Эффект неполного нокаутирования гена пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1 на метаболизм углеводов и каротиноидов в листьях Nicotiana tabacum L.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ¹

Крахмал представляет собой смесь полисахаридов – линейной амилозы и разветвленного амилопектина, состоящих из мономеров α-глюкозы, связанных α-1,4-глюкозидными связями [1]. В процессе фотосинтеза растения накапливают данный α-1,4-полиглюкан в хлоропластах и затем используют его в ночное время в качестве источника энергии (транзиторный крахмал) или хранят в гетеротрофных органах (запасаемый крахмал) [1]. От особенностей регуляции метаболизма крахмала зависит развитие, стрессоустойчивость и урожайность культурных растений, а также питательность клубней, плодов или зерен [2, 3].

Известны ферменты, участвующие в синтезе и деградации крахмала, а также молекулярно-генетические механизмы регуляции данных путей [1, 2, 4]. Синтез крахмала начинается с катализа АДФ-глюкозопирофосфорилазой (AGP) образования АДФ глюкозы, который утилизируется синтазами крахмала (SS) с образованием линейных цепей α-1,4-глюкана. Один изофермент синтазы крахмала отвечает за синтез амилозы, тогда как другие участвуют в инициации формирования гранул крахмала и синтезе амилопектина. Точки ветвления внутри амилопектина вводятся изоферментами разветвления крахмала (SBE), и лишние α-1,6-звенья удаляются изоамилазами [2].

Деградацию крахмала запускают α-глюкан водная дикиназа (GWD) и фосфоглюкан-водная дикиназа (PWD), которые нарушают поверхностную структуру гранулы крахмала, делая цепи доступными для α-, β- и изоамилаз [2, 5]. Образующиеся молекулы мальтозы и мальтотриозы расщепляются с высвобождением глюкозы с помощью диспропорционирующих ферментов DPE1 и DPE2, соответственно [5].

Помимо ферментов синтеза или распада крахмала существуют α-глюканфосфорилазы (крахмалфосфорилазы, КФ 2.4.1.1), которые могут участвовать в обоих процессах [6–8]. В зависимости от внутриклеточной локализации и сродства к молекуле крахмала выделяют цитозольные (H-тип, PHO2, высокое сродство к линейным и разветвленным гликанам) и эволюционно более молодые пластидные (L-тип, PHO1, низкое сродство к разветвленным гликанам и гетерогликанам) изоферменты [6, 9]. Крахмалфосфорилаза PHO1 отличается от PHO2 наличием N-концевого транзитного пептида и характерной вставки L78 [10]. Обе формы способствуют распаду (фосфоролизу) амилопектина, амилозы и мальтодекстрина [11]. Изофермент PHO2 участвует в сложном метаболизме растворимых гетерогликанов в цитозоле, куда они экспортируются во время деградации крахмала [12, 13].

Изофермент PHO1 считается основной формой фосфорилазы в растении [4, 14], поскольку функционирует в пластидах, осуществляя 96% общей фосфорилазной активности у риса (Oryza sativa) [15] и являясь вторым по распространенности белком в строме амилопластов кукурузы Zea mays [16]. Между уровнем экспрессии гена PHO1-L1 и содержанием крахмала в плодах тыквы (Cucurbita sp.) присутствует прямая взаимосвязь [17]. Показано участие PHO1 в инициации синтеза запасаемого крахмала в эндосперме ячменного (Hordeum vulgare) и рисового зерна [7, 15, 18], а также в клубнях картофеля (Solanum tuberosum) [8, 19, 20].

Изменения метаболизма крахмала являются одной из первых биохимических реакций растений на сигналы окружающей среды. Фермент PHO1 может выступать как переключатель между синтезом и деградацией крахмала, необходимый для корректировки роста и развития растения в ответ на воздействие стрессовых факторов. К примеру, отсутствие экспрессии PHO1 (PHS1) делает растения Arabidopsis thaliana значительно более чувствительными к засухе [14]. Каталитическая активность и сродство изофермента PHO1 к разветвленным α-глюканам и глюкозо-1-фосфату зависят от температуры [15]. Если в нормальных условиях снижение экспрессии PHO1 не меняет морфологию ячменного зерна [21] и клубней картофеля [9], то при низкой температуре это приводит к уменьшению размера рисового зерна и содержания крахмала в нем [15]. Рост экспрессии PHO1 при низких температурах стимулирует синтез коротких цепей декстринов (основа молекул амилозы) [20] и сопровождается накоплением редуцирующих сахаров в клубнях картофеля [22].

У видов семейства Пасленовых (картофель и томат) описаны два изофермента пластидной крахмалфосфорилазы – PHO1a (L-1) и PHO1b (L-2) [9, 23–26]. Белки гомологичны (идентичность 81–84%) с наибольшей вариабельностью в области N-концевого транзитного пептида и домена L78 [23]. PHO1a транскрибируется как в листьях, так и в клубнях, тогда как PHO1b ‒ в основном, в листьях; в клубнях белок PHO1a образует гомодимер, а в листьях – как гомодимер, так и гетеродимер с PHO1b [23]. Таким образом, из двух пластидных изоферментов роль PHO1a может быть более важна и функционально широка, чем PHO1b. В пользу этого свидетельствует прямая взаимосвязь между уровнем экспрессии гена PHO1a и содержанием крахмала в плодах томата (Solanum lycopersicum) [24] и в листьях растений картофеля при воздействии холода [25]. Также продемонстрирована необходимость PHO1a для нормального формирования гранул крахмала в клубнях картофеля, подстрахованная наличием в геноме дуплицированной копии гена [27]. Нокаут PHO1a вызывает снижение содержания крахмала в клубнях в основном за счет уменьшения количества амилозы, при этом не отменяет, но усиливает эффект холодового осахаривания [27]. Миссенс-мутация G261V в функциональном домене PHO1a приводит к изменениям морфологии корней и надземной части растения картофеля, а также содержания крахмала и экспрессии генов метаболизма крахмала в корнях и листьях, в том числе в ответ на воздействие холодового стресса [26].

