Анализ генетической идентичности эмбриогенных клеточных линий Larix sibirica

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время проводятся активные исследования по соматическому эмбриогенезу хвойных в культуре in vitro [1–4]. Применение соматического эмбриогенеза в сочетании с криоконсервацией и геномной селекцией послужило основой для получения хозяйственно ценных генетически тестированных клонов и элитных генотипов. На основе биотехнологии соматического эмбриогенеза было создано новое перспективное направление – сортовое плантационное лесовыращивание (Международная программа Multi-Varietal Forestry (MVF)) [5].

Для успешного сортового лесовыращивания необходимо проведение оценки генетической идентичности эмбриогенных клеточных линий и клонированных из них растений. Высокие концентрации регуляторов роста в среде и длительность культивирования могут оказать влияние на качество эмбриогенных культур и полученное потомство. В ряде работ было показано, что эмбриогенные культуры растений могут характеризоваться сомаклональной изменчивостью [6, 7].

Молекулярные маркеры, в частности микросателлиты (SSR-маркеры), долгое время являются признанным инструментом для оценки популяционной изменчивости, анализа генетической структуры популяций, определения родства, ДНК-идентификации. Ввиду высокой скорости мутирования, кодоминантного характера наследования, равномерного распределения по геному и высокой воспроизводимости они получили широкое применение в изучении генетического разнообразия растений, в том числе хвойных видов [8, 9].

Соматический эмбриогенез – уникальное явление в развитии растений. Этот процесс является наглядным примером тотипотентности растительных клеток, и с помощью него можно изучать молекулярные основы эмбриогенной дифференцировки и регуляции развития растительных клеток in vitro. Применение клеточной и генной инженерии в бесполой репродукции через соматический эмбриогенез позволит контролировать этот процесс фундаментально, эффективно и точно.

Показано, что соматический эмбриогенез идет под строгим генетическим контролем. Только отдельные деревья доноры способны формировать эмбриогенные культуры и соматические зародыши in vitro [10–12].

Изучение генетической идентичности эмбриогенных культур и соответствие их родительским генотипам имеет большое значение не только для анализа сомаклональной изменчивости, но и для исследования генома хвойных в целом.

В связи с этим, целью данной работы была оценка генетической идентичности, путем генотипирования микросателлитных (SSR) локусов, у некоторых эмбриогенных клеточных линий и деревьев-клонов лиственницы сибирской.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала для исследования послужила хвоя материнского дерева-донора А4 и восьмилетних клонов № 8 и № 10, полученных из клеточной линии 6, а также эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ) КЛ6 (возраст культуры 12 лет, свободное опыление дерева-донора А4) и КЛ22.27.1 (возраст культуры 1 год, контролируемое опыление дерева-клона 8 пыльцой дерева-донора А4, рис. 1).

 

Рис. 1. Схема принадлежности исследуемых образцов.

 

Биотехнология соматического эмбриогенеза

Биотехнология соматического эмбриогенеза для Larix sibirica излагалась нами ранее [13]. Она включала 5 этапов: инициация ЭСМ, пролиферация эмбриогенных культур (регулярное субкультивирование), созревание соматических зародышей, прорастание и акклиматизация клонированных сеянцев [14].

Микросателлитный анализ

Препараты тотальной ДНК для микросателлитного анализа были выделены из хвои деревьев, клонов и эмбриональной суспензорной массы. Клеточные линии выделялись модифицированным методом с применением цетилтриметиламмониумбромида (CTAB) [15]. Всего было проанализировано 4 образца в двух повторностях.

Оценку качества выделенной ДНК проводили при помощи спектрофотометра NanoPhotometer P 330 IMPLEN. Для оценки чистоты и качества нуклеиновых кислот при спектрофотометрическом измерении, чистоту образца определяли, исходя из соотношения оптических плотностей при длинах волн 230, 260 и 280 нм. Оптимальные значения соотношение A₂₆₀/A₂₈₀ в наших образцах ДНК составляли 1.8–2.0. Значения менее 1.8 могут указывать на загрязнение образца полипептидами, более 2 – на возможную деградацию и наличие свободных нуклеотидов.

