Альфа- и бета-экспансины, экспрессирующиеся в различных зонах растущего корня кукурузы1

Full Text

Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: 10.31857/S0015330324020043

ВВЕДЕНИЕ

Современные представления о механизмах роста растяжением клеток растений – важнейшего морфогенетического процесса в развитии растительного организма – рассматривают в качестве ключевых молекулярных игроков экспансины – белки клеточной стенки, которые за счет непонятного пока механизма способны увеличивать растяжимость клеточной стенки [1]. Так, при локальной индукции в апикальной меристеме гена экспансина происходит увеличение растяжимости ткани в месте воздействия, изменение филлотаксиса и формирование нового листа в “неположенном” месте [2]. Известно также, что некоторые альфа-экспансины особенно активно экспрессируются в тех органах и тканях, которые приступают к активному росту [3]. Множество других примеров участия отдельных изоформ экспансинов в морфогенезе растений могут быть найдены в недавнем обзоре M. Samalova с соавт. [4]. При этом у экспансинов не выявлена гидролитическая активность; они не изменяют ковалентную структуру полимеров и, как правило, не снижают прочность клеточной стенки [1, 5].

Экспансины – низкомолекулярные (около 27 кДа) белки – кодируются в геномах различных растений большими мультигенными семействами, насчитывающими многие десятки генов, и подразделяются на два основных подсемейства – альфа- и бета-экспансины, которые обозначаются, соответственно, EXPA и EXPB, а также менее представленные экспансин-подобные белки – EXLA и EXLB [6, 7]. Оба основных подсемейства представлены во всех проанализированных таксонах наземных растений; бета-экспансины получили особое распространение у злаков [8]. Часть бета-экспансинов известна как аллергены пыльцы злаков; они исключительно высоко экспрессируются и могут составлять 0.1% от сухой массы пыльцы или 4% всего экстрагируемого белка [9]. Другие экспансины присутствуют в клеточной стенке в очень низких количествах; приводятся величины порядка 0.02% от сухой массы клеточной стенки, что в молодых тканях, анализировавшихся в указанной работе, должно составлять тысячные доли процента от общей сухой массы [5].

Экспансины – единственные белковые агенты, способные за секунды увеличивать растяжимость растительных тканей [10]. Более того, эти белки также способны увеличивать растяжимость фильтровальной бумаги – целлюлозного материала, далекого от состояния in planta [5]. Считается, что воздействие экспансинов происходит в “горячих точках” – местах, где микрофибриллы целлюлозы находятся в тесном контакте друг с другом, формируя тем самым несущий каркас растительной клеточной стенки [11]. Однако действие экспансинов в клеточной стенке обычно связывают не только с микрофибриллами целлюлозы, но и с конкретными полисахаридами матрикса. В частности, установлено, что действие альфа-экспансинов усиливается при наличии ксилоглюкана [12]. Показано, что бета-экспансины взаимодействуют с глюкуроноарабиноксиланом [13]. При этом, остаются неясными не только непосредственные механизмы действия экспансинов, но и сопряженные вопросы о том, почему экспансинов так много, и с чем связана их выраженная дифференциальная экспрессия.

Появление различных омиксных технологий позволяет провести всеобъемлющий анализ экспрессии генов экспансинов в физиологически отличающихся растительных тканях, а также выявить и оценить особенности связывания альфа- и бета-экспансинов с разнообразными полисахаридами клеточных стенок. Для масштабной характеристики экспрессирующихся экспансинов мы использовали модельную систему первичного корня кукурузы, в котором были выделены пять различных зон, содержащих клетки на последовательных стадиях развития [14, 15]. Для каждой из зон ранее охарактеризованы механические свойства клеточных стенок и набор полисахаридов, а также проанализирована экспрессия генов гликозилтрансфераз и гликозидгидролаз, обеспечивающих формирование и модификацию полисахаридного ансамбля в ходе развития [15–17]. Для изучения способности альфа- и бета-экспансинов к связыванию с компонентами клеточных стенок использован недавно сконструированный нами полисахаридный гликоэррей [18]. Этот подход позволил нам продемонстрировать, что экспансины могут связываться с рамногалактуронанами I и арабиногалактанами, и что разные экпансины отличаются по наборам полисахаридов-мишеней. Совокупность полученных данных позволила выдвинуть гипотезу, что многочисленность изоформ экспансинов в одном растительном организме и тонкая регуляция их экспрессии может быть обусловлена спецификой связывания индивидуальных экспансинов с конкретными полисахаридами клеточной стенки, набор которых в свою очередь отличается в разных органах и тканях, а также на разных стадиях развития клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Исследования проводили на корнях 5-дневных проростков кукурузы (Zea mays L.), сорт Машук (Нива Татарстана, Казань, Россия), выращенных в темноте при 27°С. Первичный корень проростка был разделен лезвием на зоны по следующей схеме: корневой чехлик, меристема (0–1 мм, считая от соединения корня с чехликом), зона раннего растяжения (1–2 мм), активного растяжения (2–6 мм) и позднего растяжения (7–10 мм) (рис. 1). Распределение зон соответствует опубликованным ранее работам Kozlova с соавт. [15, 19] и дополнительно верифицировано путем измерения длин клеток коры и ризодермы.

 

Рис. 1. Схема деления кончика первичного корня 5-дневного проростка кукурузы на зоны для анализа транскриптомов. Точками покрыты зоны корня, которые не использовались для анализа.

