Повышение устойчивости растений яровой пшеницы к токсичности меди при применении ростстимулирующих ризосферных бактерийна загрязненной металлом почве

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Медь (Cu) является одним из биологически значимых и необходимых элементов для растений [1], однако при повышенных концентрациях может оказывать токсическое действие [2–4]. В избыточных концентрациях Cu негативно влияет на рост растений, ингибирует фотосинтез и физиологические процессы в растениях и уменьшает урожай [2]. Фитотоксичность загрязненной Cu почвы, которая, как правило, приводит к нарушению физиолого-биохимических процессов в растении, проявляется в снижении количества и качества величины биомассы растений [2–4]. Влияние загрязнения почвы Cu на растения и биохимические показатели растений зависело от дозы внесенного металла, вида растения и типа почвы [3, 4]. Избыточное содержание в почве доступных соединений тяжелых металлов (ТМ), оказывая негативное влияние на основные физиолого-биохимические процессы в растениях, может приводить в том числе к нарушению поступления в них биофильных элементов [5–7].

Для восстановления загрязненных ТМ почв используют процесс биоремедиации, который включает в себя применение микроорганизмов, растений и ассоциированных с растениями микроорганизмов [8, 9]. Биоремедиация является экономически выгодным и эффективным методом восстановления почв [9–11]. Применение стимулирующих рост растений ризосферных бактерий играет важную роль в повышении толерантности растений к токсическому действию повышенных концентраций в почве ТМ [12]. Кроме того, процесс фиторемедиации, основанный на применении растений, является одним из лучших способов удаления загрязнителей, в том числе ТМ из почвы, эффективность которого усиливается при совместном использовании растений с ризобактериями [12]. Бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, привлекают особое внимание из-за их огромных возможностей по усилению роста и развития растений как в нормальных, так и стрессовых условиях, в том числе при загрязнении почв ТМ [13, 14]. Сообщают, что Pseudomonas обладают высокой устойчивостью к металлам и способностью к биоремедиации, в том числе в ассоциациях с различными видами растений [8]. Установлены значительная стимуляция роста растений подсолнечника и увеличение поглощения Cu вегетативной биомассой и корнями после инокуляции бактерией P. lurida штаммом EOO26 на фоне загрязнения почвы CuSO₄·5H₂O [15]. Однако в настоящее время по-прежнему недостаточно изучены механизмы детоксикации ТМ в ризосфере при внесении эффективных ризосферных бактерий. Установлено, что стимулирование роста растений при загрязнении почвы ТМ при применении бактерий рода Pseudomonas происходит в том числе вследствие улучшения минерального питания растений [5–7]. Исследований влияния вышеупомянутых бактерий на рост, минеральное питание растений при загрязнении почвы Cu проведено относительно недостаточно.