В данном исследовании мы использовали систему CRISPR-Cas9 для редактирования гена PHO1-L1 (гомолога PHO1a картофеля) в геноме Nicotiana tabacum в рамках расширения данных о роли пластидной крахмалфосфорилазы в развитии растения. Нами были получены независимые трансгенные линии, химерные по нокауту PHO1-L1 за счет нескольких одновременных делеций с последующим сдвигом рамки считывания. Неполный нокаут гена вызвал изменения в содержании углеводов (крахмал, сахароза, глюкоза, фруктоза), хлорофиллов и каротиноидов в листовой ткани проростков. Кроме того, обнаружены сдвиги в уровне экспрессии PHO1-L1, других генов метаболизма крахмала (NtBAM1, NtBAM9, NtGWD, NtAI) и каротиноидов (NtPSY2, NtPDS, NtZDS, NtCRTISO, NtVDE), а также генов MADS-доменных транскрипционных факторов (ТФ) (NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3, NtANR1, NtFUL1). Наши результаты говорят о значимости изофермента PHO1-L1 в метаболизме крахмала и развитии растения, включая фотосинтез и стрессовый ответ, а также допускают возможность непрямого участия PHO1a в регуляции стресс-чувствительных MADS-box генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В исследовании использована культура in vitro табака – растения Nicotiana tabacum L. (сорт Samsun) на стадии 5–7 листьев, выращенные на MС-среде (Sigma-Aldrich, США), содержащей 0.7% агара и 1.0% сахарозы, в климатической камере (16-часовой фотопериод; 21°C).

Геномное редактирование табака с помощью системы CRISPR-Cas9. Для геномного редактирования табака использовали бинарный вектор p201N-PHO1a-gRNA, полученный и успешно примененный ранее для редактирования гена PHO1a в геноме S. tuberosum [26].

Предварительно была проведена оценка соответствия последовательности гидовой РНК (gRNA) PHO1a картофеля соответствующему участку гена NtPHO1-L1 табака (NCBI Gene ID 107814807). Конструкция собрана на основе бинарного вектора p201N_Cas9 (AddGene, Watertown, MA, США; кат. № 59175; https://www.addgene.org/), Т-область которого включает гены Cas9 (под контролем двойного промотора CaMV35S) и NPTII (устойчивость к канамицину (Km)), а также кассету экспрессии gRNA (промотор U6.6 Medicago truncatula) [28]).

Конструкцией с gRNA, а также пустым вектором p201N, трансформировали штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Суспензию агробактерии p201N-NtPHO1-L1-gRNA (опыт) и p201N (контроль), полученную из 5 мл ночной культуры, использовали для трансформации табака, как это описано ранее [29]. Вкратце: листовые экспланты табака, инфицированные соответствующим агробактериальным штаммом, культивировали на питательной среде А3 (минеральный состав и витамины как в MС-среде, 2% глюкоза, 0.7% Plant-агар, 0.1 мг/мл НУК, 1 мг/мл БАП, pH 5.5) для каллусо- и побегообразования [29], одновременно содержащей 500 мг/мл карбенициллина (подавление роста агробактерии) и 100 мг/мл канамицина (селективный антибиотик). Образующиеся на каллусе зеленые побеги срезали и укореняли на свежей среде А3, не содержащей фитогормонов. Регенеранты, устойчивые к канамицину, то есть укоренившиеся и давшие первые листья зеленой окраски, адаптировали к условиям теплицы (16-часовой фотопериод; 21°C) и выращивали до созревания семян. Из листовой ткани регенерантов выделяли геномную ДНК и с помощью ПЦР с праймерами, специфичными к последовательности генов NPTII (канамицин-резистентность растения) и virB (ген агробактерии, участвующий в переносе Т-ДНК), подтверждали присутствие трансгена в геноме растения и отсутствие остаточного заражения агробактерией. Всего было получено 17 независимых регенерантов с конструкцией p201N-NtPHO1-L1-gRNA (опыт; Nt1–Nt17) и 13 – p201N (контроль), 12 и 8 из которых, соответственно, оказались трансгенными. У данных растений анализировали редактируемую область гена NtPHO1-L1 (см. следующий пункт), на основе чего выбирали трансгенные линии, в геноме которых произошло событие редактирования NtPHO1-L1. Из 12 независимых трансгенных линий только растение Nt1 показало данный эффект. Семена данного растения проращивали на среде А3 с 100 мг/мл канамицина, и устойчивые проростки поколения Т₁ в количестве 20 шт. адаптировали к теплице и анализировали в сравнении с контролем (сроки инициации цветения, морфологические характеристики; последовательность целевого сайта редактирования; уровень экспрессии генов). При анализе морфологических параметров использовали: среднее значение по 20 растениям контроля vs. средние значения по всем 20 растениям Т₁; среднее значение по 20 растениям контроля vs. значение параметра для каждой отдельной отобранной линии Т₁.