 

Идентификация генов, кодирующих экспансины, и их филогенетический анализ. Гены экспансинов кукурузы были найдены в базе данных EnsemblPlants (http://plants.ensembl.org/index.html) (дата доступа 20 ноября 2019 г.) и определены по наличию в последовательностях соответствующих белков одновременно двух Pfam доменов (http://pfam.xfam.org/): N-концевого домена DPBB (PF03330) и С-концевого бета-сэндвич домена CBM63 (PF01357) [20–22]. Гены экспансинов риса (Oryza sativa L., японская группа) и резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), использованные для сопоставления, были найдены в базе данных Phytozome12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) (дата доступа 20 ноября 2019 г.) также по наличию двух доменов, характерных для экспансинов [23].

Аминокислотные последовательности, кодируемые выявленными генами экспансинов, подвергали множественному выравниванию алгоритмом Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) [24]. Полученное выравнивание подвергли филогенетическому анализу методом максимального подобия в программе IQ-TREE 1.6.9 [25]. Расчет наиболее подходящей модели эволюции последовательности выполнялся с помощью функции ModelFinder (IQTREE 1.6.9) [26]. Наиболее подходящая модель имела самое низкое значение байесовского информационного критерия. Статистическая достоверность выделения ветвей была рассчитана с помощью алгоритма сверхбыстрой аппроксимации филогенетического бутстрепа с использованием 10000 повторов [27]. Дендрограмма была визуализирована с помощью веб-сервиса iTOL 5.3 (https://itol.embl.de/), затем отредактирована в графическом редакторе Adobe Illustrator CC 2017 (“Adobe Systems”, США) [28].

Транскриптомный анализ экспрессии генов экспансинов в различных зонах растущего корня кукурузы. Библиотеки мРНК из пяти зон первичного корня кукурузы в четырех повторностях каждая были секвенированы с использованием платформы Illumina NovaSeq 6000 в режиме парноконцевого прочтения с длиной рида 150 нуклеотидов на базе Novogene Corporation (Китай, https://en.novogene.com/) и размещены в системе SRA (Sequence Read Archive) в виде данных BioProject с идентификатором PRJNA639682 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA639682). После контроля качества парных прочтений отфильтрованные пулы ридов (короткие последовательности ДНК) каждого образца были картированы на геном кукурузы (версия сборки генома кукурузы B73 RefGen_v4, загружена из базы данных Gramene (https://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index) с использованием программы HISAT2 v2.1 [29]. Для подсчета количества прочтений, выравненных на каждый ген, использовали алгоритм Stringtie v2.0 [30]. Нормализацию значений уровня экспрессии генов проводили с использованием пакета DESeq2 в программной среде R (https://www.R-project.org/) [31]. Ген считался экспрессируемым, если среднее (по повторностям) нормализованное значение TGR (total gene reads; общее число прочтений, приходящихся на ген) хотя бы в одном образце было больше или равнялось 16, в соответствии с рекомендациями [32].

Рекомбинантные экспансины, использованные для оценки их связывания с полисахаридами клеточных стенок с помощью гликоэрреев и твердофазного иммуноферментного анализа. Для сопоставления характера связывания альфа- и бета-экспансинов с полисахаридами клеточной стенки использовали коммерчески доступные рекомбинантные белки Arabidopsis thaliana (“MyBioSource”, США): MBS1412737 – Expansin-A1 (EXPA1) как альфа-экспансин и MBS1443426 – Expansin-B1 (EXPB1) как бета-экспансин. Использованный для анализа альфа-экспансин (UniProt# Q9C554, TAIR# At1g69530, мол. массой 26518 Да) экспрессирован в дрожжах, имеет 10xHis-tag на N-конце и Myc-tag на С-конце; бета экспансин (UniProt# Q9SKU2, TAIR# At2g20750, MW 29108 Da) экспрессирован в E. coli, имеет 6xHis-tag на N-конце. При дальнейшем изложении в статье они обозначаются соответственно AtEXPA1 и AtEXPB1.

Для проверки чистоты препаратов проводили электрофорез на 12% полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом с антителами мыши, узнающими гистидиновую метку (“Bio Rad”, США) (разведение 1 : 5000), и антителами козы, конъюгированными с пероксидазой хрена и узнающими иммуноглобулины мыши (“Аbcam”, Великобритания) (разведение 1 : 10000). Визуализация полос осуществлялась за счет окисления пероксидазой хемилюминесцентного субстрата люминола в присутствии перекиси и кумаровой кислоты. Результирующая хемилюминесценция детектировалась в системе визуализации ChemiDoc (“Bio Rad”, США).

