Increasing of Spring Wheat Plant Resistance to Copper Toxicity by Application of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Metal-Contaminated Soil

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Медь (Cu) является одним из биологически значимых и необходимых элементов для растений [1], однако при повышенных концентрациях может оказывать токсическое действие [2–4]. В избыточных концентрациях Cu негативно влияет на рост растений, ингибирует фотосинтез и физиологические процессы в растениях и уменьшает урожай [2]. Фитотоксичность загрязненной Cu почвы, которая, как правило, приводит к нарушению физиолого-биохимических процессов в растении, проявляется в снижении количества и качества величины биомассы растений [2–4]. Влияние загрязнения почвы Cu на растения и биохимические показатели растений зависело от дозы внесенного металла, вида растения и типа почвы [3, 4]. Избыточное содержание в почве доступных соединений тяжелых металлов (ТМ), оказывая негативное влияние на основные физиолого-биохимические процессы в растениях, может приводить в том числе к нарушению поступления в них биофильных элементов [5–7].

Для восстановления загрязненных ТМ почв используют процесс биоремедиации, который включает в себя применение микроорганизмов, растений и ассоциированных с растениями микроорганизмов [8, 9]. Биоремедиация является экономически выгодным и эффективным методом восстановления почв [9–11]. Применение стимулирующих рост растений ризосферных бактерий играет важную роль в повышении толерантности растений к токсическому действию повышенных концентраций в почве ТМ [12]. Кроме того, процесс фиторемедиации, основанный на применении растений, является одним из лучших способов удаления загрязнителей, в том числе ТМ из почвы, эффективность которого усиливается при совместном использовании растений с ризобактериями [12]. Бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, привлекают особое внимание из-за их огромных возможностей по усилению роста и развития растений как в нормальных, так и стрессовых условиях, в том числе при загрязнении почв ТМ [13, 14]. Сообщают, что Pseudomonas обладают высокой устойчивостью к металлам и способностью к биоремедиации, в том числе в ассоциациях с различными видами растений [8]. Установлены значительная стимуляция роста растений подсолнечника и увеличение поглощения Cu вегетативной биомассой и корнями после инокуляции бактерией P. lurida штаммом EOO26 на фоне загрязнения почвы CuSO₄·5H₂O [15]. Однако в настоящее время по-прежнему недостаточно изучены механизмы детоксикации ТМ в ризосфере при внесении эффективных ризосферных бактерий. Установлено, что стимулирование роста растений при загрязнении почвы ТМ при применении бактерий рода Pseudomonas происходит в том числе вследствие улучшения минерального питания растений [5–7]. Исследований влияния вышеупомянутых бактерий на рост, минеральное питание растений при загрязнении почвы Cu проведено относительно недостаточно.

