Морфофизиологические и биохимические характеристики сарциноидной микроводоросли Chlorosarcinopsis eremi (Chlorophyceae, Chlorophyta)

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Исследован штамм VKM Al-132 зеленой сарциноидной микроводоросли, изолированный из каштановой почвы зоны сухих степей (Волгоградская область, Россия). По результатам световой и сканирующей электронной микроскопии, а также молекулярно-филогенетического анализа гена 18S рРНК и спейсера ITS2 штамм был идентифицирован как Chlorosarcinopsis eremi. Изучены особенности его роста и вторичного каротиногенеза в условиях двухстадийной накопительной культуры. Средняя продуктивность по сухой биомассе за 21 сут. эксперимента составляла 0.12 г/л·сут., а по суммарным каротиноидам – 0.2 мг/л·сут. В конце стадии вторичного каротиногенеза при доле суммарных каротиноидов в сухой биомассе около 0.25% доминирующими фракциями были кантаксантин и диэфиры астаксантина, причем сумма эфиров астаксантина достигала 36% от суммарных каротиноидов. Показано, что штамм VKM Al-132 может служить потенциально перспективным объектом дальнейших экспериментальных работ, направленных на оптимизацию условий для интенсификации процесса биосинтеза кетокаротиноидов.

Full Text

1 Сокращения: ВКГ – вторичный каротиногенез, ККар – кетокаротиноиды, СБ – сухая биомасса, СЭМ – сканирующая электронная микроскопия, ТСХ – тонкослойная хроматография, Хл а – хлорофилл а, Хл b – хлорофилл b.

ВВЕДЕНИЕ

Зеленые сарциноидные водоросли повсеместно распространены в наземных, пресноводных и морских экосистемах и характеризуются способностью к особому типу вегетативного деления – десмосхизису, которое происходит в различных плоскостях, в результате чего образуются двух- и трехмерные комплексы клеток. Все три класса зеленых водорослей – Ulvophyceae, Trebouxiophyceae и Chlorophyceae (UTC-клада), которые составляют ядро отдела Chlorophyta, включают роды с сарциноидной организацией таллома. Однако наиболее представлены сарциноидные микроводоросли в классе Chlorophyceae, которые ранее были объединены по этому признаку в порядок Chlorosarcinales [1]. В порядок были включены водоросли с “жесткими” (Spongiococcum, Tetracystis, Fasciculochloris, Heterotetracystis, Borodinellopsis, Axilosphaera) и “голыми” (Borodinella, Friedmannia, Pseudotetracystis, Ignatius, Chlorosarcina, Desmotetra, Planophila, Neochlorosarcina, Chlorosarcinopsis, Chlorosphaeropsis, Chloroplana) зооспорами, что и явилось признаком для разделения их на семейства Tetracystidaceae и Chlorosarcinaceae, соответственно [2]. Однако с развитием молекулярно-филогенетического анализа было неоднократно показано, что порядок Chlorosarcinales является искусственным и, согласно последнему таксономическому пересмотру, микроводоросли с “голыми” зооспорами входят в порядок Chlamydomonadales (=Volvocales) [3–5].

Интерес к сарциноидным микроводорослям обусловлен способностью некоторых из них в неблагоприятных условиях (дефицит влаги и биогенных элементов, высокая освещенность, температура и т.д.) накапливать большое количество специфических вторичных экстрапластидных кетокаротиноидов (ККар), структурно и функционально не связанных с фотосинтетическим аппаратом клетки и выполняющих защитную функцию в условиях абиотического стресса [6]. Это астаксантин и близкие ему по структуре и биологической активности метаболические предшественники (кантаксантин, адониксантин, адонирубин) [7, 8]. В качестве мощных антиоксидантов и иммуномодуляторов ККар представляют ценность для пищевой и косметической промышленности, фармакологии, сельского хозяйства.

Зеленые микроводоросли (Chlorophyta) – самая многочисленная группа микроорганизмов, обладающая способностью синтезировать и накапливать ККар. Процесс вторичного каротиногенеза (ВКГ) характерен преимущественно для представителей порядков Sphaeropleales и Chlamydomonadales, среди которых наиболее изучены роды Haematococcus, Neochloris, Chromochloris и Coelastrella [9]. Тем не менее удешевление и активное введение в практику полногеномного секвенирования позволило во многих микроводорослевых геномах обнаружить ортологи β-каротин кетолазы – фермента, обеспечивающего синтез ККар из β-каротина [7]. Это свидетельствует о том, что число видов каротиногенных микроводорослей гораздо больше, чем принято считать.