Гликоэррей для характеристики связывания экспансинов с полисахаридами клеточной стенки растений. Гликоэррей, содержащий 183 полисахарида клеточных стенок растений, а также 29 моно- и олигосахаридов – компонентов использованных полисахаридов и/или типичных лигандов известных растительных лектинов, был напечатан в формате гликочипа как описано у А. Никифоровой с соавт. [18] c использованием эпокси-активированных слайдов СЕМИГЛАС-Эпокси (“Семиотик”, Россия). Каждый лиганд был напечатан в 9 повторах. Полный список лигандов и их характеристика приведены в Дополнительных материалах (Дополнительные материалы, табл. S1). Гликочипы инкубировали в буфере для блокировки (50 мМ этаноламина (“Sigma-Aldrich”, США), 150 мМ борной кислоты (“Люми”, Россия, https://lumi.spb.ru), 0.2% ( об/ об) Tween 20 (“Sigma-Aldrich”, США), pH 8.5) в течение 120 мин при постоянном помешивании при комнатной температуре, после чего два раза промывали фосфатно-солевым буфером (“Эко-Сервис”, Россия), содержащим 0.05% (об/об) Tween 20 (ФСБ – 0.05%). Далее на чипы наносили 1 мл раствора AtEXPA1 или AtEXPВ1 с концентрацией 30 мкг/мл в ФСБ – 0.1% и инкубировали 16 ч при 4°С и повышенной влажности. Далее промывали, как описано выше. Затем наносили раствор антител мыши, узнающих His-tag, меченых флуоресцентной меткой Аlexa 647 (JacksonImmunoResearch, США), в разведении 1 : 400 в ФСБ – 0.1% и инкубировали 1 ч при 37°С и повышенной влажности. Гликоэрреи промывали два раза ФСБ – 0.05% и на конечном этапе – в бидистиллированной воде, а затем высушивали чипы центрифугированием и сканировали (разрешение – 10 мкм) с помощью флуоресцентного ридера InnoScan 1100 AL (“Innopsys”, Франция). Полученные изображения преобразовывали в таблицу Excel с помощью программного обеспечения ScanArray Express 4.0 (“Perkin-Elmer”, США) с использованием метода подстраивающихся колец и GAL-файла. Результаты представляли в виде медианы (по 9 повторам) относительных единиц флуоресценции (RFU), отражающей аффинность и количество углевод-связывающих белков. Сигналы, величины которых были ниже 10% от максимального значения RFU, не рассматривали.

Планшетный твердофазный анализ (пТФА) для ингибиторного анализа связывания отдельных полисахаридов с экспансинами. В лунки 96-луночного планшета вносили по 100 мкл раствора полисахарида № 15106, показавшего в анализе с использованием гликоэррея высокий уровень связывания и с альфа-, и с бета-экспансинами, 1 мкг/мл в Na-карбонатном буфере (pH 9.6) и инкубировали в течение ночи при 4°С, после чего блокировали их 1% бычьим сывороточным альбумином, BSA (“Sigma-Aldrich”, США) в 10 мМ Tris-HCl (“Хеликон”, Россия) рН 7.4 в течение 1 ч при 37°С и промывали трижды 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, содержащем 0.05% Tween20 (“ICN”, США). Затем в лунки вносили 50 мкл раствора ингибиторов – полисахаридов, отобранных по результатам гликоэррея, а также на основе литературных данных (полисахариды №№15106, 15148, 15058, 15090 и 15165 согласно нумерации в Дополнительных материалах и ранее опубликованной статье, их характеристика дается при изложении результатов) в двукратном разведении в диапазоне от 20 до 0.3 мкг/мл в 0.1 M фосфатно-цитратном буфере, рН 5.0 и прибавляли туда 50 мкл раствора AtEXPA1 или AtEXPB1 в том же буфере, до конечной концентрации 10 мкг/мл, и инкубировали 1 ч при 37°С и промывали [18]. Затем в лунки планшета вносили 100 мкл раствора анти-His-tag-антител мыши в разведении 1 : 5000 в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, содержащем 0.3% BSA, инкубировали 1 ч при 37°С и промывали как описано выше. После чего прибавляли 100 мкл раствора антител козы, узнающих иммуноглобулины мыши, меченые пероксидазой хрена, в разведении 1 : 7000 в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4, содержащем 0.3% BSA, инкубировали 1 ч при 37°С и промывали. Затем в лунки вносили по 100 мкл 0.04% о-фенилендиамина (“Sigma-Aldrich”, США) и 0.03% H₂O₂ в 0.1 M фосфатно-цитратном буфере, рН 5.0 и останавливали реакцию путем добавления в каждую лунку 50 мкл 1 М раствора H₂SO₄ в воде. Поглощение считывали при 492 нм с помощью планшетного ридера Wallac 1420 Victor 2 (“PerkinElmer”, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация генов экспансинов кукурузы и филогенетический анализ последовательностей соответствующих белков. В геноме кукурузы выявлен 91 ген экспансинов – существенно больше, чем в геномах A. thaliana (35 генов) и риса (55 генов). Среди них 45 генов относятся к альфа-экспансинам, 43 гена – к бета-экспансинам и 3 гена представляют собой альфа-экспансин-подобные белки; генов бета-экспансин-подобных белков в геноме кукурузы не выявлено. Количество бета-экспансинов у кукурузы (43) значительно превышает количество бета-экспансинов (6) и бета-экспансин-подобных белков (3) у A. thaliana, вместе взятых. Филогененетический анализ позволил подразделить выявленные последовательности экспансинов кукурузы на подсемейства и клады и соотнести их с таковыми у риса и A. thaliana (рис. 2).

 

Рис. 2. Филогенетическое древо экспансинов кукурузы (Zea mays), резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) и риса (Oryza sativa). Наименования экспансинов, гены которых экспрессируются в корне кукурузы, обозначены на древе черным шрифтом, а те, гены которых не экспрессируются (TGR < 16 во всех образцах) – серым шрифтом. Для резуховидки Таля дополнительно указаны названия экспансинов, предложенные Kende с соавт. [6], для риса – согласно Choi с соавт. [33]. Круглыми скобками и римскими цифрами указаны выделенные нами клады для альфа- и бета-экспансинов кукурузы. Арабскими цифрами указаны индексы сверхбыстрой аппроксимации филогенетического бутстрепа.

 

На филогенетическом древе экспансинов четко выделялись различные клады, которые обозначены римскими цифрами (рис. 2): альфа-экспансины кукурузы подразделены нами на 14 основных клад, а бета-экспансины – на 5. В каждой кладе альфа-экспансинов кукурузы присутствовали также альфа-экспансины риса, а подобные белки A. thaliana отсутствовали почти в половине клад (I–V, XIV). Для бета-экспансинов кукурузы характерна большая специфичность: в I–III кладах отсутствовали гомологи из A. thaliana, а I и II клады бета-экспансинов кукурузы хорошо отделялись и от генов риса (рис. 2).