Цель работы – изучение влияния ростостимулирующих ризосферных бактерий рода Pseudomonas на рост растений яровой пшеницы и элементный химический состав растений, включая содержание в них Cu, при загрязнении почвы металлом в повышенной концентрации.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Растения яровой пшеницы T. aestivum L. сорта Злата (селекция Московского НИЦ “Немчиновка”) выращивали на агросерой почве юга Московской обл. в вегетационном опыте при искусственном загрязнении почвы водорастворимым соединением Cu. В сосудах, содержащих 0.8 кг почвы, выращивали по 9 растений до фазы выхода в трубку в течение 27 сут. В контрольном варианте растения выращивали без внесения Cu и бактерий, в другом варианте – с внесением Cu без бактерий, в остальных вариантах – на фоне загрязнения почвы Cu с внесением каждой бактерии. В вариантах с загрязнением Cu вносили 300 мг/кг в виде Cu(NO₃)₂·3H₂O квалификации “хч” (Реахим, Россия). Это соответствовало 2.3 ориентировочно-допустимой концентрации (ОДК) для данного типа почв [16]. С этой солью было внесено 106 мг N/сосуд, поэтому в контрольном варианте (без внесения Cu(NO₃)₂·3H₂O и бактерий) применяли азот в виде NH₄NO₃ в такой же дозе, какая была использована в загрязненных вариантах. Таким образом, доза азота была выровнена и одинакова во всех вариантах опыта. Растения во всех вариантах выращивали на фоне внесения PK-удобрений в виде однозамещенного фосфорнокислого калия и сернокислого калия по 106 мг д. в./сосуд, исходя из соотношения N : P : K = 1 : 1 : 1. Все соли были внесены за 10 сут до посева семян. В работе испытывали влияние бактерий, стимулирующих рост и повышающих урожай различных культурных: бактерии P. fluorescens штамм 20, бактерии P. fluorescens штамм 21 и бактерии P. putida штамм 23 на накопление биомассы растениями, содержание в них Cu и других биофильных элементов [17]. При посеве стерилизованные, пророщенные семена раскладывали на почве, инокулировали водными суспензиями чистых культур бактерий в водопроводной воде из расчета 10⁸ клеток/растение и засыпали 3-см слоем почвы. В вариантах без внесения бактерий применяли аналогичным образом адекватное количество автоклавированных бактериальных суспензий. В опыте была использована пахотная, среднесуглинистая агросерая почва (Luvic Retic Greyzemic Phaeozems (Loamic), слой 0–20 см), на которой в предшествующий год выращивали ячмень. Почва имела следующие показатели: pH_KCl 6.14, C_орг – 0.95%, N_вал – 0.15%, обменные основания Са – 11.06, Мg – 1.52, K – 0.45 м/ моль(+), подвижные P₂O₅ и K₂O (0.2 н. HCl) – 7.37 и 11.2 мг/100 г почвы соответственно. Содержание C_орг и N_вал в почве определяли на анализаторе vario EL cube 19.10-0000 (Германия), pH_KCl – на рН-метре pH 325-B (WTW, Германия). Влажность почвы в сосудах в течение вегетационного периода поддерживали поливами на уровне ≥60% ПВ (21 мас.%). Повторность опыта четырехкратная.

Вегетативную массу растений убирали в фазе трубкования, корни отмывали от почвы водопроводной, а затем промывали дистиллированной водой. Растительный материал высушивали при 70°C и взвешивали. Вегетативную массу и корни (по 0.5 г) озоляли в смеси концентрированных кислот HNO₃ : HClO₄ = 2 : 1 и анализировали на содержание Cu и P, К, Ca, Mg, Fe, Mn и Zn. Содержание Cu и других зольных элементов (кроме калия) в растворах определяли методом эмиссионно-оптической спектроскопии индуктивно-связанной плазмы на спектрометре ICP-OES 5110 (Agilent, США). Калий определяли методом пламенной фотометрии на пламенном фотометре BWB XP (BWB, Великобритания), pH – на приборе pH 325-B (WTW, Германия). После сжигания растительного материала (0.1 г) в разбавленной серной кислоте (1 : 2) с катализатором (K₂SO₄ : Zn : Se : CuSO₄·5H₂O = 100 : 24 : 2 : 0.2) определяли содержание в растениях валового азота феноловым методом. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета MS Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При загрязнении почвы Cu установлено ингибирование роста яровой пшеницы в фазе выхода в трубку (табл. 1).

 

Таблица 1. Биомасса растений яровой пшеницы в фазе трубкования

Вариант	Вегетативная масса	Корни	Целое растение
	сухое вещество, г/сосуд
Без Cu и внесения бактерий – контроль	2.65	0.61	3.26
Cu без внесения бактерий	2.01	0.41	2.42
Cu + P. fluorescens 20	2.32	0.50	2.82
Cu + P. fluorescens 21	2.28	0.49	2.77
Cu + P. putida 23	2.33	0.51	2.84
НСР05	0.26	0.08	0.34

 

Это выражалось в уменьшении массы вегетативных органов и целых растений на 24–26% относительно контроля – варианта без загрязнения металлом и внесения бактерий. Масса корней в условиях Cu-стресса уменьшилась в еще бóльшей степени – на 33%. Применение всех бактерий уменьшало токсическое действие металла на растения. При внесении бактерий вегетативная масса растений, подвергнутых Cu-стрессу, была на 13–16% больше в сравнении с вариантом с загрязнением почвы металлом без внесения бактерий. Бактерии при загрязнении Cu также способствовали лучшему росту корневой системы – масса корней загрязненных растений в вариантах со всеми бактериями увеличилась на 20–24%. При применении бактерий вегетативная масса растений достигала 86–88% в сравнении с незагрязненными неинокулированными растениями – контролем, а корневая масса составляла 80–84%.