Род Chlorosarcinopsis (Chlamydomonadales), представители которого являются обитателями почвенных и песчаных (часто засушливых) местообитаний и колонии которых в неблагоприятных условиях приобретают ярко-оранжевый цвет за счет аккумуляции ККар [2, 9], изучен недостаточно. По немногочисленным литературным данным во фракционном составе его ККар доминирует кантаксантин [8, 9]. Перспективность изучения рода была подтверждена несколькими исследованиями по секвенированию пластидного и митохондриального геномов [10, 11].

Цель данной работы заключалась в изучении морфологических и молекулярно-генетических характеристик штамма VKM Al-132, исследовании особенностей его роста в условиях двухстадийной накопительной культуры и анализе фракционного состава кетокаротиноидов на стадии вторичного каротиногенеза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Объектом исследования являлся штамм сарциноидной зеленой микроводоросли VKM Al-132 (ранее ACSSI 132) из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Штамм был изолирован в 2014 г. из верхнего горизонта каштановой солонцеватой почвы около с. Перегрузное Волгоградской области (47°53ʹ21ʺ с.ш., 44°0ʹ50ʺ в.д.) путем посева почвенной суспензии на твердую питательную среду BG11 с азотом (1% агар, pH = 7.0) и многократного пересева отдельных колоний микроводорослей методом истощающего штриха.

Световая и электронная микроскопия

Изучение морфологии и жизненного цикла штамма проводили методами световой микроскопии с помощью микроскопа Leica DM750 (“Leica”, Германия). Результаты наблюдений документированы фотографиями, снятыми с помощью цифровой камеры Leica Flexacam C3 (“Leica”, Германия). Сроки наблюдения составляли от 2 нед. до 6 мес. При морфологической идентификации учитывали форму, структуру и размеры пакетов; форму и размеры отдельных вегетативных клеток; тип хлоропласта; наличие, количество пиреноидов и тип крахмальной обкладки; особенности размножения и другие характеристики [2]. Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) 0.5 мл культуры фиксировали 2% глутаровым альдегидом в 6.67 мМ Na-К-фосфатном буфере (ФБ) с постфиксацией 0.005% раствором Люголя в ФБ и дегидратировали в серии возрастающих концентраций этанола [12]. СЭМ-изображения клеток получали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi SU3500 (“Hitachi”, Япония).

Молекулярно-генетический анализ

Тотальную ДНК из штамма выделяли с помощью колоночного набора DNeasy Plant Mini Kit (“Qiagen”, США), следуя протоколу производителя. Для амплификации использовали готовую смесь Screen Mix-HS (“Евроген”, Россия).

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена 18S рРНК и спейсера ITS2 были использованы праймеры, рекомендованные в статьях Katana [13] и White [14], соответственно (Дополнительные материалы, табл. S1).

Детекцию целевых ПЦР-продуктов проводили электрофоретически в 1% агарозном геле. Для дальнейшей очистки ампликонов из геля применяли набор Cleanup Mini (“Евроген”, Россия). Секвенирование нуклеотидных последовательностей осуществляли на базе ЗАО Синтол, (“Синтол”, Россия).

Далее осуществлялась сборка гена 18S рРНК и поиск гомологии по алгоритму BLASTn в GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для выбора модели нуклеотидных замен использовали программу jModelTest. Реконструкцию филогенетических взаимосвязей осуществляли методом максимального правдоподобия (ML) в программе PhyML. Статистическая поддержка топологии дерева была оценена с помощью бутстрэп-анализа (1000 повторностей) и указана в узлах ветвей в виде процентов. За основу была принята филогенетическая реконструкция из статьи T. Nakada [15, 16], но с более расширенной кладой Arenicolinia. Генетические различия между нуклеотидными последовательностями гомологичных генов охарактеризовали с помощью генетических дистанций. Мерой генетических различий являлся процент несовпадений нуклеотидов при попарном сравнении выравненных последовательностей, вычисление которого проводили в программе MEGA 6.0 с использованием двухпараметрической модели Кимуры (K2P). Филогенетические связи визуализировали с помощью программы FigTree v1.3.1. Полученные нуклеотидные последовательности были депонированы в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) под номерами KY086471 (18S рРНК) и MG523292 (ITS2).