Экспрессия генов экспансинов в различных зонах растущего корня кукурузы. Из 91 гена экспансинов кукурузы в корне экспрессировались 67, причем практически все они имели ярко выраженный дифференциальный характер экспрессии в различных зонах корня, отличающихся по стадии развития клеток (рис. 3). Гены экспансинов, занимающие на древе одну кладу, часто имели сходную динамику количества транскриптов по зонам растягивающегося корня (рис. 3). Например, содержание транскриптов практически всех экспрессирующихся представителей клады IV бета-экспансинов, как и клады II альфа-экспансинов, были максимальными в зоне активного растяжения, в то время как транскрипты представителей клады V альфа-экспансинов кукурузы, не имеющих гомологов в A. thaliana (рис. 2), обнаруживались только в чехлике (рис. 3).

 

Рис. 3. Уровень транскриптов генов экспансинов, экспрессирующихся (TGR ≥ 16 хотя бы в одной зоне) в различных зонах корня проростка кукурузы. Гены отсортированы по подсемействам (EXPA – альфа-экспансины, EXPB – бета-экспансины, EXLA – альфа-экспансин-подобные белки), внутри подсемейств – по кладам (обозначены римскими цифрами и соответствуют филогенетическому древу на рис. 2), а внутри клад – по убыванию суммарных значений TGR во всех образцах. Тепловая карта экспрессии: левая панель – значения TGR; правая панель – относительный уровень экспрессии генов в процентах, где за 100% принято максимальное для каждого гена значение TGR. Чех – чехлик, Мер – меристема, рРаст – ранее растяжение, Раст – активное растяжение, пРаст – позднее растяжение.

 

В целом, количество транскриптов генов экпансинов было максимальным в зонах инициации растяжения и активного растяжения. Так, число генов со значениями TGR > 500 составляло 10–12 в чехлике и меристеме, возрастало до 18–22 в зонах начала и активного растяжения, а в зоне позднего растяжения падало до 6 (рис. 3). Еще нагляднее эта закономерность выявляется при оценке суммарного содержания транскриптов всех высокоэкспрессирующихся (TGR > 500) генов экспансинов в каждой зоне: в зонах начала и активного роста растяжением, где скорость роста клеток наибольшая, этот показатель в 3–8 раз выше, чем в других зонах (рис. 3). Наиболее высокие значения содержания транскриптов отмечены для генов бета-экспансинов Zm00001d029899 и Zm00001d019560 (клады III и IV соответственно), у которых максимумы приходились, соответственно, на зоны начала растяжения и активного растяжения; среди альфа-экспансинов наибольший уровень транскриптов был отмечен для Zm00001d025018 с пиком значений в зоне начала растяжения (рис. 3).

Обращает на себя внимание, что гены, число транскриптов которых резко увеличивалось в зоне начала растяжения по сравнению с чехликом и меристемой, затем часто характеризовались снижением числа транскриптов в зоне наиболее активного роста; например, гены Zm00001d029899, Zm00001d025018 и Zm00001d038476 (рис. 3). При этом в активно растущих клетках был отмечен максимально высокий уровень транскриптов другого ряда генов, чьи транскрипты были слабо представлены на более ранних стадиях развития клеток, включая начало растяжения. К числу таких генов относились, например, Zm00001d019560, Zm00001d029903 и Zm00001d032883. Таким образом, наборы генов экспансинов, активно транскрибируемых при индукции роста растяжением и при его наибольших скоростях, существенно различаются (рис. 3). Эта закономерность имеет более общий характер: для большинства генов экспансинов характерен узкий диапазон зон с максимальным уровнем транскриптов. Так, значения TGR близкие или равные 100% чаще всего наблюдали в одной зоне, иногда в двух, но не более (рис. 3). Следует отметить, что клеточные стенки в различных зонах корня отличаются по набору полисахаридов и механическим свойствам [15, 16].

Ряд генов экспансинов – Zm00001d027717, Zm00001d040379, Zm00001d026014 – характеризовался наибольшим уровнем транскриптов в меристематичекой зоне; все эти гены кодируют альфа-экспансины (рис. 3). Транскрипты генов значительной части и альфа-, и бета-экспансинов были максимально представлены в чехлике, хотя уровень значений TGR был невысок (рис. 3).

Несмотря на резкое снижение при замедле нии роста растяжением общей экспрессии генов, кодирующих экспансины (рис. 3), несколько генов имели в этой зоне максимальную для них представленность транскриптов: Zm00001d029906, Zm00001d034663, Zm00001d029913. Аналогичный паттерн был характерен и для всех трех генов альфа-экспансин-подобных белков, в частности, для Zm00001d027520 (рис. 3).

Примечательно, что не экспрессирующиеся в растущем корне кукурузы гены экспансинов собираются на древе в группы. Например, клады I и II бета-экспансинов и одна из частей обширной клады IV, а также клад XI и XIV альфа-экспансинов (рис. 2). При этом к не экспрессирующимся в корне относился ген ранее охарактеризованного белка ZmEXPB1 (Zm00001d047147) из клады I, которым исключительно богата пыльца кукурузы [34], а также все его ближайшие гомологи (рис. 2).