Анализ редактируемой области гена NtPHO1-L1. Геномную ДНК выделяли из листовой ткани трансгенного побега (первично полученные регенеранты поколения Т₀) с помощью стандартного СТАВ-метода. С использованием соответствующих праймеров (табл. 1, Дополнительные материалы) амплифицировали участок гена NtPHO1-L1, содержащий сайт редактирования (последовательность гидовой РНК): программа ПЦР – 5 мин, 95°С; 35 циклов (30 с, 95°С; 30 с, 59°С; 1 мин, 72°С); 10 мин, 72°С. Продукты ПЦР ожидаемого размера (641 пн) очищали выделением из агарозного геля (QIAEX® II Gel Extraction Kit, QIAGEN, Германия), клонировали в вектор pGEM®-T Easy (pGEM®-T Easy Vector System I, Promega, США) и секвенировали по 10 плазмидных клонов (ABI PRISM 3730 DNA Analyzer, ЦКП “Биоинженерия”, ФИЦ Биотехнологии РАН).

Анализ экспрессии генов. Верхушечные листья проростка (в фазе развития 5–7 листа) растирали в жидком азоте и из 0.2–0.5 г выделяли суммарную РНК (RNeasy Plant Mini Kit и RNase-free DNase set, QIAGEN, Германия) с последующим синтезом кДНК (GoScript Reverse Transcription System, Promega, США). Полученный препарат кДНК в количестве 3 нг использовали для проведения количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США). Последовательности ген-специфичных праймеров для ПЦР-РВ приведены в таблице 1 Дополнительных материалов [29]. Для реакции применены: стандартная программа (5 мин, 95°С, 40 циклов (15 с, 95°С; 40 с, 60°С)); “Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I” (кат. № R-402, Синтол, Россия); референсный ген Actin-7 (LOC107831145) N. tabacum [29].

Анализ содержания каротиноидов, хлорофиллов и углеводов. Количество (мкг/г сырого веса) хлорофиллов (a и b) и каротиноидов определяли в ткани верхушечных листьев проростка (фаза развития 5–7 листа; те же тканевые пробы, что и для анализа экспрессии генов), согласно [29], с регистрацией спектров поглощения с помощью Eppendorf BioSpectrometer® basic (Eppendorf, Германия).

В той же ткани определяли содержание крахмала и сахаров (мг/г сырого веса). В случае крахмала – ~0.5 г ткани растирали, суспендировали в 4.5 мл 33% (об./об.) ДМСО, содержащего 0.44 М соляной кислоты, инкубировали 30 мин при 60°С на водяной бане, охлаждали до 25°C и разводили водой в соотношении 1:5. Далее доводили pH до 4.5 с помощью 5 М NaOH и фильтровали суспензию через Miracloth (Merck, США). Содержание крахмала (мг/г сырого веса) измеряли в 100 мкл фильтрата с использованием набора Starch (BoehringerMannheim/R-Biopharm, Швейцария). Содержание сахаров (сахароза, глюкоза, фруктоза) определяли с помощью тестов Enzytec™ Liquid Sucrose/D-Glucose и Enzytec™ Liquid D-Glucose/D-Fructose (R-Biopharm AG, Германия).

Структурный анализ и статистическая обработка данных. Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью NCBI-BLAST, NCBI-CDD (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/). Для анализа влияния замещений аминокислотных остатков (ао) на структуру и функцию редактированных белков использовали PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php; “deleterious variant if score < –2.5”) и Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index; анализ 3D структуры белка). Поиск сайтов связывания с MADS-доменными ТФ в промоторе гена осуществляли с помощью программы PLACE (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace).

Данные биохимического и экспрессионного анализа статистически обрабатывали с помощью Graph Pad Prism v. 8 (https://www.graphpad.com, США), применяя для оценки значимости различий One-way ANOVA (“multiple comparisons, corrected with Bonferroni test”). Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) на основе двух биологических и трех технических повторов (различие достоверно при значении P < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Трансгенные линии табака N. tabacum с редактированным геном NtPHO1-L1. Поиск в геноме N. tabacum обнаружил два паралогичных гена пластидной формы крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1, гомологичной PHO1a картофеля: LOC107814807 (два варианта мРНК – X1 (XM_016640265.1) и X2 (XM_016640266.1)) и LOC107810306 (один вариант мРНК (XM_016635072.1)). Гены отличаются локализацией (разные скаффолды), количеством экзонов (16 и 15, соответственно) и размером (9533 и 9490 пн). В сравнении с изоферментом LOC107810306 (976 ао), изоформа X2 (977 ао, LOC107814807) характеризуется 13 замещениями ао и инсерцией E590. Обе последовательности отличаются от изоформы X1 (1011 ао, LOC107814807) размером (за счет делеции 34 ао E74–G107 в N-концевой области); остальная последовательность X2 идентична X1.