В табл. 2 представлено содержание Cu в растениях. Загрязнение Cu почвы как без, так и при внесении бактерий существенно, до полутора раз увеличило значения этого показателя в вегетативной массе.

 

Таблица 2. Содержание Cu в растениях в фазе трубкования

Вариант	Вегетативная масса	Корни
	содержание Cu, мг/кг растительного материала
Без Cu и внесения бактерий – контроль	11	24
Cu без внесения бактерий	15	399
Cu + P. fluorescens 20	15	456
Cu + P. fluorescens 21	17	441
Cu + P. putida 23	15	440

Примечание. Ошибки определения содержания Cu не превышали 15%.

 

При загрязнении почвы Cu его содержание в корневой системе увеличилось в значительно бóльшей степени, чем в вегетативной массе. В варианте без внесения бактерий этот показатель увеличился в 17 раз, при внесении бактерий – в 18–19 раз по сравнению с контролем. Относительно варианта с загрязнением Cu без бактерий содержание металла в корнях при инокуляции P. fluorescens 20 увеличилось на 14, при применении P. fluorescens 21 и P. putida 23 – в виде тенденции – на 10–11%. В корнях вне зависимости от внесения бактерий содержалось более чем на порядок больше Cu, чем в надземной биомассе.

Загрязнение почвы Cu без внесения бактерий не оказывало влияния на потребление или вынос металла (в мкг/сосуд) вегетативной массой из почвы относительно контроля (табл. 3).

 

Таблица 3. Потребление Cu растениями в фазе трубкования

Вариант	Вегетативная масса	Корни	Целое растение
	потребление Cu, мкг/сосуд
Без Cu и внесения бактерий – контроль	29	15	143
Cu без внесения бактерий	30	164	194
Cu + P. fluorescens 20	35	228	263
Cu + P. fluorescens 21	39	216	2555
Cu + P. putida 23	35	224	259
НСР05	4	31	40

 

Применение бактерий в загрязненных условиях увеличило этот показатель для вегетативной массы растений на 21–30%, в наибольшей степени в варианте с P. fluorescens 21 в сравнении с вариантом с загрязнением металлом без бактерий. Таким образом, внесение бактерий усилило фитоэкстракцию – очистку загрязненной почвы. При загрязнении почвы Cu наиболее значительно увеличился вынос металла корневой системой: в варианте без бактерий – в 11 раз, в вариантах с бактериями – в 14–15 раз относительно контроля. Под влиянием бактерий вынос Cu корнями в загрязненных условиях увеличился на 32–39%, аналогичные закономерности отмечены и для целых растений: соответственно 4- и 6-кратное увеличение и увеличение на 32–36%. Потребление Cu корнями было более чем на порядок больше в сравнении с вегетативной биомассой вследствие значительно бóльшего содержания металла в корневой системе.

В табл. 4 представлены данные по содержанию биофильных элементов в растениях в фазе трубкования после завершения опыта.

 

Таблица 4. Содержание биофильных элементов в растениях в фазе трубкования

Вариант	N	P	K	Ca	Mg	Fe	Mn	Zn
	%					мг/кг
Вегетативная масса
Без Cu и внесения бактерий – контроль	4.21	0.51	3.76	0.92	0.27	113	54	33
Cu без внесения бактерий	3.90	0.40	4.49	1.23	0.26	106	57	26
Cu + P. fluorescens 20	3.99	0.40	4.94	1.19	0.27	112	57	25
Cu + P. fluorescens 21	4.21	0.42	4.99	1.24	0.28	110	58	28
Cu + P. putida 23	4.01	0.38	4.83	1.18	0.27	105	54	25
Корни
Без Cu и внесения бактерий – контроль	2.74	0.46	1.74	1.10	0.51	0.58	187	89
Cu без внесения бактерий	2.14	0.35	1.19	1.56	0.55	0.50	176	70
Cu + P. fluorescens 20	2.14	0.36	1.33	1.63	0.62	0.60	201	75
Cu + P. fluorescens 21	2.30	0.39	1.51	1.37	0.58	0.55	195	72
Cu + P. putida 23	2.25	0.38	1.35	1.47	0.50	0.57	189	77

Примечания. 1. Содержание Fe в корнях дано в %. 2. Средние из четырех повторностей опыта. Ошибки определений макро- и микроэлементов в вариантах опыта не превышали соответственно 5 и 15 %.