Сопоставление способностей альфа- и бета-экспансинов связываться с различными полисахаридами клеточной стенки. Для сопоставления способностей альфа- и бета-экспансинов связываться с различными полисахаридами клеточной стенки использовали сконструированный ранее гликоэррей в расширенной версии (Дополнительные материалы, табл. S1) [18]. В качестве альфа- и бета-экспансинов использовали коммерческие рекомбинантные белки AtEXPA1 и AtEXPB1. Электрофорез белков с последующим иммуноблоттиногом с антителами на гистидиновую метку продемонстрировал высокую чистоту препаратов (рис. 4).

 

Рис. 4. Оценка чистоты рекомбинантных экспансинов с помощью электрофореза (Гель) с последующим иммуноблоттиногом (Блот) с антителами на гистидиновую метку.

 

Полисахариды, нанесенные на гликоэррей, представлены, в основном, разнообразными пектиновыми веществами из различных источников, а также некоторыми гемицеллюлозами. В соответствии с характерными элементами структуры, все полисахариды подразделены на девять групп (рис. 5). Если использовать пороговую величину в 10% от максимальной для отсечки полисахаридов, не продемонстрировавших взаимодействия, AtEXPA1 взаимодействовал с 85, а AtEXPB1 – с 15 из 183 полисахаридов гликоэррея. Ни один из 29 низкомолекулярных углеводов гликоэррея не показал значимого связывания ни с одним из проанализированных экспансинов (Дополнительные материалы, табл. S1).

 

Рис. 5. Взаимодействия рекомбинантных альфа- и бета-экспансинов (AtEXPA1 и AtEXPB1) с полисахаридами растительной клеточной стенки, входящими в состав гликоэррея. Представлено по пять полисахаридов с максимальным уровнем взаимодействия для каждой из 9 групп полисахаридов, существенно различающихся по моносахаридному составу. Для сопоставления результатов отдельных экспериментов с AtEXPA1 и AtEXPB1 данные представлены в % от максимального значения RFU в каждом эксперименте (% норм RFU). Пороговой величиной для отсечки полисахаридов, не продемонстрировавших взаимодействия, считали 10% от максимально значения RFU (указано вертикальной пунктирной линией).

 

Для сопоставления результатов отдельных экспериментов с AtEXPA1 и AtEXPB1 данные представлены в % от максимального значения интенсивности сигнала (RFU) (рис. 5). Максимальные значения RFU в экспериментах с обоими экспансинами были сопоставимы и составляли порядка 8500 единиц (Дополнительные материалы, табл. S1). По результатам связывания с гликоэрреем, проанализированный альфа-экспансин AtEXPA1 взаимодействовал преимущественно с полисахаридами, содержащими Ara или Gal, либо оба моносахарида (т.е. с представителями групп 5–8), а также с полисахаридом из группы 9 – гемицеллюлозой из подсолнечника (рис. 5). Значительно слабее он связывался с рамногалактуронанами с невысокой представленностью боковых цепей (группа 4) и с гомогалактуронанами (группы 1–3). При этом, карбоксильные группы значительной части представленных гомогалактуронанов не были этерифицированы метильными группами (определено для образцов 15011, 15084, 15087, 15088, 15131, 15134).

Максимальное взаимодействие с альфа-экспансином отмечено для полисахаридов 15058 и 15106 (рис. 5). Образец 15058 – арабиногалактан из камеди акации (Acacia sp.), имеющий моносахаридный состав Ara 32%, Gal 46%, Rha 11%, GalA 3%, GlcA 8% (Дополнительные материалы, табл. S1). Образец 15106 – арабиногалактан из зелени пихты сибирской (Abies sibirica Ldb.) (Ara 29%, Gal 33%, Rha 2%, UA 30%, белок 8%). Арабиногалактаны обоих образцов относятся ко II типу, в котором остатки галактозы присутствуют в виде 1,3- и 1,6-β-d-Galp, а не 1,4-β-d-Galp, как у арабиногалактанов I типа. Основная высокоразветвленная цепь в полисахаридах 15058 и 15106 состоит из 1,3-β-d-Galp. Боковые цепи преимущественно представлены остатками 1,6-β-d-Galp, присоединенными к главной углеводной цепи по О-6 положению. В качестве терминальных остатков на концах галактановых цепей могут располагаться α-l-Araf, β-l-Arap, α-l-Rhap, β-d-GlcpA и 4-O-метил-β-d-GlcpA [35].

С полисахаридом 15106 активно взаимодействовал и бета-экспансин, AtEXPB1, для которого наиболее выраженным было связывание с полимерами из группы 4, в частности, с полисахаридом 15090 (GalA 57%, Rha 26%, Gal 9%, Ara 3%), выделенным из листьев березы пушистой (Betula alba L.). Главным компонентом этого образца является рамногалактуронан I с остатками Rhap замещенными по О-4 единичными остатками d-Galp [36].

AtEXPB1 взаимодействовал с полисахаридами, имеющими в своем составе рамногалактуронан I (группы 3 и 4), Ara и Gal (группы 5–7), а также с гемицеллюлозой 15180 (группа 9) из подсолнечника, которая, судя по моносахаридному составу (GalA 13%, GlcA < 1%, Rha 4%, Ara 13%, Xyl 63%, Glc 2%, Gal 5%), является глюкуроноарабиноксиланом; этот полимер взаимодействовал и с AtEXPA1 (рис. 5). Из полисахаридов этой группы взаимодействие с экспансином AtEXPA1 продемонстрировал также образец 15051 из сахарной свеклы с высокой долей глюкозы (UA 3%, Rha 3%, Ara 26%, Glc 54%, Gal 13%) (рис. 5). Этот образец не окрашивался йодом (данные не приведены), т. е. не содержал примеси крахмала – альфа-глюкана, не присутствующего в клеточной стенке. Пограничное значение по интенсивности взаимодействия с AtEXPA1 было выявлено для глюкуроноксилана 15191 из древесины бука (Fagus sp. L.) (GalA 1%, GlcA < 1%, Xyl 97%, Gal 2%). Остальные гемицеллюлозы гликоэррея, включая галактоманнан из камеди рожкового дерева (Ceratonia siliqua) (15153) (UA 6%, Gal 20%, Man 74%), ксилоглюкан из семян тамаринда (Tamarindus indica) (15148) (UA 7%, Ara 2%, Xyl 31%, Glc 45%, Gal 15%) и бета-глюкан со смешанным типом связи из ячменя (Hordeum sp.) (15116) (Ara 1%, Xyl 2%, Glc 97%), не показали значимого связывания (Дополнительные материалы, табл. S1).