Сравнительный анализ всех трех возможных кодирующих последовательностей показал, что гидовая РНК (gRNA) 5’-gatcagatggaaagaggtattgg-3’, которая была использована ранее для редактирования гена PHO1a картофеля [26], подходит и для редактирования обеих версий гена NtPHO1-L1 табака. Данный участок локализован в положении 1109–1131 н (мРНК XM_016635072.1 гена LOC107810306; экзон XI) и 1141–1163/1039–1061 н (мРНК изоформ X1 (XM_016640265.1)/X2 (XM_016640266.1) гена LOC107814807; в экзонах VI и V, соответственно). В целевой последовательности мРНК гена LOC107810306 присутствовала замена (1124g→a положение в мРНК; или 16g→a – в gRNA).

Выбранная нами последовательность gRNA не совпадала по локализации с gRNA, использованной в недавнем исследовании нокаута PHO1a в геноме картофеля [27]. Участок gRNA (5′-gctgttgcaaagaatgcctt-3′) из этой работы локализуется в мРНК NtPHO1-L1 табака в положениях 631–650 н (LOC107810306) и 663–682/561–580 н (изоформы X1/X2, LOC107814807). Поэтому в результате нокаута NtPHO1-L1 растения табака должны формировать белковые молекулы в 2 раза длиннее, чем в работе [27].

Также было определено, что выбранная нами последовательность gRNA не гомологична кДНК гена NtPHO1-L2 (XM_016590767.1, LOC107771409), кодирующего изофермент L-2 α-1,4-глюканфосфорилазы.

В результате агробактериальной трансформации табака векторной конструкцией, содержащей выбранную gRNA, было получено 12 независимых, устойчивых к антибиотику канамицину регенерантов Т₀ и с помощью ПЦР на геномной ДНК подтверждено присутствие в геноме переносимой кассеты для редактирования. Внешне растения Т₀ не отличались по морфологическим признакам ни от нетрансгенных линий, ни от трансгенных линий, трансформированных пустым вектором p201N.

На геномной ДНК линий был амплифицирован фрагмент, содержащий целевой сайт редактирования. Клонирование и секвенирование фрагмента выявило несколько событий редактирования в геноме растения Nt1. Пять из 10 секвенированных вариантов целевого сайта соответствовали дикому типу (LOC107810306 и LOC107814807). Остальные содержали пять вариантов делеций: (1) a13–g17→del(5nt)#; (2) a13–t18→del(6nt)#; (3) a11–g17→del(7nt)#; (4) a/g16–g17→del(2nt)#; (5) a11–t18→del(8nt)# (из-за разной длины трех вариантов транскриптов NtPHO1-L1 локализация делеций указана по целевому участку 5’-gatcagatggaaagaggtattgg-3’) (рис. 1а).

 

Рис. 1. Результаты редактирования гена пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1: (а) ‒ выравнивание целевой (редактируемой) кодирующей последовательности гена NtPHO1-L1 (клоны 1–10 редактированной линии Nt1 в сравнении с нередактированной последовательностью генов LOC107810306 и LOC107814807); (б) ‒ выравнивание вариантов редактированной белковой последовательности NtPHO1-L1 в сравнении с нередактированной версией (LOC107810306 и LOC107814807); (в) ‒ сравнительный анализ вторичной структуры нередактированного фермента NtPHO1-L1 и белка с внесенным в результате редактирования замещением KRY→N. Показан фрагмент последовательности, где произошло замещение (отмечено стрелкой). Моделирование проведено в программе Phyre2 на основе известной матрицы c5lrbB_ (alpha-1,4 glucan phosphorylase); 86% обеих последовательностей моделировано с достоверностью 100%.

 

Вариантов делеционных событий, указывающих на то, что использованная gRNA была действенна в отношении гена LOC107810306 с заменой 16g→a в целевом сайте, не наблюдалось.

Дальнейший анализ транслируемых последовательностей показал, что варианты 1, 3, 4 и 5 приводят к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременных стоп-кодонов. В варианте 2 произошла делеция 6 нуклеотидов, которые не совпадали с кодирующими аминокислоты кодонами, вследствие чего в белке вместо делеции двух аминокислот три ао были замещены остатком аспарагина (N) (рис. 1б).

В случае гена LOC107810306 (один вариант мРНК XM_016635072.1), кодирующего белок размером 976 ао, вариант 2 составил 974 ао, а варианты 1, 3, 4 и 5 – 286, 280, 285 и 287 ао, соответственно. В случае гена LOC107814807 (изоформа мРНК X1, XM_016640265.1), кодирующего белок размером 1011 ао, вариант 2 составил 1009 ао, а варианты 1, 3, 4 и 5 – 320, 314, 321 и 319 ао, соответственно. В случае гена LOC107814807 (изоформа мРНК X2, XM_016640266.1), кодирующего белок размером 977 ао, вариант 2 составил 975 ао, а варианты 1, 3, 4 и 5 – 286, 280, 287 и 285 ао, соответственно.

Согласно NCBI-CDD, функциональный домен GT35_Glycogen_Phosphorylase (cd04300) расположен на участке 91–970 (LOC107810306), 125–1005 (LOC107814807, X1) и 91–971 (LOC107814807, X2) ао. Данный домен состоит из N- и C-концевых доменов, разделенных участком L78 (в позиции 497–572, 531–607 и 497–572 ао, соответственно), который включает каталитический центр и обеспечивает высокую степень гибкости белка. То есть, варианты 1, 3, 4 и 5 содержат только начало N-концевого домена GT35 и не имеют каталитического центра. Вариант 2 содержит замещение в N-концевом домене GT35 (K274–Y276delinsN, K308–Y310delinsN и K274–Y276delinsN, соответственно) (рис. 1б).