Условия культивирования

Водоросли выращивали методом двухстадийной накопительной культуры [17], который позволяет в рамках одного эксперимента получить данные, характеризующие рост и метаболизм каротиногенных микроводорослей на стадиях активного роста культуры (“зеленая” стадия) и вторичного каротиногенеза как защитной реакции клеток на абиотический стресс (“красная” стадия). В качестве питательной среды использовали среду ВВМ [18], в 1 л которой содержится: NaNO3 – 241 мг; MgSO4·7H2O – 75 мг; NaCl – 25 мг; K2HPO4·3H2O – 75 мг; KH2PO4 – 175 мг; (Na2-ЭДТА) – 50 мг; KOH – 31 мг; Н3ВО3 – 11 мг; ZnSO4·7H2O – 8.82 мг; MnCl2·4H2O – 44 мг; Na2MoO4·2H2O – 2.42 мг; CuSO4·5H2O – 1.57 мг; Co(NO3)2·6H2O – 0.49 мг; FeSO4·7H2O – 4.98 мг; H2SO4 конц. – 1 мкл; CaCl2 – 18.9 мг.

Инокулят выращивали на среде ВВМ при одностороннем боковом освещении светодиодными лампами Feron DL 20W T4 6400K (“Feron”, Россия) в течение 7 сут. Плотность потока ФАР составляла 52 мкмоль/(м2·с) с фотопериодом, приближенным к природному и рекомендованным для выращивания каротиногенных микроводорослей – 15 ч свет/9 ч темнота [19], и температуре 24°С.

В эксперименте штамм культивировали в пластиковых флаконах Tissue Culture Flasks (“Falcon”, США) объемом 0.75 л, исходный объем культур с начальным содержанием сухой биомассы (СБ) 0.3 г/л составлял 0.6 л.

На “зеленой” стадии штамм VKM Al-132 рос при естественном освещении на подоконнике окна, ориентированного на юго-запад. Культуру барботировали атмосферным воздухом при помощи аквариумного компрессора Resun ACO-9630 при скорости 0.44 л/(мин.·л). Продолжительность “зеленой” стадии составляла 9 сут.

При переводе культуры на “красную” стадию, принимая во внимание недостаточность литературных сведений о характере реакции штамма на абиотический стресс, для индукции ВКГ был использован “облегченный” вариант стрессирования. Культура была переведена на двустороннее круглосуточное освещение светодиодными лампами Feron DL 20W T4 6400K (“Feron”, Россия) с плотностью потока ФАР 130 мкмоль/(м2·с) с каждой стороны. Температура в культуре составляла 28–29°С. На протяжении светового периода уровень рН 7.0 ± 0.5 поддерживали путем дозированной подачи углекислого газа (объемная доля СО2 – 99.8% по ГОСТ 8050–85) при помощи электромагнитного клапана Camozzi А7Е (“Camozzi”, Италия) и цифрового рН-контроллера Aqua Medic pH 2001C (“Aqua Medic”, Германия). Для дополнительной стимуляции ВКГ во флаконах 3% объема культуры заменили на 1% раствор NaCl до конечной концентрации в среде 5 мМ. Продолжительность “красной” стадии составляла 12 сут.

Определение сухой биомассы и пигментный анализ

Содержание сухой биомассы (СБ) измеряли гравиметрически [20] на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах с размером пор 3.0 мкм (“Владисарт”, Россия).

Содержание хлорофиллов и суммарных каротиноидов (Кар) в биомассе микроводорослей определяли спектрофотометрически на СФ-2000 (ОКБ “Спектр”, Россия) в диметилсульфоксидных [21] и в ацетоновых [22] экстрактах. Пигментный состав в конце “красной” стадии исследовали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) ацетоновых экстрактов на пластинах “Silica gel 60” (“Merck”, Германия) с использованием последовательно двух систем растворителей: I – гексан-ацетон 9:1; II – гексан-бензол-ацетон 5:3.75:0.8. Идентификацию доминирующих фракций проводили путем сравнения со стандартами при совместной хроматографии, а также по спектрам поглощения в различных растворителях. Стандарт кантаксантина получали из цист ракообразного Artemia sp., эфиров астаксантина – из зрелых апланоспор микроводоросли Haematococcus pluvialis [23].

Измерения проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. На рисунках и в тексте приведены средние значения (х) и их стандартная ошибка (m).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Микроскопический анализ

Результаты наблюдений с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии позволили предположить принадлежность штамма VKM Al-132 к роду Chlorosarcinopsis, для которого характерно наличие клеточных пакетов, голых зооспор, пристенного хлоропласта и одного пиреноида с прерывистой крахмальной обкладкой. Молодые вегетативные клетки имели шаровидную форму до 8 мкм в диаметре, далее образовывали диады, тетрады и более сложные комплексы в результате десмосхизиса (рис. 1). Псевдонитчатых скоплений клеток не наблюдали. У стареющих культур (после 6 мес. хранения) отмечалось изменение цвета биомассы с зеленой на красно-коричневую, что может свидетельствовать о синтезе ККар при дефиците азота в истощенной среде. Именно это послужило основой интереса к данному штамму.