Оценка количества выделенной ДНК проводили с использованием настольного флуориметра Qubit (“Invitrogen”, США) (http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/cell_tissue_analysis/Qubit-all-file-types.Par.0519.File.dat/Qubit-2-Fluorometer-User-Manual.pdf) и буферных растворов, необходимых для работы Qubit dsDNA BR Assay Kit (“Invitrogen”, США). Для дальнейшей работы отбирали образцы высококачественной ДНК с концентрацией не менее 20–30 нг/мкл.

Выделенную ДНК использовали для проведения ПЦР с 21 парой олигонуклеотидов-праймеров, разработанных ранее для микросателлитных последовательностей лиственницы японской (L. kaempferi) [16], лиственницы западной (L. occidentalis) [17] и лиственницы сибирской (L. sibirica) [18]. Описание отобранных для исследований микросателлитных локусов и условия ПЦР-амплификации приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Ядерные микросателлитные локусы, отобранные для генотипирования образцов лиственницы сибирской.

Локус	Мотив и число его повторов в референсном геноме	Размер фрагмента, №	t°С отжига	Источник литературы
bcLK 056	AG(20)	174–200	Touchdown 63°–53°С	[16]
bcLK 066	TG(12)	155–172
bcLK 189	AG(17)AT(AG)(7)	162–196
bcLK 224	AG(17)	152–168
bcLK 225	GA(20)	180–213
bcLK 232	AG(19)	142–178
bcLK 260	TG(14)AG(9)	115–126
UBCLXtet_1–22	TATC(9)TA(12)	175–250		[17]
Ls_417667	AAT(16)	207–243		[18]
Ls_840190	TAC(15)	216–249
Ls_954234	ATT(15)	171–204
Ls_611965	CAG(18)	222–276
Ls_752897	AAG(15)	216–264
Ls_1247092(2)	CTT(19)	201–228
Ls_3765334	GAG(17)	174–213
Ls_1008427	ATAG(13)	152–174
Ls_2672894	TTTG(11)	152–164
Ls_2552367	CTAT(10)	184–196
Ls_980491	CTAT(12)	204–240
Ls_3952800	TATG(10)	200–264
Ls_305132	GTCGGA(7)	210–240

 

Для проведения ПЦР использовали готовые реакционные смеси для амплификации ДНК “GenePak PCR Core” (ООО “Лаборатория Изоген”, Россия), содержащие ингибированную для “горячего старта” Taq-ДНК-полимеразу, дизоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния. ПЦР-амплификацию проводили на приборе ДНК-амплификатор T100 ThermalCycler (“Bio-Rad”, США). Программа амплификации включала первичную денатурацию в течение 1 мин при 94°С, затем 9 циклов “touchdown” c понижением на 1°С каждый цикл: 30 с при 94°С, 30 с при 63°С, 1 мин при 72°С, далее 24 цикла без “touchdown”: 30 с при 94°С, 30 с при 53°С, 30 с при 72°С; финальная элонгация составляла 10 мин при 72°С.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6% полиакриламидном геле с использованием трис-EDTA-боратного электродного буфера в камерах для вертикального электрофореза. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия и визуализировали с помощью системы гельдокументирования Gel Imager-2 (“Хеликон”, Россия). Молекулярный вес фрагментов определяли путем сопоставления со стандартным маркером в программе Photo-Capt. В качестве маркера стандартных длин использовали ДНК плазмиды pBR322, обработанной рестриктазой HpaII.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Коллекция пролиферирующих эмбриогенных культур (ЭК) лиственницы сибирской Института леса им. В.Н. Сукачева (ФИЦ КНЦ СО РАН) состоит из 54 клеточных линии (КЛ), полученных в разные годы (2008–2023 гг.) от шести генотипов в результате свободного и контролируемого опыления. Из них 22 клеточные линии в течение 8–14 и более лет продуцируют массовые соматические зародыши. Из КЛ6, инициированной в 2011 г., получены клоны деревьев лиственницы, которые отличались быстрым ростом и сверхранним развитием генеративных органов [4].