Дальнейший анализ показал, что варианты замещения K–YdelinsN не приходятся на активные каталитические или белок-связывающие сайты (согласно NCBI-CDD), однако являются радикальными (по прогнозу PROVEAN) для всех трех исходных форм белков (score = –8.649/ –8.181/ –8.817). Поэтому три варианта с замещением KKY или KRY на N в последовательности N-концевой области GT35, предположительно, могут иметь функциональные нарушения. В норме, структура N- и C-концевых частей домена GT35 представляет собой укладку Россмана (Rossmann fold), которая, в числе прочего, характеризуются наличием параллельных β-листов (NCBI-CDD). Анализ пространственной структуры белков (Phyre2) показал, что замещения KKY или KRY на N могут привести к потере одного из β-листов (рис. 1в), что свидетельствует в пользу нарушения функции таких белков.

Таким образом, в растении Nt1 могут синтезироваться три варианта белка дикого типа, а также нефункциональные три варианта с замещением K–YdelinsN и 12 значительно укороченных вариантов белка.

Далее были проанализировано поколение Т₁ от линии Nt1, среди которых было отобрано три растения (Nt1-11, Nt1-13, Nt1-15), содержащие все пять вариантов обнаруженных ранее делеций (рис. 2а). Сравнительный морфологический анализ показал, что в среднем поколение Т₁ (20 растений) не отличается от контроля по времени инициации цветения и весу семян с одной коробочки (рис. 2б). В то же время были отмечены статистически значимые изменения у выбранных трех отдельных растений: Nt1-13 имело более короткий стебель; Nt1-15 формировало больше листьев; все три растения Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 образовывали меньше цветков (рис. 2б). Кроме того, визуально была заметна разница в яркости зеленой окраски листьев у Nt1-13 и Nt1-15 в сравнении с контролем (рис. 2а).

 

Рис. 2. Трансгенные линии Nicotiana tabacum (Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15) с мозаично нокаутированным геном пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1 в сравнении с нетрансгенным контролем (WT): (а) ‒ фотографии растений WT, Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 на стадии цветения (масштаб 10 см); (б) ‒ сравнение основных характеристик контрольных (WT, среднее по 20 растениям) и редактированных линий Т1 от Nt1 (среднее по 20 растениям Nt1-1–Nt1-20; далее по графику даны индивидуальные значения для каждого из анализируемых растений Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15). *Р < 0.05 – статистически значимое различие Т1 от Nt1 vs. WT.

 

Содержание углеводов и пигментов в листьях. Присутствие нефункциональных вариантов крахмалфосфорилазы, вероятно может повлиять на содержание, в первую очередь, углеводов, и, как следствие, пигментов, связанных с фотосинтезом, что косвенно подтверждается регистрируемыми нарушениями морфологических параметров и окраски листьев у линий Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15. Нами было определено содержание крахмала, сахарозы, фруктозы, глюкозы, а также суммы каротиноидов и хлорофиллов a и b в листьях трансгенных линий Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 в сравнении с растениями дикого типа.

Было показано, что у всех трех линий Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 значительно повысилось содержание крахмала (в ~10, 37 и 12 раз, соответственно) и фруктозы (в ~8, 2 и 2 раза, соответственно). Количество сахарозы и глюкозы достоверно снизилось у растений Nt1-15 и Nt1-11, соответственно (рис. 3). В сравнении с контролем количество как каротиноидов, так и хлорофиллов в листьях линии Nt1-11 не изменилось, тогда как у редактированных линий Nt1-13 и Nt1-15 значительно уменьшилось; при этом содержание каротиноидов прямо коррелировало с содержанием хлорофиллов (рис. 3). Наблюдаемые различия между редактированными линиями могут быть связаны с разной степенью полноты (как по числу клеток, так и по числу аллелей (4 с учетом двух генов)) произошедшего редактирования.

 

Рис. 3. Содержание крахмала, сахарозы, глюкозы, фруктозы (мг/г сырой массы), суммы каротиноидов и хлорофиллов a и b (мкг/г сырой массы) в листовой ткани растений Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 в сравнении с нетрансгенным контролем WT. *Р < 0.05 – статистически значимое различие Т1 от Nt1 vs. WT.

 

Профиль экспрессии генов метаболизма крахмала и каротиноидов в листьях. Принимая во внимание взаимосвязь и взаимное влияние количества метаболитов и экспрессии соответствующих генов, а также неполное редактирование гена NtPHO1-L1 у линий Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15, мы проверили, в первую очередь, уровень транскриптов гена NtPHO1-L1. В сравнении с контролем количество мРНК гена увеличилось (Nt1-11), не изменилось (Nt1-13) или уменьшилось (Nt1-15) (рис. 4). Далее была определена экспрессия отдельных генов метаболизма крахмала, кодирующих α-глюкан водную дикиназу (NtGWD), β-амилазы (NtBAM1, NtBAM9) и ингибитор амилаз (NtAI). Мы обнаружили, что уровень транскриптов NtGWD не изменился (Nt1-11) или снизился в ~2 раза (Nt1-13, Nt1-15); NtBAM1 – снизился у всех трех линий в ~2 (Nt1-11, Nt1-15) и 1.5 (Nt1-13) раза; NtBAM9 – уменьшился в ~5 раз (Nt1-11), не изменился (Nt1-13) или вырос в ~4 раза (Nt1-15); NtAI – вырос в ~1.5 раза (Nt1-11, Nt1-13) или уменьшился в ~3 раза (Nt1-15) (рис. 4). Профиль экспрессии NtPHO1-L1 и других тестируемых генов метаболизма крахмала (рис. 4) не коррелировал с содержанием крахмала или тестированных сахаров (рис. 3).