 

Рис. 1. Штамм C. eremi VKM Al-132. а – молодые вегетативные клетки (СЭМ). Световая микроскопия: б – “голые” зооспоры, в – сарциноидные пакеты, г – слизистые сложные комплексы клеток. Шкала: а – 2 мкм, б, в, г – 10 мкм.

 

Культура была переведена на жидкую минеральную среду ВВМ после 9 лет хранения на твердой агаризованной (1%) среде BG-11 при температуре +15°С с ежегодным пересевом. Возможно, столь продолжительный срок стал причиной длительной адаптации штамма к условиям автотрофного роста: процесс получения генерации вегетативных делящихся клеток занял около 4 мес. с еженедельным пересевом. В начале адаптационного периода вегетативные клетки имели размер 3–5 мкм. Также было отмечено (преимущественно в первой половине дня) наличие подвижных зооспор, которые затем замедляли движение, останавливались и округлялись. Возможно, небольшие размеры в период адаптации объясняются тем, что мы наблюдали клетки, только вышедшие из клеточных пакетов, либо остановившиеся зооспоры. Заданные стабильные внешние условия (освещенность и температура) и многократные частые пересевы жидкой культуры на подготовительном этапе позволили получить к началу эксперимента синхронизированную культуру.

Молекулярно-генетический анализ

По данным 18S рРНК анализа изучаемый штамм VKM Al-132 со 100% статистической поддержкой вошел в кладу Arenicolinia (рис. 2). Однако внутри клады не наблюдалось хорошо поддерживаемых групп из-за консервативности выбранного молекулярного маркера. Генетические различия изучаемого штамма с аутентичным штаммом C. arenicola UTEX 1697, штаммом C. variabilis UTEX 1600 и аутентичным штаммом C. eremi UTEX 1186 составили 0.9, 0.4 и 0.1% соответственно.

 

Рис. 2. Филогенетическое положение штамма VKM Al-132 на дереве гена 18S рРНК (1737 п.н.). В качестве статистической поддержки узлов дерева указаны бутстреп-значения (<70% не показаны). Модель нуклеотидных замен: GTR + I + G. Обозначения: жирным шрифтом выделен изучаемый штамм, * − аутентичный штамм; (T) – типовой вид.

 

Сравнение более вариабельного спейсера ITS2 исследуемого штамма VKM Al-132 (MG523292) c единственной последовательностью ITS2 для перечисленных трех видов Chlorosarcinopsis – C. eremi UTEX 1186 (HQ246438) показало их 100% сходство. Таким образом, штамм VKM Al-132 был идентифицирован как C. eremi.

Ростовые характеристики штамма в условиях двухстадийной культуры

При заданных внешних условиях на “зеленой” стадии в первые двое сут. биомасса C. eremi увеличилась в два раза (рис. 3). К концу “зеленой” стадии средняя продуктивность штамма VKM Al-132 составила 0.11 ± 0.00 г/л·сут. Сопоставимые результаты были получены нами ранее для микроводорослей порядка Sphaeropleales: Bracteacoccus minor, Coelastrella rubescens, Chromochloris zofingiensis, и порядка Chlamydomonadales: Pseudospongiococcum protococcoides (0.08–0.09 г/ л·сут.) [24].

 

Рис. 3. Динамика биомассы (СБ) штамма C. eremi VKM Al-132, на “зеленой” (I) и “красной” (II) стадиях эксперимента (X ± m).

 

После стресс-воздействия на “красной” стадии биомасса продолжала увеличиваться за счет активного накопления клетками запасных веществ (рис. 3), что является характерной особенностью каротиногенных микроводорослей [25, 26], и средняя за весь эксперимент продуктивность по СБ составила 0.12 ± 0.00 г/л·сут.

Пигментный состав клеток штамма на разных стадиях культивирования

На “зеленой” стадии содержание хлорофиллов в культуре C. eremi резко увеличивалось в первые двое сут. (рис. 4а, б). Далее уровень хлорофиллов возрастал вплоть до перевода культур на стадию ВКГ, тогда как в биомассе снижался в течение всего эксперимента (рис. 4г, д).