Пролиферирующая КЛ6, сохраняла жизнеспособность до 12 лет. У этой КЛ происходило образование глобулярных соматических зародышей и их размножение через кливаж (при регулярном субкультивировании). При переводе фрагментов эмбриогенной ткани этой клеточной линии на среду АИ для созревания с АБК (32 мг/л) зародыши в течение 45–60 дней созревали (13 ± 3 шт/г ЭСМ), а затем прорастали. Таким образом, способность к регенерации у КЛ6 сохранялась около 12 лет. КЛ 22.27.1 была получена в 2022 г. в результате контролируемого опыления дерева-клона № 8 пыльцой материнского дерева А4. КЛ22.27.1 успешно пролиферировала. Эмбриональная масса ее состояла из глобулярных зародышей (рис. 2а). На среде АИ с АБК шла дифференцировка соматических зародышей до их полного созревания (рис. 2б) и прорастания (рис. 2в). Число зрелых семядольных зародышей у КЛ22.27.1 составило – 26 ± 4.6 шт/г ЭСМ.

 

Рис. 2. Соматические зародыши (СЗ) лиственницы сибирской (КЛ22.27.1) на разных стадиях онтогенеза: (а) – глобулярные СЗ на среде для пролиферации, (б) – дифференцированные семядольные СЗ на среде для созревания, (в) – 14-дневные регенеранты на среде для проращивания.

 

Микросателлитный анализ

В результате проведенного молекулярно-генетического анализа дерева-донора (А4), деревьев-клонов (№ 8 и № 10) и клеточных линий (КЛ6, КЛ22.27.1) лиственницы сибирской выяснилось, что 9 (bcLK 066, bcLK 224, bcLK 232, bcLK 260, UBCLXtet_1–22, Ls_417667, Ls_3765334, Ls_2672894, Ls_980491) из 21 локусов оказались мономорфными во всех исследованных образцах.

Остальные 12 локусов проявили себя как полиморфные (табл. 2). Причем по 8 локусам (bcLK 056, bcLK 225, Ls_840190, Ls_752897, Ls_1247092, Ls_1008427 Ls_2552364 и Ls_305132) КЛ6 была гомозиготной. У локусов bcLK 189, Ls_2552364, Ls_3952800 в КЛ6 только один аллель соответствовал материнскому дереву А4. По локусам Ls_954234, Ls_611965 КЛ6 оказалась гетерозиготной с двумя аллелями идентичными материнскому генотипу. А по локусу bcLK 225 у этой клеточной линии выявлены 2 аллеля, отличные от материнского дерева.

 

Таблица 2. Полиморфные микросателлитные локусы и их генотипы при изучении дерева-донор, эмбриональных клеточных линий и деревьев-клонов.