Цель работы – изучение влияния ростостимулирующих ризосферных бактерий рода Pseudomonas на рост растений яровой пшеницы и элементный химический состав растений, включая содержание в них Cu, при загрязнении почвы металлом в повышенной концентрации.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Растения яровой пшеницы T. aestivum L. сорта Злата (селекция Московского НИЦ “Немчиновка”) выращивали на агросерой почве юга Московской обл. в вегетационном опыте при искусственном загрязнении почвы водорастворимым соединением Cu. В сосудах, содержащих 0.8 кг почвы, выращивали по 9 растений до фазы выхода в трубку в течение 27 сут. В контрольном варианте растения выращивали без внесения Cu и бактерий, в другом варианте – с внесением Cu без бактерий, в остальных вариантах – на фоне загрязнения почвы Cu с внесением каждой бактерии. В вариантах с загрязнением Cu вносили 300 мг/кг в виде Cu(NO₃)₂·3H₂O квалификации “хч” (Реахим, Россия). Это соответствовало 2.3 ориентировочно-допустимой концентрации (ОДК) для данного типа почв [16]. С этой солью было внесено 106 мг N/сосуд, поэтому в контрольном варианте (без внесения Cu(NO₃)₂·3H₂O и бактерий) применяли азот в виде NH₄NO₃ в такой же дозе, какая была использована в загрязненных вариантах. Таким образом, доза азота была выровнена и одинакова во всех вариантах опыта. Растения во всех вариантах выращивали на фоне внесения PK-удобрений в виде однозамещенного фосфорнокислого калия и сернокислого калия по 106 мг д. в./сосуд, исходя из соотношения N : P : K = 1 : 1 : 1. Все соли были внесены за 10 сут до посева семян. В работе испытывали влияние бактерий, стимулирующих рост и повышающих урожай различных культурных: бактерии P. fluorescens штамм 20, бактерии P. fluorescens штамм 21 и бактерии P. putida штамм 23 на накопление биомассы растениями, содержание в них Cu и других биофильных элементов [17]. При посеве стерилизованные, пророщенные семена раскладывали на почве, инокулировали водными суспензиями чистых культур бактерий в водопроводной воде из расчета 10⁸ клеток/растение и засыпали 3-см слоем почвы. В вариантах без внесения бактерий применяли аналогичным образом адекватное количество автоклавированных бактериальных суспензий. В опыте была использована пахотная, среднесуглинистая агросерая почва (Luvic Retic Greyzemic Phaeozems (Loamic), слой 0–20 см), на которой в предшествующий год выращивали ячмень. Почва имела следующие показатели: pH_KCl 6.14, C_орг – 0.95%, N_вал – 0.15%, обменные основания Са – 11.06, Мg – 1.52, K – 0.45 м/ моль(+), подвижные P₂O₅ и K₂O (0.2 н. HCl) – 7.37 и 11.2 мг/100 г почвы соответственно. Содержание C_орг и N_вал в почве определяли на анализаторе vario EL cube 19.10-0000 (Германия), pH_KCl – на рН-метре pH 325-B (WTW, Германия). Влажность почвы в сосудах в течение вегетационного периода поддерживали поливами на уровне ≥60% ПВ (21 мас.%). Повторность опыта четырехкратная.

Вегетативную массу растений убирали в фазе трубкования, корни отмывали от почвы водопроводной, а затем промывали дистиллированной водой. Растительный материал высушивали при 70°C и взвешивали. Вегетативную массу и корни (по 0.5 г) озоляли в смеси концентрированных кислот HNO₃ : HClO₄ = 2 : 1 и анализировали на содержание Cu и P, К, Ca, Mg, Fe, Mn и Zn. Содержание Cu и других зольных элементов (кроме калия) в растворах определяли методом эмиссионно-оптической спектроскопии индуктивно-связанной плазмы на спектрометре ICP-OES 5110 (Agilent, США). Калий определяли методом пламенной фотометрии на пламенном фотометре BWB XP (BWB, Великобритания), pH – на приборе pH 325-B (WTW, Германия). После сжигания растительного материала (0.1 г) в разбавленной серной кислоте (1 : 2) с катализатором (K₂SO₄ : Zn : Se : CuSO₄·5H₂O = 100 : 24 : 2 : 0.2) определяли содержание в растениях валового азота феноловым методом. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета MS Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При загрязнении почвы Cu установлено ингибирование роста яровой пшеницы в фазе выхода в трубку (табл. 1).

 

Таблица 1. Биомасса растений яровой пшеницы в фазе трубкования

Вариант	Вегетативная масса	Корни	Целое растение
	сухое вещество, г/сосуд
Без Cu и внесения бактерий – контроль	2.65	0.61	3.26
Cu без внесения бактерий	2.01	0.41	2.42
Cu + P. fluorescens 20	2.32	0.50	2.82
Cu + P. fluorescens 21	2.28	0.49	2.77
Cu + P. putida 23	2.33	0.51	2.84
НСР05	0.26	0.08	0.34

 

Это выражалось в уменьшении массы вегетативных органов и целых растений на 24–26% относительно контроля – варианта без загрязнения металлом и внесения бактерий. Масса корней в условиях Cu-стресса уменьшилась в еще бóльшей степени – на 33%. Применение всех бактерий уменьшало токсическое действие металла на растения. При внесении бактерий вегетативная масса растений, подвергнутых Cu-стрессу, была на 13–16% больше в сравнении с вариантом с загрязнением почвы металлом без внесения бактерий. Бактерии при загрязнении Cu также способствовали лучшему росту корневой системы – масса корней загрязненных растений в вариантах со всеми бактериями увеличилась на 20–24%. При применении бактерий вегетативная масса растений достигала 86–88% в сравнении с незагрязненными неинокулированными растениями – контролем, а корневая масса составляла 80–84%.