 

Рис. 4. Динамика пигментного состава в культуре и биомассе штамма C. eremi VKM Al-132, на “зеленой” (I) и “красной” (II) стадиях эксперимента: а, г – Хл а, б, д – Хл b, в, е – суммарные Кар (X ± m).

 

Визуально наблюдаемое изменение цвета культур от зеленого до болотно-желтого послужило оценочным критерием готовности культур к переводу на стадию ВКГ. В течение “красной” стадии содержание Хл а и Хл b в культуре и биомассе снизилось почти до нуля. Содержание суммарных Кар в культуре на 8 сут. ВКГ увеличилось в 1.9 раза, тогда как их массовая доля в СБ изменялась незначительно на протяжении всей стадии ВКГ и составляла около 0.25% (рис. 4в, е). Это согласуется с опубликованными нами ранее данными для зеленых водорослей P. protococcoides, B. minor, C. rubescens и C. zofingiensis: массовая доля Кар в их биомассе составляла 0.23–0.39% [22], а также с работами других авторов: у Botryococcus braunii доля Кар в СБ варьирует в пределах 0.25–0.55% [8], у Chromochloris zofingiensis составляет 0.31% [27]. Тем не менее подчеркнем, что сравнение данных, приведенных различными авторами для каротиногенных Chlorophyta, часто затруднено из-за несходства условий стрессирования (природа стресс-агента, температурный и световой режимы).

К концу “красной” стадии культура приобрела темно-оранжевый цвет в результате деструкции фотосинтетических пигментов и накопления ККар (рис. 5, 6а). Продуктивность по суммарным Кар (за весь эксперимент) составила 0.19 ± 0.01 мг/л·сут., что сравнимо с этим показателем у представителей порядка Sphaeropleales: C. zofingiensis и Neochloris wimmeri 0.21 и 0.22 мг/л·сут., соответственно [28].

 

Рис. 5. Штамм VKM Al-132 на разных стадиях эксперимента: (а) – “зеленой”, (б) – “красной”. Шкала 15 мкм.

 

Пигментный состав клеток определяли в конце “красной” стадий. По данным хроматографического анализа в красных культурах C. eremi доминировали диэфиры астаксантина и кантаксантин при значительной доле моноэфиров адониксантина (рис. 6б, 7, табл. 1). В совокупности ККар составляли 87.12 ± 0.36% от суммарных Кар (табл. 1), причем доля эфиров астаксантина в них превышала 36%.

 

Рис. 6. Культура C. eremi VKM Al-132 (а) и хроматограмма каротиноидов (б) в конце “красной” стадии. 1 – лютеин, 2 – адониксантин (моноэфиры), 3 – астаксантин (моноэфиры), 4 – кантаксантин, 5 – адонирубин (эфиры), 6 – астаксантин (диэфиры), 7 – β-каротин.

 

Рис. 7. Спектры ацетоновых экстрактов каротиноидов штамма C. eremi VKM Al-132 в конце “красной” стадии эксперимента. 1 – лютеин, 2 – ß-каротин, 3 – кантаксантин, 4 – адониксантин (моноэфиры), 5 – астаксантин (диэфиры), 6 – астаксантин (моноэфиры), 7 – адонирубин (моноэфиры), 8 – эхиненон.

 

Таблица 1. Состав каротиноидов штамма C. eremi VKM Al-132 в конце “красной” стадии эксперимента (х ± m).

Фракции каротиноидов

Массовая доля фракции в суммарных Кар, %

Содержание фракции в культуре, мг/л

Окончание “красной” стадии

Астаксантин (диэфиры)

28.50 ± 3.08

1.70 ± 0.05

Кантаксантин

28.33 ± 2.28

1.69 ± 0.01

Адониксантин (моноэфиры)

15.75 ± 2.05

0.96 ± 0.20

Астаксантин (моноэфиры)

7.88 ± 1.37

0.47 ± 0.04

Адонирубин (моноэфиры)

4.88 ± 0.14

0.29 ± 0.02

Лютеин

2.55 ± 0.28

0.15 ± 0.01

Эхиненон

1.80 ± 0.13

0.11 ± 0.02

β-каротин

1.74 ± 0.11

0.11 ± 0.01

 

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным морфологического анализа изученный штамм был идентифицирован как член рода Chlorosarcinopsis. Однако отсутствие в культуре псевдонитчатых скоплений клеток не позволило установить его принадлежность к виду C. eremi. Использование консервативного маркера – гена 18S рРНК – выявило филогенетическое родство штамма VKM Al-132 с видами C. eremi, C. arenicola и C. variabilis. И только вариабельный маркер ITS2 однозначно определил штамм как C. eremi. Род требует ревизии, т.к. его представители принадлежат как минимум четырем различным филогенетическим группам, относящимся к трем кладам Arenicolinia, Stephanosphaerinia и Dunaliellinia [5, 15]. Однако это выходит за рамки данного исследования.