Образцы

bcLK 056

bcLK 189

bcLK 225

Ls_840190

Ls_954234

Ls_611965

Ls_752897

Ls_1247092

Ls_1008427

Ls_2552364

Ls_3952800

Ls_305132

Дерево-донор А4

147/147

168/168

206/206

240/240

207/183

222/213

249/249

217/217

152/152

182/214

295/267

222/222

Дерево-донор А4

147/147

168/168

206/206

240/240

207/183

222/213

249/249

217/217

152/152

182/214

295/267

222/222

КЛ6

147/147

168/164

182/182

240/240

207/183

222/213

249/249

217/217

152/152

182/182

295/295

222/222

КЛ6

147/147

168/164

182/182

240/240

207/183

222/213

249/249

217/217

152/152

182/182

295/295

222/222

Дерево-клон 8

147/147

168/164

182/182

240/237

207/207

222/213

249/249

217/217

152/152

182/214

295/295

222/222

Дерево-клон 8

147/147

168/164

182/182

240/237

207/207

222/213

249/249

217/217

152/152

182/214

295/295

222/222

Дерево-клон 10

147/147

168/164

182/182

240/240

207/207

222/213

249/249

217/217

152/152

182/214

295/295

222/222

Дерево-клон 10

147/147

168/164

182/182

240/240

207/207

222/213

249/249

217/217

152/152

182/214

295/295

222/222

КЛ 22.27.1

167/147

164/164

164/164

240/240

207/192

222/213

249/240

229/229

152/176

182/182

295/295

222/210

КЛ 22.27.1

167/147

164/164

164/164

240/240

207/192

222/213

249/240

229/229

152/176

182/182

295/295

222/210

 

В целом, проведенное генотипирование по микросателлитным локусам КЛ6 показало, что выявленные аллели по большинству локусов соответствовали материнскому дереву-донору. Измененные аллели КЛ6, наблюдаемые у отдельных локусов, скорее всего, свидетельствуют о проявлении отцовского генотипа, которое неизбежно возникало при свободном опылении.

Анализ генотипов по тем же самым локусам у КЛ22.27.1 показал несколько иную картину. Стоит отметить, что КЛ22.27.1 была получена от дерева-клона № 8 при контролируемом опылении пыльцой дерева-донора А4. При генотипировании у КЛ22.27.1 только по локусу Ls_611965 был выявлен генотип (222/213) полностью идентичный родительским деревьям. По локусам bcLK 056, Ls_752897, Ls_1008427, Ls_305132 у клеточной линии был выявлен один аллель не встречающийся в родительских генотипах. В локусах bcLK 189, Ls_840190, Ls_2552364, Ls_3952800 в гомозиготном генотипе КЛ22.27.1 сходство выявлено по одному из аллелей родительских деревьев. У локуса Ls_954234 в гетерозиготном генотипе выявлен один аллель сходный с родительскими, а второй совершенно отличный. А в локусах bcLK 225 и Ls_1247092 были выявлены генотипы, отличающиеся от родительских образцов. В данном случае измененные аллели у КЛ22.27.1, наблюдаемые по ряду локусов скорее всего, свидетельствуют о высоком уровне геномной нестабильности и высокой частоте мутаций в полученной клеточной линии. Подобные результаты по изучению культивирования in vitro мегагаметофитов лиственницы сибирской ранее были описаны в работе Крутовского К. В. с соавт. [19].

ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка генетической идентичности эмбриогенных клеточных линий очень важна для успешного создания клонированных растений [4, 6, 7]. В ряде работ было показано, что эмбриогенные культуры видов хвойных могут характеризоваться генотипической нестабильностью [10, 20].

Высокая частота мутаций и генетическая нестабильность по ядерным микросателлитным локусам была ранее отмечена в эмбриогенных клеточных линиях некоторых древесных – сосны приморской (Pinus pinaster Aiton) [21], сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) [20], пихты кефалинийской (Abies cephalonica Loudon) [22], дубов пробкового (Quercus subres L.) и чересчатого (Quercus robus L.) [23, 24].

У эмбриогенных культур лиственницы Маршлинса (Larix marschlinsii Grot) [25], лиственницы европейской (L. decidua Mill.) [26, 27], лиственницы японской (L. leptolepis Gonf.) [28], ели обыкновенной (Picea abies L.) [29], сосны черной (Рinus nigrа J.F.Arnold) [30], сосны лучистой (Pinus radiate D.Don) [31] была обнаружена полиплоидия. Появление полиплоидных клеток при соматическом эмбриогенезе также было отмечено в культуре мегагаметофитов лиственницы европейской (Larix decidua Mill.) [32].

В проведенных нами ранее исследованиях по сомаклональной изменчивости гаплоидной культуры тканей in vitro, полученной из мегагаметофитов лиственницы сибирской была выявлена высокая частота соматического мутагенеза и генетическая гетерогенность после двух месяцев культивирования. Из шести клеточных линий, только четыре линии оказались гаплоидными [19]. Однако при изучении гаплоидных культур хвойных видов следует принять во внимание тот факт, что мегагаметофиты этого класса растений представлены не только гаплоидными клетками. На стадии образования целлюлярного (клеточного) гаметофита, наряду с гаплоидными клетками, происходит образование диплоидных и даже полиплоидных клеток [33].