 

Рис. 4. Экспрессия генов метаболизма крахмала (NtPHO1-L1, NtGWD, NtBAM1, NtBAM9, NtAI) и биосинтеза каротиноидов (NtPSY2, NtPDS, NtCRTISO, NtZDS, NtVDE) в листовой ткани растений Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 в сравнении с нетрансгенным контролем WT. *Р < 0.05 – статистически значимое различие Т1 от Nt1 vs. WT.

 

Последующий анализ экспрессии генов биосинтеза каротиноидов, кодирующих фитоинсинтазу (NtPSY2), фитоиндесатуразу (NtPDS), цис-транс-каротиноидизомеразу (NtCRTISO), 15-цис-ζ-каротинизомеразу (NtZDS) и виолаксантиндеэпоксидазу (NtVDE), также обнаружил различия в сравнении с контролем. Было показано, что уровень транскриптов NtPSY2 изменился только у Nt1-15 (снизился в ~3 раза); NtPDS – в ~2 раза снизился (Nt1-11, Nt1-13) или поднялся (Nt1-15); NtCRTISO – уменьшился в ~2 раза (Nt1-11), не изменился (Nt1-13) или возрос в ~2.5 раза (Nt1-15); NtZDS – снизился в ~3/1.5 раза (Nt1-11/Nt1-13) или увеличился в ~1.5–2 раза (Nt1-15); NtVDE – снизился в ~3 раза (Nt1-11), не изменился (Nt1-13) или вырос в ~1.5–2 раза (Nt1-15) (рис. 4). Корреляций уровня экспрессии генов каротиногенеза с содержанием каротиноидов выявлено не было. Также не обнаружено взаимосвязи с содержанием крахмала/сахаров и с уровнем транскриптов генов метаболизма крахмала.

Профиль экспрессии MADS-box генов в листьях. Предполагая, что ТФ, гомологичные SEP и FUL, могут участвовать в регуляции транскрипции генов метаболизма крахмала и каротиноидов (согласно [30, 31]), мы проанализировали, во-первых, присутствие сайтов связывания CArG-box в промоторной области анализируемых генов, и, во-вторых, экспрессию MADS-box генов NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3 и NtFUL1 в листьях редактированных растений.

В результате было показано, что промотор (1.5 кб) большинства анализируемых генов содержит по два CArG-box (табл. 1). Ни одного сайта не было найдено в промоторе гена NtPSY2 (оба гомолога), а также в случае одной из двух версий генов NtCRTISO и NtGWD (для NtGWD причина может быть в доступной слишком короткой последовательности промотора – 251 н). Промотор гена NtZDS и второй версии генов NtBAM9 и NtPHO1-L1 содержал только по одному CArG-box (табл. 1).

 

Таблица 1. Наличие CArG-box в последовательности промотора генов метаболизма углеводов и каротиноидов у Nicotiana tabacum

Ген	NCBI ID	Скаффолд (локализация гена)	Локализация промотора (1.5 кб)	Локализация CArG-box в промоторе (CARGCW8GAT)
NtBAM1	LOC107832261	NW_015787824.1 (26358..29662)	24858–26357	416, 1117
NtBAM9	LOC107827956 LOC107780374	NW_015849100.1 (4074..7620, complement) NW_015797716.1 (8065..13004)	7621–9121 7565–8064	1368 1556, 1771
NtGWD	LOC107832610 LOC107775774	NW_015793074.1 (251..14125) NW_015901023.1 (87993..98472, complement)	0–251* 86493–87992	— 878, 1218
NtAI	LOC107802234	NW_015802778.1 (26868..31183)	25368–26867	235, 383, 1710
NtPHO1-L1	LOC107810306 LOC107814807	NW_015804840.1 (2762..12251, complement) NW_015809487.1 (94062..103594)	12252–13751 92562–94061	246 232, 432
NtPSY2	LOC107772713 LOC107761716	NW_015796120.1 (9958..12592) NW_015874368.1 (9940..13765)	8458–9957 8440–9939	— —
NtZDS	LOC107772271	NW_015892502.1 (11995..18341, complement)	18342–19842	964
NtPDS	LOC107816873	NW_015814914.1 (652..8553)	0–651*	270, 418
NtCRTISO	LOC107832559 LOC107791326	NW_015864184.1 (1937..8985, complement) NW_015919655.1 (47476..54454, complement)	8986–10485 54455-55954	— 462, 1675
NtVDE	LOC107780507 LOC107763628	NW_015797768.1 (65794..70434) NW_015880850.1 (21643..26233)	64294-65793 20143-21642	1155, 1597 1272, 1625

*Доступные в NCBI геномные последовательности не позволяют идентифицировать участки промотора размером 1.5 кб.

 

Проведенный далее анализ экспрессии MADS-box генов NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3 и NtFUL1 показал наличие транскриптов NtSEP1, NtSEP2 и NtFUL1 в листьях контроля и всех трех редактированных линий, тогда как мРНК NtSEP3 присутствовала только у Nt1-11 и, почти на порядок меньше, у Nt1-15 (рис. 5). В сравнении с контролем уровень транскриптов NtFUL1 не изменился (Nt1-11, Nt1-13) или снизился в 2-3 раза (Nt1-15); NtSEP1 – не отличался (Nt1-13), в ~3.5 раз вырос (Nt1-11) или в ~1.1 раз снизился (Nt1-15); NtSEP2 – не менялся (Nt1-13) или был в ~1.2/5 раз ниже (Nt1-11/Nt1-15) (рис. 5).