Продукционные характеристики исследованного штамма VKM Al-132 оказались сопоставимы с полученными нами ранее для других видов порядка Sphaeropleales: у C. rubescens и C. zofingiensis доля ККар в суммарных Кар достигала 42–68% и 92–95% соответственно. Доля эфиров астаксантина в суммарных Кар достигала 19–28% у C. rubescens и 43–47% у C. zofingiensis, а кантаксантина – 8–19% и 25–31% соответственно [26, 29]. Отличительной чертой C. eremi оказалось значительное содержание лютеина (около 2.5% от суммарных Кар) в красных клетках, чего не наблюдали у ранее исследованных видов. Характерной оказалась относительно невысокая массовая доля всех форм астаксантина (немногим более 36%), а в каротиноидном спектре явно преобладали кантаксантин и диэфиры астаксантина. Сходство каротиноидного состава C. eremi с таковым у микроводорослей порядка Sphaeropleales (представители родов Chromochloris, Bracteacoccus, Coelastrella) и Chlamydomonadales (Pseudospongiococcum) может свидетельствовать о сходстве путей биосинтеза астаксантина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам микроскопирования и молекулярно-генетического анализа гена 18S рРНК была установлена таксономическая принадлежность штамма VKM Al-132 к роду Chlorosarcinopsis клады Arenicolinia (Chlamydomonadales, Chlorophyta). Использование более вариабельного маркера ITS2 позволило идентифицировать штамм как C. eremi. Его физиолого-биохимические показатели в условиях двухстадийной накопительной культуры хорошо сопоставимы с результатами, полученными ранее для каротиногенных зеленых микроводорослей порядка Sphaeropleales. В каротиноидном спектре C. eremi преобладали высокоценные ККар (кантаксантин и эфиры адониксантина и астаксантина). Исследуемый штамм может быть потенциально перспективным объектом дальнейших исследований, направленных на подбор оптимальных условий культивирования на обеих стадиях (температурный и световой режим, обеспеченность культур питательными веществами, характер стресс-воздействия и пр.) для интенсификации процесса биосинтеза кетокаротиноидов.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерствa науки и высшего образования Российской Федерации (№ 075-15-2021-1051) и в рамках государственного задания “Комплексное исследование механизмов функционирования морских биотехнологических комплексов с целью получения биологически активных веществ из гидробионтов” (№ 124022400152-1).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.

 

1 Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: 10.31857/S0015330324060159

×

About the authors

Н. В. Данцюк

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН

Author for correspondence.
Email: nterent@mail.ru
Russian Federation, Севастополь

И. Н. Чубчикова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН

Email: nterent@mail.ru
Russian Federation, Севастополь

А. Д. Темралеева

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН

Email: nterent@mail.ru

Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ)