 

Загрязнение почвы Cu вне зависимости от внесения бактерий оказало влияние на содержание отдельных элементов в растениях, что свидетельствовало о влиянии повышенной концентрации Cu на метаболические процессы в растениях. В загрязненных условиях без внесения бактерий относительно контрольного варианта в вегетативной массе уменьшилось содержание N и P, напротив, увеличилось содержание K и Ca и не обнаружено значимых изменений этого показателя для остальных элементов. В корнях загрязненных неинокулированных растений эти зависимости сохранялись, кроме значительного уменьшения содержания в них K, в отличие от вегетативной массы. В загрязненных растениях вне зависимости от внесения бактерий уменьшилось содержание фосфора как в вегетативной массе, так и в корнях. Отмечено проявление антагонизма меди и фосфора, что, вероятно, было связано со свойством избыточных концентраций Cu ингибировать в растениях активность фермента фосфатазы, определяющей доступность фосфора растениям [18]. Увеличение концентрации K и Ca в растениях в загрязненных вариантах могло быть связано с возрастанием подвижности этих элементов в почве при внесении в почву высокой дозы Cu, а также значимым при этом уменьшением массы растений и возможным нарушением механизмов поглощения ими элементов. Внесение всех бактерий при загрязнении почвы Cu по сравнению с вариантом без бактериальных инокуляций в загрязненных условиях не оказало существенного влияния на содержание в вегетативных органах и корнях практически всех изученных биофильных элементов, за исключением достоверного увеличения этого показателя для K в обоих частях растений.

При загрязнении почвы Cu без применения бактерий установлено значительное уменьшение поглощения из почвы или накопления вегетативной массой и целыми растениями практически всех исследованных элементов, за исключением Ca и K, для которых этот показатель не был подвергнут значительным изменениям (табл. 5). В корнях в условиях Cu-стресса без применения бактерий зафиксировано уменьшение накопления всех элементов. Внесение данных бактерий в загрязненных условиях значительно увеличило потребление всех биофильных элементов растениями в сравнении с вариантом загрязнения Сu без применения бактерий. Эта закономерность была обнаружена как для вегетативной массы, так и для корневой системы. Уменьшение токсического действия Cu и увеличение при этом биомассы инокулированных бактериями растений (табл. 1) несомненно было связано с увеличением потребления биофильных элементов растениями из почвы – улучшением их минерального питания. В нашем исследовании бактерии не обеспечили увеличения потребления питательных элементов загрязненными металлом растениями до уровня в контрольном варианте. Следует отметить, что в корнях во всех вариантах опыта накапливалось примерно на порядок больше Fe, чем в вегетативной массе, что, вероятно, было обусловлено биологическими особенностями яровой пшеницы. Аналогичная закономерность была ранее установлена для этой культуры в фазе трубкования [7]. Увеличение потребления биофильных элементов растениями из загрязненной почвы при внесении всех бактерий происходило без существенных изменений в растениях содержаний в целом практически всех биофильных элементов вследствие стимуляции роста растений и увеличения растительной биомассы. Стимуляция роста растений под влиянием бактерий рода Pseudomonas происходит в том числе вследствие продуцирования ими физиологически активных веществ – фитогормонов, в частности, индолилуксусной кислоты [19], что также было обнаружено нами в предыдущих исследованиях [20].

 

Таблица 5. Потребление биофильных элементов растениями в фазе трубкования

Вариант	N	P	K	Ca	Mg	Fe	Mn	Zn
	мг/cосуд				мкг/сосуд
Вегетативная масса
Без Cu и внесения бактерий – контроль	112	14	100	24	715	300	143	88
Cu без внесения бактерий	78	8	90	25	522	213	115	52
Cu + P. fluorescens 20	93	9	115	28	626	260	132	58
Cu + P. fluorescens 21	96	10	114	28	638	251	132	64
Cu + P. putida 23	94	9	113	28	629	245	126	58
НСР05	12	1	20	3	89	30	10	6
Корни
Без Cu и внесения бактерий – контроль	17	3	11	7	311	3580	114	54
Cu без внесения бактерий	9	1	5	6	226	2050	72	29
Cu + P. fluorescens 20	11	2	7	8	310	3000	101	38
Cu + P. fluorescens 21	11	2	7	7	284	2700	96	35
Cu + P. putida 23	12	2	7	8	255	2910	96	39
НСР05	2	1	1	1	25	512	17	7
Целое растение
Без Cu и внесения бактерий – контроль	129	17	111	31	1070	3880	257	142
Cu без внесения бактерий	87	9	95	31	748	2260	187	81
Cu + P. fluorescens 20	104	11	122	36	936	3260	233	96
Cu + P. fluorescens 21	107	12	121	35	922	2950	228	99
Cu + P. putida 23	108	11	120	35	884	3150	222	97
НСР05	14	2	15	4	110	460	34	13