Вместе с тем, в других работах в некоторых эмбриогенных культурах елей (P. abies, P. glauca, P. mariana × P. glauca, P. orientalis) и сосны приморской (Pinus pinaster) сомаклональная изменчивость не была обнаружена [34–37]. У ели обыкновенной генетических вариаций не было замечено на всех стадиях соматического эмбриогенеза – от ЭСМ до растений регенерантов [34]. Генетическая стабильность была так же обнаружена у регенерирующих растений сосны Эллиота (Pinus elliotii Engelm.) [38]. У большинства регенерантов Pinus massoiana мутаций в тестируемых локусах SSR не наблюдалось [12].

Проведенный нами ранее цитогенетический анализ эмбриогенных клеточных линий L. sibirica показал, что молодые KЛ в возрасте до 1 г. могут сохранять цитогенетическую стабильность и содержать в кариотипе нормальное для данного вида диплоидное число хромосом (2n = 24). В длительно пролиферирующих КЛ накапливаются мутации и происходит изменение числа хромосом (2n = 25; 2n = 26). У таких КЛ сохраняется способность формировать соматические зародыши. В наших коллекционных клеточных линиях выделяется КЛ6, которая в возрасте 6–12 лет являлась цитогенетически стабильной с диплоидным числом хромосом 2n = 24 [39, 40]. Генетическая стабильность КЛ6 была подтверждена микросателлитным анализом. Несоответствие материнскому генотипу данной КЛ наблюдалось только по двум аллелям из одиннадцати локусов [16]. Относительная генетическая стабильность КЛ6 была показана и в настоящем исследовании. Именно из этой клеточной линии были получены клоны деревьев № 8 и № 10, которые по данным микросателлитного анализа, полностью идентичны данной КЛ. Следовательно, такие клеточные линии можно использовать для получения посадочного материала в плантационном лесовыращивании при постоянном генетическом контроле.

Однако, проведенное контролируемое опыление клонов пыльцой дерева-донора и получение КЛ показало генетическую нестабильность у КЛ22.27.1, в которой наблюдалась высокая частота мутаций. С этой клеточной линией требуется дополнительная цитогенетическая работа.

Следовательно, проведение регулярного цитогенетического и микросателлитного контроля очень важно при клонировании растений через соматический эмбриогенез. При этом необходимо выявлять генетическую стабильность или нестабильность клеточных культур. Выявление клеточных линий с измененным хромосомным набором представляет большой интерес для генетики хвойных растений, а также вносит вклад в развитие теоретических аспектов репродуктивной биологии и в целом биологии развития растений.

Таким образом, соматический эмбриогенез является важной биотехнологией в размножении хвойных видов, в том числе для разработки и производства сортов деревьев с желательными селекционными признаками. Данная технология может быть успешно реализована в крупномасштабном коммерческом производстве. Наиболее важным преимуществом производства хвойных деревьев методом соматического эмбриогенеза является то, что эмбриогенные клеточные линии могут быть криогенно сохранены в ювенильном состоянии неограниченно долго, что было невозможно при других методах размножения деревьев.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, Правительства Красноярского края, Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности в рамках научного проекта (№ 22-14-20008).

Статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

И. Н. Третьякова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук – обособленное подразделение Федерального исследовательского центра “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”

Author for correspondence.
Email: culture@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Красноярск

Н. В. Орешкова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук – обособленное подразделение Федерального исследовательского центра “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”; Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Сибирский федеральный университет”

Email: culture@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Красноярск; Красноярск; Красноярск

М. Э. Пак

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук – обособленное подразделение Федерального исследовательского центра “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”

Email: culture@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Красноярск

References

Supplementary files