Russian Federation, Пущино

Г. С. Минюк

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН

Email: nterent@mail.ru
Russian Federation, Севастополь

В. В. Дробецкая

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН

Email: nterent@mail.ru
Russian Federation, Севастополь

References

  1. Groover R.D., Bold H.C. The taxonomy and comparative physiology of the Chlorosarcinales and certain other edaphic algae // Phycological studies VIII / Austin, Texas, USA. Univ. Texas Publications. 1969. № 6907. Р. 1.
  2. Андреева В.М. Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales) / Спб.: Наука, 1998. 351 с.
  3. Friedl T., O’Kelly C.J. Phylogenetic relationships of green algae assigned to the genus Planophila (Chlorophyta): evidence from 18S rDNA sequence data and ultrastructure // Eur. J. Phycol. 2002. V. 37. Р. 373. https://doi.org/10.1017/S0967026202003712
  4. Friedl T. Evolution of the polyphyletic genus Pleurastrum (Chlorophyta): inferences from nuclear-encoded ribosomal DNA sequences and motile cell ultrastructure // Phycol. 1996. V. 35. Р. 456. https://doi.org/10.2216/i0031-8884-35-5-456.1
  5. Watanabe S., Mitsui K., Nakayama T., Inouye I. Phylogenetic relationships and taxonomy of sarcinoid green algae: Chlorosarcinopsis, Desmotetra, Sarcinochlamys gen. nov., Neochlorosarcina, and Chlorosphaeropsis (Chlorophyceae, Chlorophyta) // J. Phycol. 2006. V. 42. Р. 679. https://doi.org/10.1111/j.1529-8817.2006.00196.x
  6. Соловченко А.Е. Физиология и адаптивное значение вторичного каротиногенеза у зеленых микроводорослей // Физиология растений. 2013. Т. 60. С. 3. https://doi.org/10.7868/S0015330313010089
  7. Jeffers T.L., Roth M.S. Revealing mechanisms of algal astaxanthin production and bioengineering potential using multiomics // Global Perspectives on Astaxanthin: From Industrial Production to Food, Health, and Pharmaceutical Applications / Eds. G.A. Ravishankar, R.R. Ambati. 2021. P. 181. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-823304-7.00010-6 0
  8. Chekanov K. Diversity and distribution of carotenogenic algae in Europe: A review // Mar. Drugs. 2023. V. 21. Р. 108. https://doi.org/10.3390/md21020108
  9. Cherdchukeattisak P., Fraser P.D., Purton S., Brocklehurst T.W. Detection and enhancement of ketocarotenoid accumulation in the newly isolated sarcinoid green microalga Chlorosarcinopsis PY02 // Biology. 2018. V. 7. Р. 1. http://dx.doi.org/10.3390/biology7010017
  10. Fučíková K., Lewis P.O., Neupane S., Karol K.G., Lewis L.A. Order, please! Uncertainty in the ordinal-level classification of Chlorophyceae // Peer J. 2019. V. 7 e6899. https://doi.org/10.7717/peerj.6899
  11. Khani-Juyabad F., Mohammadi P., Zarrabi M. Comparative analysis of Chlorosarcinopsis eremi mitochondrial genome with some Chlamydomonadales algae // Physiol. Mol. Biol. Plants. 2019. V. 25. Р. 1301. https://doi.org/10.1007/s12298-019-00696-y
  12. Чубчикова И.Н., Дробецкая И.В., Данцюк Н.В., Челебиева Э.С. Оптимизация метода фиксации пресноводных микроводорослей (Scenedesmaceae, Chlorophyta) для первичной идентификации с использованием сканирующей электронной микроскопии // Вопросы современной альгологии. 2022. № 1. С. 102. https://doi.org/10.33624/2311-0147-2022-1(28)-102-109
  13. Katana A., Kwiatowski J., Spalik K., Zakrys B., Szalacha E., Szymanska H. Phylogenetic position of Koliella (Chlorophyta) as inferred from nuclear and chloroplast small subunit rDNA // J. Phycol. 2001. V. 37. Р. 443.
  14. White T.J., Bruns T.D., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics // PCR protocols, a guide to methods and applications / Eds. M.A. Innis et al. Academic Press. San Diego. 1990. P. 315. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1
  15. Nakada T., Misawa K., Nozaki H. Molecular systematics of Volvocales (Chlorophyceae, Chlorophyta) based on exhaustive 18S rRNA phylogenetic analyses // Mol. Phylogenet. Evol. 2008. V. 48. P. 281. https://doi: 10.1016/j.ympev.2008.03.016
  16. Nakada T., Soga T., Tomita M., Nozaki H. Chlorogonium complexum sp. nov. (Volvocales, Chlorophyceae), and morphological evolution of Chlorogonium // Eur. J. Phycol. 2010. V. 45. Р. 97. https://doi.org/10.1080/09670260903383263
  17. Минюк Г.С., Челебиева Э.С., Чубчикова И.Н. Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры // Альгология. 2015. Т. 25. С. 21. http://dx.doi.org/10.15407/alg25.01.02
  18. Bischoff H.W., Bold H.C. Some soil algae from enchanted rock and related algal species // Phycol. Stud. 1963. V. 4. P. 1.
  19. Минюк Г.С., Чубчикова И.Н., Дробецкая И.В., Данцюк Н.В., Челебиева Э.С. РФ Патент 2661086, 2018.
  20. Vonshak A. Microalgae: Laboratory growth techniques and outdoor biomass production // Techniques in Bioproductivity and Photosynthesis / Eds. J. Coombs et al. Pergamon Press. Oxford. 1985. P. 188.
  21. Solovchenko A., Merzlyak M., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. Coordinated carotenoid and lipid syntheses induced in Parietochloris incisa (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) mutant deficient in Δ5 desaturase by nitrogen starvation and high light // J. Phycol. 2010. V. 46. P. 763. http://dx.doi.org/10.1111/j.1529-8817.2010.00849.x
  22. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic membranes // Meth. Enzym. 1987. V. 148. P. 350.
  23. Дробецкая И.В, Минюк Г.С., Чубчикова И.Н., Боровков А.Б. Определение содержания астаксантина и кантаксантина у зеленых микроводорослей методом тонкослойной хроматографии // Экология моря. 2009. Спец. вып. 79. Биотехнология водорослей. С. 50.
  24. Чубчикова И.Н., Дробецкая И.В. Оценка антирадикальной активности вторичных каротиноидов у четырех видов зеленых микроводорослей порядка Sphaeropleales в системе in vitro // Труды Карадагской научной станции им. Т.И. Вяземского – природного заповедника РАН. 2020. Вып. 2. С. 66. https://doi.org/10.21072/eco.2021.14.07
  25. Чубчикова И.Н., Дробецкая И.В., Минюк Г.С., Данцюк Н.В., Челебиева Э.С. Скрининг одноклеточных зеленых водорослей как потенциальных источников природных кетокаротиноидов. 2. Особенности роста и вторичного каротиногенеза у представителей рода Bracteacoccus (Chlorophyсeae) // Морск. экол. журн. 2011. Т. 10. С. 91.
  26. Minyuk G., Chelebieva E., Chubchikova I., Dantsyuk N., Drobetskaya I., Sakhon E., Chekanov K., Solovchenko A. Stress-induced secondary carotenogenesis in Coelastrella rubescens, a producer of value-added keto-carotenoids // Algae. 2017. V. 32. P. 245. https://doi.org/10.4490/algae.2017.32.8.6
  27. Ali H.E.A., Vorisek F., Dowd S.E., Kesner S., Song Y., Qian D., Crocker M. Formation of lutein, ß-carotene and astaxanthin in a Coelastrella sp. isolate // Molecules. 2022. V. 27. P. 6950. https://doi.org/10.3390/molecules27206950
  28. Orosa M., Torres E., Fidalgo P., Abalde J. Production and analysis of secondary carotenoids in green algae // J. Appl. Phycol. 2000. V. 12. P. 553.
  29. Minyuk G., Sidorov R., Solovchenko A. Effect of nitrogen source on the growth, lipid, and valuable carotenoid production in the green microalga Chromochloris zofingiensis // J. Appl. Phycol. 2020. V. 32. P. 923. https://doi.org/10.1007/s10811-020-02060-0