 

При загрязнении почвы Cu в вариантах с внесением бактерий после удаления растений в фазе трубкования по сравнению с вариантом с загрязнением почвы без внесения бактерий не установлено значимых изменений реакции почвенной среды (табл. 6), которая, как известно, оказывает значительное влияние на подвижность химических элементов в почве.

 

Таблица 6. Реакция почвенной среды после выращивания растений (фаза трубкования)

Вариант	pHKCI почвенной суспензии
Без Cu и внесения бактерий – контроль	6.14 ± 0.02
Cu без внесения бактерий	6.17 ± 0.02
Cu + P. fluorescens 20	6.19 ± 0.07
Cu + P. fluorescens 21	6.14 ± 0.07
Cu + P. putida 23	6.20 ± 0.05

Примечание. Средние 4-х повторностей опыта ± отклонение от среднего.

 

Загрязнение почвы Сu без бактериальных инокуляций также не оказывало значимого влияния на данный показатель. Следовательно, увеличение аккумуляции Сu в растениях – усиление фитоэкстракции под влиянием бактерий – происходило без существенных изменений реакции почвенной среды и, вероятно, было обусловлено продуцируемыми бактериями органическими экзометаболитами – сидерофорами, свойственными флуоресцирующим видам Pseudomonas [14, 19, 21]. Увеличение поступления Cu в растения при внесении ризосферных бактерий, вероятно, было связано с увеличением биодоступности металла в почве вследствие образования бактериальных сидерофоров.

ВЫВОДЫ

1. Внесение ростостимулирующих ризосферных бактерий P. fluorescens 20, P. fluorescens 21 и P. putida 23 в искусственно загрязненную Cu агросерую почву в дозе 300 мг/кг почвы уменьшило фитотоксичность Cu в фазе трубкования, стимулировало рост растений яровой пшеницы и увеличило массу вегетативных органов и корней. Применение бактерий не устраняло полностью токсическое действие на растения металла, внесенного в повышенной концентрации.
2. Внесение бактерий в загрязненную Cu почву значительно увеличило потребление, или вынос, металла вегетативной массой растений из почвы – усилило фитоэкстракцию в максимальной степени при применении P. fluorescens 21. Загрязнение почвы Cu вне зависимости от бактерий увеличило концентрацию металла в вегетативной массе растений.
3. Повышение устойчивости растений к токсическому действию Cu при внесении бактерий было обусловлено улучшением минерального питания растений – увеличением потребления вегетативной массой и корневой системой из загрязненной почвы макроэлементов N, P, K, Ca и Mg, Fe и микроэлементов Mn и Zn и содержания и накопления Cu в корнях. Это свидетельствовало об ответной протекторной реакции растений на загрязнение почвы Cu.
4. Увеличение потребления изученных биофильных элементов растениями яровой пшеницы из загрязненной почвы при внесении бактерий происходило вследствие стимуляции роста и увеличения растительной биомассы, без существенных изменений в целом содержаний практически всех элементов в растениях, за исключением содержания К.
5. Загрязнение почвы Cu без внесения бактерий уменьшило потребление растениями большинства биофильных элементов и ингибировало рост растений.
6. Внесение бактерий в загрязненных условиях не сопровождалось значимыми изменениями реакции почвенной среды.

Авторы благодарят ЦКП ИФХиБПП РАН за выполнение химических анализов почвы.

Об авторах

В. П. Шабаев

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vpsh@rambler.ru
Россия, 142290 Пущино Московская обл., ул. Институтская, 2

В. Е. Остроумов

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Email: vpsh@rambler.ru
Россия, 142290 Пущино Московская обл., ул. Институтская, 2

Список литературы

Дополнительные файлы