 

Рис. 5. Экспрессия генов MADS-доменных ТФ (NtFUL1, NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3) в листовой ткани растений Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 в сравнении с нетрансгенным контролем WT. *Р < 0.05 – статистически значимое различие Т1 от Nt1 vs. WT.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Подобно другим метаболическим путям, протекающим в растении, регуляция пути метаболизма крахмала зависит от уровней содержания метаболитов, активности ферментов и экспрессии генов, кодирующих ферменты. Помимо ферментов, катализирующих анаболизм или катаболизм α-1,4-полиглюкана, имеется пластидная крахмалфосфорилаза L-типа (PHO1), которая уникальна своим участием и в деградации, и в синтезе крахмала [27]. PHO1 катализирует фосфоролиз глюканов, расположенных на поверхности крахмальных гранул или образующихся в результате деградации крахмала. Происходит высвобождение молекул глюкозо-1-фосфата, который преобразуется в АДФ-глюкозу и далее в АТФ (источник энергии для всех биохимических процессов в растении). То, что глюкозо-1-фосфат дает больше АТФ, чем свободная глюкоза, образующаяся в процессе гидролиза, подчеркивает важность фосфоролиза и, следовательно, крахмалфосфорилаз [1, 2, 4, 27]. Роль PHO1 в синтезе крахмала заключается в образовании под ее действием в пластидах при деградации крахмала мальтоолигосахаридов, которые участвуют в создании праймирующих структур на начальных стадиях инициации крахмальных гранул [8]. Подтверждением данной роли PHO1 является положительная корреляция уровня экспрессии гена PHO1 с содержанием α-1,4-полиглюкана в запасающих органах растения [7, 8, 15, 17–20]. Неясно, есть ли подобная зависимость для транзиторной формы крахмала, поскольку показано, что эффект от выключения активности пластидной крахмалфосфорилазы различается для запасаемого и транзиторного крахмала [27].

Данное исследование было сфокусировано на роли PHO1a в метаболизме транзиторного крахмала, для чего было получено двенадцать независимых трансгенных линий N. tabacum с неполным нокаутом гена пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1 (LOC107814807 и, возможно, LOC107810306) (рис. 1б, в). Растения поколения Т₁ одной из линий (Nt1) внешне незначительно отличались от контроля, за исключением ослабления зеленой окраски листьев у отдельных образцов (Nt1-13, Nt1-15) при сохранении ярко-зеленой окраски другими образцами (например, Nt1-11, отобранный для дальнейшего анализа) (рис. 2а, б). Поскольку все три упомянутых растения характеризовались присутствием всех выявленных пяти вариантов делеций в геноме, сравнительный анализ их реакции на неполный нокаут NtPHO1-L1 мог способствовать пониманию функции данного гена.

Поскольку нашей целью была связь пластидной крахмалфосфорилазы с транзиторным крахмалом, дальнейший анализ проводился на листьях взрослых растений Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15. Тестирование листовой ткани биохимическими методами показало, что даже частичное нокаутирование гена NtPHO1-L1 способно привести к значительному повышению содержания крахмала (рис. 3). Предположительно, это происходит в результате сдвига метаболизма крахмала в сторону его синтеза и, следовательно, может означать, что в норме NtPHO1-L1 оказывает значительное и предпочтительное влияние на деградацию транзиторного крахмала. Полученные нами данные не согласуются с показанным другими исследователями сохранением количества крахмальных гранул в хлоропластах листьев картофеля при снижении уровня экспрессии гена PHO1b или нокауте гена PHO1a [27]. Также отличается показанный эффект от реакции запасаемого крахмала в клубнях картофеля, где нокаут PHO1a привел к снижению содержания крахмала, при этом повышение количества редуцирующих сахаров [27] сходится с нашими результатами только в отношении фруктозы (рис. 3). Это еще раз подтверждает, что PHO1 может вести себя по-разному в отношении двух форм крахмала.

Известна положительная взаимосвязь между процессами биосинтеза крахмала и фотосинтезом [32]. Биохимическое тестирование растений Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 показало отсутствие корреляции между количеством крахмала и накоплением хлорофиллов и каротиноидов как компонентов фотосинтетического аппарата (рис. 3). Так, содержание крахмала было повышенным в листьях всех трех анализируемых линий, при этом только у двух линий произошли изменения в содержании хлорофиллов и каротиноидов в сторону существенного снижения (рис. 3), что отразилось на окраске листьев (рис. 2). Это предполагает существование непрямой, более сложной зависимости между содержанием крахмала и пигментов.