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Strain C. eremi VKM Al-132. a – young vegetative cells (SEM). Light microscopy: b – “naked” zoospores, c – sarcinoid packages, d – mucous complex complexes of cells. Scale: a – 2 microns, b, C, d – 10 microns.

Download (178KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Phylogenetic position of the VKM Al-132 strain on the 18S rRNA gene tree (1737 bp). Bootstrap values are indicated as statistical support for tree nodes (<70% are not shown). The model of nucleotide substitutions: GTR + I + G. Notation: the strain under study is highlighted in bold, * is the authentic strain; (T) is the type species.

Download (579KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Dynamics of biomass (SB) of the C. eremi strain VKM Al-132, at the “green” (I) and “red" (II) stages of the experiment (X ± m).

Download (68KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Dynamics of pigment composition in culture and biomass of the strain C. eremi VKM Al-132, at the “green” (I) and “red" (II) stages of the experiment: a, g – Cl a, b, d – Cl b, c, e – total Kars (X ± m).

Download (196KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Strain VKM Al-132 at different stages of the experiment: (a) – “green", (b) – “red". The scale is 15 microns.

Download (189KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. Culture of C. eremi VKM Al-132 (a) and chromatogram of carotenoids (b) at the end of the “red” stage. 1 – lutein, 2 – adonixanthine (monoesters), 3 – astaxanthin (monoesters), 4 – canthaxanthin, 5 – adonirubin (esters), 6 – astaxanthin (diesters), 7 – β-carotene.

Download (111KB)
Indexing metadata
8. Fig. 7. Spectra of acetone extracts of carotenoids of the C. eremi strain VKM Al-132 at the end of the “red” stage of the experiment. 1 – lutein, 2– β-carotene, 3 – canthaxanthin, 4 – adonixanthin (monoesters), 5 – astaxanthin (diesters), 6 – astaxanthin (monoesters), 7 – adonirubin (monoesters), 8 – echinenone.

Download (183KB)
Indexing metadata
9. Supplement
Download (37KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».