Чтобы подтвердить специфичность взаимодействия экспансинов с полисахаридами был проведен планшетный твердофазный анализ (пТФА) в ингибиторном варианте. В качестве основного (для нанесения на подложку) взяли полисахарид 15106 (группа 5, арабиногалактан из зелени пихты сибирской), имеющий, по данным гликоэррея, высокий сигнал как для AtEXPA1, так и для AtEXPB1 (рис. 5). Взаимодействие исследуемых белков с полисахаридом 15106 было оценено в прямом пТФА в диапазоне концентраций полисахарида 0.07–5.00 мкг/мл (данные не показаны), и в качестве оптимальной была выбрана концентрация 1 мкг/мл.

По результатам ингибиторного анализа взаимодействие альфа- и бета-экспансинов с полисахаридом 15106 было подтверждено – концентрация 50% ингибирования (IC50) составила 0.80 и 0.65 мкг/мл соответственно (рис. 6). В качестве ингибиторов, помимо самого образца 15106, были выбраны охарактеризованные выше полисахариды 15058 (арабиногалактан акации) и 15090 (пектин березы пушистой), принадлежащие к разным группам и продемонстрировавшие разную интенсивность взаимодействия с экспансинами на чипе. Также был взят ксилоглюкан из тамаринда (образец 15148, группа 9), т.к. считается, что основными мишенями альфа-экспансинов могут быть участки тесного взаимодействия ксилоглюкана и микрофибрилл целлюлозы [1]. По результатам гликоэррея этот полисахарид значимого связывания не продемонстрировал и не вошел в топ-5 своей группы (рис. 5). В качестве отрицательного контроля был взят фруктан из цикория (15165) – растительный полисахарид, не локализующийся в клеточной стенке.

 

Рис. 6. Ингибирование взаимодействия экспансинов AtEXPA1 (а) и AtEXPB1 (б) с полисахаридом 15106 (арабиногалактан из зелени пихты, концентрация 1 мкг/мл) с помощью различных полисахаридов (15106, 15058, 15148, 15090, 15165, описание в тексте) по результатам планшетного твердофазного анализа. Концентрация экспансинов: 10 мкг/ мл.

 

Для AtEXPA1 слабое ингибиторное действие в отношении связывания с образцом 15106 оказывал арабиногалактан 15058 из акации, а остальные в используемом диапазоне концентраций не ингибировали взаимодействие этого экспансина с образцом 15106. Для AtEXPB1 ингибирующее действие оказывал пектин с преобладанием рамногалактуронана I из березы (15090, IC50 = 3 мкг/мл), а ксилоглюкан из тамаринда (15148) оказывал лишь слабое ингибирующее действие. Фруктан из цикория (15165) ожидаемо не оказывал действия ни на альфа-экспансин, ни на бета-экспансин. В целом, данные ингибиторного анализа подтверждают результаты, полученные с использованием гликоэррея, включая демонстрацию взаимодействия и особенностей связывания, использованных альфа- и бета-экспансинов с ранее широко не обсуждаемыми вариантами полисахаридов растительной клеточной стенки (рамногалактуронаны I и арабиногалактаны). Интересным отличием бета-экспансина служит значительно более узкий спектр связываемых гликанов по сравнению с таковым у альфа-экспансина. Это может свидетельствовать о большей специфичности этого белка.

ОБСУЖДЕНИЕ

Экспансины способны связываться с различными полисахаридами матрикса. Механизм действия экспансинов на растяжимость клеточной стенки связывают с модификацией сети из микрофибрилл целлюлозы [1]. Эти белки за секунды способны увеличивать растяжимость даже фильтровальной бумаги, которая представляет собой почти чистую целлюлозу, однако их действие усиливается в присутствии некоторых полисахаридов матрикса [5, 12]. Поскольку ключевыми элементами, необходимыми для роста растяжением, обычно считаются ксилоглюкан и, в случае злаков, глюкуроноарабиноксилан, именно эти полисахариды, в основном, тестировались на взаимодействие с экспансинами. Большинство подобных исследований проводилось с использованием ограниченного набора экспансинов и полисахаридов. Например, связывание бета-экспансина кукурузы ZmEXPB1 с несколькими коммерческими гемицеллюлозами оценивалось по уменьшению количества белка в супернатанте после выдерживания в растворе экспансина нитроцеллюлозной мембраны с нанесенным полисахаридом [34]. Так было продемонстрировано преимущественное связывание ZmEXPB1 с ксиланами, практическое отсутствие взаимодействия для глюкана со смешанным типом связей и глюкоманнана и промежуточные значения для ксилоглюкана; другие полисахариды при этом не тестировались [34]. Выводы о том, что действие альфа-экспансинов опосредовано ксилоглюканом, сделаны также на основании увеличения растяжимости различных образцов на основе целлюлозы при наличии в них ксилоглюкана и значительно меньшего эффекта, или его отсутствия для других гемицеллюлоз [12]. Дополнительным аргументом служит то, что мутант резуховидки Таля xxt1/xxt2, не имеющий детектируемого ксилоглюкана, характеризуется меньшими размерами растений по сравнению с диким типом. Предполагается, что это может быть связано с меньшей чувствительностью клеточных стенок этого мутанта к действию альфа-экспансинов [37].

