресс-факторов [16]. Согласно нашим исследованиям и данным литературы, эндофитные бактерии могут повышать солеустойчивость растений, вызывая у них физиологические и биохимические приспособления [15, 17]. PGPB-бактерии способны в условиях солевого стресса повышать активность деления клеток в корнях и увеличивать количество корневых волосков [15–18]. Низкомолекулярные органические кислоты и сидерофоры, выделяемые PGPR, могут разлагать нерастворимые минералы посредством комплексообразования, ионного обмена и подкисления, тем самым повышая доступность питательных веществ в почве, снижая pH и облегчая Na⁺-стресс у растений пшеницы [15, 17, 18]. Инокуляция PGPR в условиях солевого стресса повышает эффективность поглощения растениями селективных ионов, уменьшения накопление ионов Na⁺ и Cl^– и регулирует баланс макро- и микроэлементов в растениях и почвах [15, 17]. Все это в дальнейшем приводит к усилению поглощения воды и питательных веществ корнями растений, особенно из более глубоких слоях почвы. Вероятно, благодаря увеличению поступления воды в корни растений, предобработанных бактериями, микориза способна хорошо развиваться, что в целом положительно сказывается на росте различных органов растений.

Накопленные растением вещества благодаря “микоризному” поглощению поддерживают низкий осмотический потенциал, что позволяет им использовать воду более эффективно [19]. Кроме того, у растений с более высокими показателями микоризации проявляется и более высокая активность антиоксидантных ферментов, отмечено большее содержание пролина, что было продемонстрировано и описано также в наших работах [16, 17].

Инокуляция семян эндофитными штаммами B. subtilis 26Д и 11 ВМ, вероятно, улучшала питание растений при солевом стрессе не только за счет собственных механизмов, но и за счет функционирования микоризного симбиоза. В то же время, можно было наблюдать эффект “гашения” эндофитными бактериями указанных защитных реакций, “открывавших” путь микоризным грибам, которые по нашим сведениям и данным литературы [20–22], в ходе прорастания семян проникают внутрь растительных тканей позже, чем бактериальный клетки.

Заключение

Выявлено, что показатели микоризации корней растений уменьшались как при засолении почвы, так и при обработке семян эндофитными бактериями. В условиях солевого стресса у растений, инокулированных эндофитными представителями B. subtilis, обнаружено увеличение показателей микоризации. В некоторых случаях показатели микоризации у таких растений были не только близки к показателям контрольных растений, растущих без обработки семян и без солевого стресса, но даже превышали их.

Вероятно, в условиях стрессового действия на растение-хозяина всем трем участникам симбиотической системы выгоднее выживать вместе, сохраняя репродуктивный потенциал для следующих поколений.

About the authors

Z. M. Kuramshina

Sterlitamak Branch of Ufa University of Science and Technology

Email: kuramshina_zilya@mail.ru
Russian Federation, prosp. Lenina 49, Sterlitamak 453103

R. M. Khairullin

Institute of Biochemistry and Genetics of the Ufa Research Center of the RAS

Email: kuramshina_zilya@mail.ru
Russian Federation, prosp. Oktyabrya 71, Ufa 454054

A. A. Yamaleeva

Ufa University of Science and Technology

Author for correspondence.
Email: kuramshina_zilya@mail.ru
Russian Federation, ul. Zaki Validi 32, Ufa 450076

References

Supplementary files