В табл. 2 представлено содержание Cu в растениях. Загрязнение Cu почвы как без, так и при внесении бактерий существенно, до полутора раз увеличило значения этого показателя в вегетативной массе.

 

Таблица 2. Содержание Cu в растениях в фазе трубкования

Вариант	Вегетативная масса	Корни
	содержание Cu, мг/кг растительного материала
Без Cu и внесения бактерий – контроль	11	24
Cu без внесения бактерий	15	399
Cu + P. fluorescens 20	15	456
Cu + P. fluorescens 21	17	441
Cu + P. putida 23	15	440

Примечание. Ошибки определения содержания Cu не превышали 15%.

 

При загрязнении почвы Cu его содержание в корневой системе увеличилось в значительно бóльшей степени, чем в вегетативной массе. В варианте без внесения бактерий этот показатель увеличился в 17 раз, при внесении бактерий – в 18–19 раз по сравнению с контролем. Относительно варианта с загрязнением Cu без бактерий содержание металла в корнях при инокуляции P. fluorescens 20 увеличилось на 14, при применении P. fluorescens 21 и P. putida 23 – в виде тенденции – на 10–11%. В корнях вне зависимости от внесения бактерий содержалось более чем на порядок больше Cu, чем в надземной биомассе.

Загрязнение почвы Cu без внесения бактерий не оказывало влияния на потребление или вынос металла (в мкг/сосуд) вегетативной массой из почвы относительно контроля (табл. 3).

 

Таблица 3. Потребление Cu растениями в фазе трубкования

Вариант	Вегетативная масса	Корни	Целое растение
	потребление Cu, мкг/сосуд
Без Cu и внесения бактерий – контроль	29	15	143
Cu без внесения бактерий	30	164	194
Cu + P. fluorescens 20	35	228	263
Cu + P. fluorescens 21	39	216	2555
Cu + P. putida 23	35	224	259
НСР05	4	31	40

 

Применение бактерий в загрязненных условиях увеличило этот показатель для вегетативной массы растений на 21–30%, в наибольшей степени в варианте с P. fluorescens 21 в сравнении с вариантом с загрязнением металлом без бактерий. Таким образом, внесение бактерий усилило фитоэкстракцию – очистку загрязненной почвы. При загрязнении почвы Cu наиболее значительно увеличился вынос металла корневой системой: в варианте без бактерий – в 11 раз, в вариантах с бактериями – в 14–15 раз относительно контроля. Под влиянием бактерий вынос Cu корнями в загрязненных условиях увеличился на 32–39%, аналогичные закономерности отмечены и для целых растений: соответственно 4- и 6-кратное увеличение и увеличение на 32–36%. Потребление Cu корнями было более чем на порядок больше в сравнении с вегетативной биомассой вследствие значительно бóльшего содержания металла в корневой системе.

В табл. 4 представлены данные по содержанию биофильных элементов в растениях в фазе трубкования после завершения опыта.

 

Таблица 4. Содержание биофильных элементов в растениях в фазе трубкования

Вариант	N	P	K	Ca	Mg	Fe	Mn	Zn
	%					мг/кг
Вегетативная масса
Без Cu и внесения бактерий – контроль	4.21	0.51	3.76	0.92	0.27	113	54	33
Cu без внесения бактерий	3.90	0.40	4.49	1.23	0.26	106	57	26
Cu + P. fluorescens 20	3.99	0.40	4.94	1.19	0.27	112	57	25
Cu + P. fluorescens 21	4.21	0.42	4.99	1.24	0.28	110	58	28
Cu + P. putida 23	4.01	0.38	4.83	1.18	0.27	105	54	25
Корни
Без Cu и внесения бактерий – контроль	2.74	0.46	1.74	1.10	0.51	0.58	187	89
Cu без внесения бактерий	2.14	0.35	1.19	1.56	0.55	0.50	176	70
Cu + P. fluorescens 20	2.14	0.36	1.33	1.63	0.62	0.60	201	75
Cu + P. fluorescens 21	2.30	0.39	1.51	1.37	0.58	0.55	195	72
Cu + P. putida 23	2.25	0.38	1.35	1.47	0.50	0.57	189	77

Примечания. 1. Содержание Fe в корнях дано в %. 2. Средние из четырех повторностей опыта. Ошибки определений макро- и микроэлементов в вариантах опыта не превышали соответственно 5 и 15 %.