Нами с использованием гликоэрреев осуществлен анализ связывания широкого набора полисахаридов клеточной стенки с двумя экспансинами. Гликоэррей – ключевой элемент омиксной технологии, позволяющей оценивать взаимодействие гликанов с различными лигандами [18, 38, 39]. Этот инструментарий, сформированный для изучения углевод-связывающих белков, содержит, как правило, олигомеры, присутствующие в гликозилированных белках, и чаще всего нацелен на изучение специфичности лектинов и антител [39, 40]. Однако даже широкая совокупность олигомеров не может отражать ни разнообразия возможных эпитопов в полисахаридах растительной клеточной стенки, ни, тем более, их пространственной организации в составе полимера. Гликоэрреи, содержащие полисахариды клеточной стенки растений, крайне немногочисленны, хотя отмечается их значительный потенциал в решении многих вопросов [38]. Так, гликоэрреи, содержащие 50 отдельных полисахаридов и более многокомпонентных фракций клеточной стенки, эффективно использовались для характеристики специфичности антител [41]. Для более широкого изучения углевод-связывающих белков, взаимодействующих с разнообразными гликанами клеточной стенки растений, нами был использован гликоэррей, содержащий около двух сотен полисахаридов, созданный как описано в работе [18]. Установлено, что экспансины способны связываться с широким набором полисахаридов, в первую очередь – с арабиногалактанами и рамногалактуронанами I (рис. 5). Эти результаты подтверждены и в опытах с планшетным твердофазным анализом (рис. 6). Связывание с кислыми полисахаридами клеточной стенки резуховидки Таля отмечалось и для бактериального экспансина EXLX1 при использовании твердотельного ЯМР; однако считалось, что оно не сказывается на активности экспансинов и не имеет существенной функциональной нагрузки [42].

Взаимодействие экспансинов, которые являются щелочными белками, с полисахаридами, содержащими уроновые кислоты, можно попытаться объяснить неспецифическим электростатическим притяжением [9]. Именно так объясняется взаимодействие пектинов с экспансинами, отмеченное в работе, где использовался экспансин-подобный рекомбинантный белок бактериального происхождения BsEXLX1, который напоминает по характеру своего действия альфа-экспансины, хотя и значительно уступает им по активности [43]. Кристаллографические исследования выявили в домене D2 бактериального экспансина поверхность, сформированную слабоконсервативными основными аминокислотами, которая отвечает за связывание экспансина с клеточной стенкой. Более того, именно взаимодействием с глюкуроновой кислотой обусловлено связывание глюкуроноарабиноксилана с бета-экспансином кукурузы EXPB1 (Zm00001d047147). Это убедительно продемонстрировано в исследовании, использовавшем ситуацию с исключительно большим накоплением этого бета-экспансина в пыльце кукурузы, где взаимодействие оценивалось in situ с применением особого варианта твердотельного ЯМР [13].

Действительно, и арабиногалактаны, и рамногалакуронаны I, продемонстрировавшие связывание с экспансинами в наших экспериментах, содержат уроновые кислоты (рис. 5). Однако выявленные с помощью гликоэррея взаимодействия вряд ли объясняются только наличием заряда: во-первых, не все пектиновые полисахариды взаимодействовали с экспансинами; связывание также не отмечено ни с одним из низкомолекулярных углеводов гликоэррея, несмотря на наличие в некоторых уроновых кислот (Дополнительные материалы, табл. S1). Во-вторых, “плотность” заряда не была пропорциональна интенсивности связывания, поскольку наибольшая величина взаимодействия характерна для арабиногалактанов и рамногалактуронанов I, в которых доля уроновых кислот многократно ниже, чем в гомогалактуронанах (рис. 5); последние, если и проявляли взаимодействие, то значительно более слабое, в том числе – при отсутствии этерификации карбоксилов (то есть “экранирования” заряда) метильными группами.

Анализируя состав представленных на гликоэррее полисахаридов (Дополнительные материалы, табл. S1), не удается выделить моно- или олигосахаридные элементы, которые присутствовали в гликанах, показавших взаимодействие с экспансинами, но отсутствовали в тех, которые не продемонстрировали связывания. В дальнейшем необходимы дополнительные исследования по определению характера взаимодействия и конкретных эпитопов, участвующих в связывании, однако очевидно, что два исследовавшихся экспансина отличаются по набору предпочтительных полисахаридов-мишеней. Сходные предположения высказывались на основе результатов моделирования различных изоформ экспансинов клубники и сосны, и проведения исследований по моделированию их взаимодействия с различными лигандами методом молекулярного докинга [44, 45].

Паттерн экспрессии различных генов экспансинов имеет параллели в характере распределения полисахаридов клеточной стенки по зонам корня. Гены многих альфа- и бета экспансинов имели четко выраженный дифференциальный характер экспрессии в различных зонах корня (рис. 3). Первичный корень представляет собой продуктивную модельную систему для исследования роста растяжением, поскольку в нем на основании расстояния от чехлика может быть выделено несколько зон, содержащих клетки на разных стадиях развития [14]. Омиксные технологии, включая транскриптомику и протеомику, были многократно использованы для анализа различных тканей растений кукурузы, однако в соответствии с задачами конкретных экспериментов, лишь отчасти реализовали преимущества этой модельной системы: зоны корня, которые использовались для анализов, были слишком крупными, или органы использовались целиком, что не позволяло делать выводы о молекулярных событиях, обуславливающих инициацию, реализацию и окончание роста растяжением [46, 47].

В серии наших экспериментов охарактеризовано формирование и функционирование клеточных стенок в различных зонах корня кукурузы [15–17], что дает возможность сопрячь эти данные с характером экспрессии различных генов экспансинов. Кукуруза, как и все злаки, имеет первичные клеточные стенки II типа, в которых преобладающими полисахаридами матрикса служат глюкуроноарабиноксилан и глюкан со смешанным типом связей [19, 48]. На ранних этапах развития клеток корня кукурузы выражено присутствие ксилоглюкана и пектиновых веществ – характерных компонентов клеточных стенок I типа [15–17]. Экспрессия генов ферментов биосинтеза некоторых пектиновых веществ имеет пик в зоне инициации растяжения клеток, а в ходе активного растяжения наиболее представленными становятся глюкуроноарабиноксилан и глюкан со смешанным типом связей [15]. Наборы генов экспансинов, активно транскрибируемых в меристематической зоне, при индукции роста растяжением и при его наибольших скоростях, существенно различаются (рис. 3). Например, среди представителей клады IX альфа-экспансинов кукурузы, некоторые характеризуются максимальным уровнем транскриптов в чехлике, некоторые – в меристеме, а некоторые – в зоне раннего растяжения (рис. 3). Эта клада включает гены кукурузы, гомологичные AtEXPA1 – наиболее полно охарактеризованного альфа-экспансина двудольных растений, а также гомологи AtEXPA10, 14 и 15, для которых недавно была показана стадия- и тканеспецифичная экспрессия в растущем корне резуховидки Таля [49] (рис. 2). Экспрессия этих генов на ранних этапах развития клеток корня кукурузы (рис. 3) соотносится с широкой представленностью в этих зонах компонентов клеточных стенок, типичных для двудольных растений, что подтверждает возможное сходство механизмов растяжения клеточных стенок I и II типов за счет сходства их составов. Однако помимо экспрессии представителей IX клады альфа-экспансинов, в корне кукурузы также были отмечены высокие уровни транскриптов генов, принадлежащих к другим кладам альфа- и бета-экспансинов (рис. 3), что указывает на существование не только сходств, но и различий в механизмах растяжения клеточных стенок I и II типов.

Сопрягая все эти результаты с различиями в связывании рекомбинантных экспансинов с полисахаридами, представленными на гликоэррее, мы предполагаем, что дифференциальная экспрессия экспансинов в различных зонах корня имеет не только тканевую и временную привязку, но и объясняется особенностями связывания in vivo индивидуальных экспансинов и конкретных полисахаридов матрикса клеточной стенки. Эта гипотеза помогает объяснить наличие большого разнообразия экспансинов и подчеркивает важность взаимодействия этих белков с более широким кругом полисахаридов клеточных стенок, чем это активно обсуждалось ранее.

Большое количество изоформ экспансинов, кодируемое в геномах злаков, по сравнению с геномами двудольных растений может быть обусловлено большим разнообразием полисахаридов матрикса клеточных стенок, характерным для растений с клеточными стенками II типа. При этом считается, что альфа-экспансины не увеличивают растяжимость клеточных стенок злаков, однако они не только кодируются в их геномах, но и активно экспрессируются в различных органах и тканях (рис. 3) [8, 10]. Это может быть связано с тем, что на ранних этапах своего развития клетки злаков имеют клеточные стенки значительно более похожие на клеточные стенки двудольных растений, и приобретают характерный для клеточных стенок II типа состав только на стадии активного роста растяжением [15]. Таким образом, можно предположить, что ткани злаков, использовавшиеся для оценки активности альфа-экспансинов (преимущественно колеоптили), не отвечали на них в первую очередь потому, что уже не были чувствительны к ним вследствие отсутствия достаточного количества молодых клеток. Роль отдельных изоформ экспансинов в морфогенезе злаков, а также конкретика механизмов действия экспансинов на свойства растительных клеточных стенок требуют дальнейших исследований.

Работа выполнена при поддержке грантов для междисциплинарных проектов Российского научного фонда (№ 20-64-47036, очистка, разделение и характеристика полисахаридов, № 20-63-47110 печать и работа с гликоэрреями), а также при поддержке государственного задания ФИЦ КазНЦ РАН (характеристика филогении и экспрессии экспансинов).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Т. А. Горшкова

Казанский институт биохимии и биофизики Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”

Author for correspondence.
Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Казань

Н. В. Шилова

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Москва

Л. В. Козлова

Казанский институт биохимии и биофизики Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”; Университет Монпелье, Национальный центр научных исследований

Email: gorshkova@kibb.knc.ru

Лаборатория механики и гражданской инженерии, Университет Монпелье, Национальный центр научных исследований

Russian Federation, Казань; Монпелье, Франция

О. В. Горшков

Казанский институт биохимии и биофизики Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Казань

А. Р. Назипова

Казанский институт биохимии и биофизики Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Казань

А. Р. Агълямова

Казанский институт биохимии и биофизики Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Казань

С. М. Полякова

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Москва

А. Ю. Нокель

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Москва

В. В. Головченко

Институт физиологии Федерального исследовательского центра Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Сыктывкар

П. В. Микшина

Казанский институт биохимии и биофизики Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Казань

О. А. Патова

Институт физиологии Федерального исследовательского центра Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Сыктывкар

Н. В. Бовин

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: gorshkova@kibb.knc.ru
Russian Federation, Москва

References

Supplementary files