 

Загрязнение почвы Cu вне зависимости от внесения бактерий оказало влияние на содержание отдельных элементов в растениях, что свидетельствовало о влиянии повышенной концентрации Cu на метаболические процессы в растениях. В загрязненных условиях без внесения бактерий относительно контрольного варианта в вегетативной массе уменьшилось содержание N и P, напротив, увеличилось содержание K и Ca и не обнаружено значимых изменений этого показателя для остальных элементов. В корнях загрязненных неинокулированных растений эти зависимости сохранялись, кроме значительного уменьшения содержания в них K, в отличие от вегетативной массы. В загрязненных растениях вне зависимости от внесения бактерий уменьшилось содержание фосфора как в вегетативной массе, так и в корнях. Отмечено проявление антагонизма меди и фосфора, что, вероятно, было связано со свойством избыточных концентраций Cu ингибировать в растениях активность фермента фосфатазы, определяющей доступность фосфора растениям [18]. Увеличение концентрации K и Ca в растениях в загрязненных вариантах могло быть связано с возрастанием подвижности этих элементов в почве при внесении в почву высокой дозы Cu, а также значимым при этом уменьшением массы растений и возможным нарушением механизмов поглощения ими элементов. Внесение всех бактерий при загрязнении почвы Cu по сравнению с вариантом без бактериальных инокуляций в загрязненных условиях не оказало существенного влияния на содержание в вегетативных органах и корнях практически всех изученных биофильных элементов, за исключением достоверного увеличения этого показателя для K в обоих частях растений.

При загрязнении почвы Cu без применения бактерий установлено значительное уменьшение поглощения из почвы или накопления вегетативной массой и целыми растениями практически всех исследованных элементов, за исключением Ca и K, для которых этот показатель не был подвергнут значительным изменениям (табл. 5). В корнях в условиях Cu-стресса без применения бактерий зафиксировано уменьшение накопления всех элементов. Внесение данных бактерий в загрязненных условиях значительно увеличило потребление всех биофильных элементов растениями в сравнении с вариантом загрязнения Сu без применения бактерий. Эта закономерность была обнаружена как для вегетативной массы, так и для корневой системы. Уменьшение токсического действия Cu и увеличение при этом биомассы инокулированных бактериями растений (табл. 1) несомненно было связано с увеличением потребления биофильных элементов растениями из почвы – улучшением их минерального питания. В нашем исследовании бактерии не обеспечили увеличения потребления питательных элементов загрязненными металлом растениями до уровня в контрольном варианте. Следует отметить, что в корнях во всех вариантах опыта накапливалось примерно на порядок больше Fe, чем в вегетативной массе, что, вероятно, было обусловлено биологическими особенностями яровой пшеницы. Аналогичная закономерность была ранее установлена для этой культуры в фазе трубкования [7]. Увеличение потребления биофильных элементов растениями из загрязненной почвы при внесении всех бактерий происходило без существенных изменений в растениях содержаний в целом практически всех биофильных элементов вследствие стимуляции роста растений и увеличения растительной биомассы. Стимуляция роста растений под влиянием бактерий рода Pseudomonas происходит в том числе вследствие продуцирования ими физиологически активных веществ – фитогормонов, в частности, индолилуксусной кислоты [19], что также было обнаружено нами в предыдущих исследованиях [20].

 

Таблица 5. Потребление биофильных элементов растениями в фазе трубкования

Вариант	N	P	K	Ca	Mg	Fe	Mn	Zn
	мг/cосуд				мкг/сосуд
Вегетативная масса
Без Cu и внесения бактерий – контроль	112	14	100	24	715	300	143	88
Cu без внесения бактерий	78	8	90	25	522	213	115	52
Cu + P. fluorescens 20	93	9	115	28	626	260	132	58
Cu + P. fluorescens 21	96	10	114	28	638	251	132	64
Cu + P. putida 23	94	9	113	28	629	245	126	58
НСР05	12	1	20	3	89	30	10	6
Корни
Без Cu и внесения бактерий – контроль	17	3	11	7	311	3580	114	54
Cu без внесения бактерий	9	1	5	6	226	2050	72	29
Cu + P. fluorescens 20	11	2	7	8	310	3000	101	38
Cu + P. fluorescens 21	11	2	7	7	284	2700	96	35
Cu + P. putida 23	12	2	7	8	255	2910	96	39
НСР05	2	1	1	1	25	512	17	7
Целое растение
Без Cu и внесения бактерий – контроль	129	17	111	31	1070	3880	257	142
Cu без внесения бактерий	87	9	95	31	748	2260	187	81
Cu + P. fluorescens 20	104	11	122	36	936	3260	233	96
Cu + P. fluorescens 21	107	12	121	35	922	2950	228	99
Cu + P. putida 23	108	11	120	35	884	3150	222	97
НСР05	14	2	15	4	110	460	34	13

 

При загрязнении почвы Cu в вариантах с внесением бактерий после удаления растений в фазе трубкования по сравнению с вариантом с загрязнением почвы без внесения бактерий не установлено значимых изменений реакции почвенной среды (табл. 6), которая, как известно, оказывает значительное влияние на подвижность химических элементов в почве.

 

Таблица 6. Реакция почвенной среды после выращивания растений (фаза трубкования)

Вариант	pHKCI почвенной суспензии
Без Cu и внесения бактерий – контроль	6.14 ± 0.02
Cu без внесения бактерий	6.17 ± 0.02
Cu + P. fluorescens 20	6.19 ± 0.07
Cu + P. fluorescens 21	6.14 ± 0.07
Cu + P. putida 23	6.20 ± 0.05

Примечание. Средние 4-х повторностей опыта ± отклонение от среднего.

 

Загрязнение почвы Сu без бактериальных инокуляций также не оказывало значимого влияния на данный показатель. Следовательно, увеличение аккумуляции Сu в растениях – усиление фитоэкстракции под влиянием бактерий – происходило без существенных изменений реакции почвенной среды и, вероятно, было обусловлено продуцируемыми бактериями органическими экзометаболитами – сидерофорами, свойственными флуоресцирующим видам Pseudomonas [14, 19, 21]. Увеличение поступления Cu в растения при внесении ризосферных бактерий, вероятно, было связано с увеличением биодоступности металла в почве вследствие образования бактериальных сидерофоров.

ВЫВОДЫ

1. Внесение ростостимулирующих ризосферных бактерий P. fluorescens 20, P. fluorescens 21 и P. putida 23 в искусственно загрязненную Cu агросерую почву в дозе 300 мг/кг почвы уменьшило фитотоксичность Cu в фазе трубкования, стимулировало рост растений яровой пшеницы и увеличило массу вегетативных органов и корней. Применение бактерий не устраняло полностью токсическое действие на растения металла, внесенного в повышенной концентрации.
2. Внесение бактерий в загрязненную Cu почву значительно увеличило потребление, или вынос, металла вегетативной массой растений из почвы – усилило фитоэкстракцию в максимальной степени при применении P. fluorescens 21. Загрязнение почвы Cu вне зависимости от бактерий увеличило концентрацию металла в вегетативной массе растений.
3. Повышение устойчивости растений к токсическому действию Cu при внесении бактерий было обусловлено улучшением минерального питания растений – увеличением потребления вегетативной массой и корневой системой из загрязненной почвы макроэлементов N, P, K, Ca и Mg, Fe и микроэлементов Mn и Zn и содержания и накопления Cu в корнях. Это свидетельствовало об ответной протекторной реакции растений на загрязнение почвы Cu.
4. Увеличение потребления изученных биофильных элементов растениями яровой пшеницы из загрязненной почвы при внесении бактерий происходило вследствие стимуляции роста и увеличения растительной биомассы, без существенных изменений в целом содержаний практически всех элементов в растениях, за исключением содержания К.
5. Загрязнение почвы Cu без внесения бактерий уменьшило потребление растениями большинства биофильных элементов и ингибировало рост растений.
6. Внесение бактерий в загрязненных условиях не сопровождалось значимыми изменениями реакции почвенной среды.

Авторы благодарят ЦКП ИФХиБПП РАН за выполнение химических анализов почвы.

作者简介

V. Shabayeva

Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science of RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: vpsh@rambler.ru
俄罗斯联邦, ul. Institutskaya 2, Moscow region, Pushchino 142290

V. Ostroumov

Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science of RAS

Email: vpsh@rambler.ru
俄罗斯联邦, ul. Institutskaya 2, Moscow region, Pushchino 142290

参考

补充文件