Наблюдаемые изменения содержания крахмала могут влиять на активность других ферментов, связанных с его метаболизмом, экспрессия которых может регулироваться крахмалом как субстратом или продуктом [27]. Для лучшего понимания происходящего мы провели анализ экспрессии основных (помимо крахмалфосфорилазы PHO1) генов деградации крахмала, кодирующих α-глюкан водную дикиназу NtGWD, β-амилазы NtBAM1 и NtBAM9, а также ингибитор α- и β-амилаз NtAI. Гены амилаз были выбраны по гомологии генам β-амилаз картофеля BAM1 и BAM9, о которых известно, что они участвуют в деградации крахмала, действуя в паре: не обладающий каталитической активностью BAM9 связывается одновременно с поверхностью крахмальных гранул и с BAM1, привлекая ферментативно активный BAM1 к областям деградации крахмала [33]. Ингибитор амилаз AI способен связываться с BAM1 и BAM9, блокируя активный центр или изменяя конформацию молекул [34].

Наши данные показали, что гены NtBAM1, NtBAM9 и NtAI под влиянием частичного нокаута NtPHO1-L1 дифференциально экспрессировались в листьях изучаемых линий, но без какой-либо тенденции (рис. 4). Это может свидетельствовать о попытках редактированных растений приспособиться к частично отсутствующей активности крахмалфосфорилазы и адаптировать метаболизм крахмала с привлечением гидролитических ферментов. Отдельные гены меняли свою экспрессию сходным между редактированными растениями образом. Так, уровень мРНК гена каталитически активного NtBAM1 снижался во всех трех линиях, и там же увеличивалось содержание крахмала (рис. 4). Однако, в целом, схема приспособления оказалась специфична для каждого конкретного растения, и регулировка, предположительно, могла осуществляться за счет комбинирования разных уровней экспрессии генов NtGWD (открытие доступа амилазам к грануле крахмала), NtBAM9 (сродство к грануле крахмала и привлечение NtBAM1) и NtAI (ингибирование активности амилаз).

К примеру, у растения Nt1-11 (vs. контроль) уровень транскриптов NtGWD сохранился, однако экспрессия NtBAM1 и NtBAM9 снизилась, а NtAI повысилась (рис. 4). То есть, деградация крахмала может быть снижена за счет ослабления процесса привлечения активного NtBAM1 к грануле, уменьшения количества белка NtBAM1 и роста ингибиторной активности по отношению к амилазам.

У растения Nt1-13 (vs. контроль) уровень транскриптов NtGWD снизился, экспрессия NtBAM9 не изменилась, NtBAM1 снизилась, а NtAI повысилась (рис. 4). Деградация крахмала может быть снижена за счет снижения доступа амилаз к грануле, уменьшения количества активного фермента NtBAM1 и увеличения ингибиторной активности по отношению к амилазам (самое значительное среди образцов увеличение содержания крахмала) (рис. 3).

У растения Nt1-15 (vs. контроль) уровень транскриптов NtGWD снизился, экспрессия NtBAM9 повысилась, а NtBAM1 и NtAI снизилась (рис. 4). Деградация крахмала может быть снижена за счет снижения доступа амилаз к грануле и уменьшения количества активного фермента NtBAM1.

Таким образом, во всех трех случаях произошло замедление гидролиза крахмала и, как следствие, сдвиг метаболизма в сторону синтеза. Если сравнивать с контролем, то, исходя из содержания крахмала (рис. 3), растения Nt1-11 и Nt1-15 более успешно, чем Nt1-13 противостояли частичному нокауту NtPHO1-L1. Если исходить из окраски листьев и параметров растения, то адаптация образца Nt1-11 была более полной, чем Nt1-15. Растения не различались по высоте (рис. 2), листья Nt1-15 были светлее, чем листья Nt1-11 (но зеленее, чем листья Nt1-13), и содержали крахмала меньше, чем Nt1-15, что ближе к контрольному значению (рис. 3).

Успешность приспособления Nt1-11 к частичному нокауту NtPHO1-L1 отразилась и в количестве хлорофиллов/каротиноидов в листовой ткани, которое не отличалось от контроля. Поэтому для большего понимания происходящего нами был проведен анализ экспрессии генов табака, кодирующих ферменты основных этапов биосинтеза каротиноидов – PSY2, PDS, ZDS, CRTISO и VDE. С работы фитоинсинтазы PSY (в фотосинтезирующей ткани активен преимущественно светозависимый, хлоропласт-специфичный изофермент PSY2) начинается синтез каротиноидов. Далее, предшественник каротиноидов 15-цис-фитоин, преобразуется под действием фитоиндесатуразы PDS, ζ-каротиндесатуразы ZDS и цис-транс-каротиноидизомеразы CRTISO в транс-ликопин. Потом синтезируются ксантофиллы, в том числе виолаксантинового цикла, где виолаксантиндеэпоксидаза VDE играет важную роль в регуляции перераспределения энергии света между виолаксантином, зеаксантином (ксантофиллы) и хлорофиллом a [35].

В результате было показано, что образцы Nt1-11, Nt1-13 и Nt1-15 отличаются от контроля уровнем экспрессии большинства проанализированных генов, при этом профиль различий индивидуален для каждого из трех растений (рис. 4). Неполный нокаут NtPHO1-L1 очевидно нарушил согласованную работу ферментов катаболизма крахмала и биосинтеза каротиноидов. При этом каких-либо корреляций с содержанием каротиноидов (рис. 3) выявлено не было.

С регуляцией биосинтеза каротиноидов и углеводов в растениях связывают важнейшие регуляторы развития растений – MADS-доменные ТФ, сайты связывания (консенсус CC(A/T)₆GG, или CArG-box) с которыми обнаружены в регуляторной области почти всех генов каротиногенеза, а также некоторых генов углеводного метаболизма (например, инвертаз, гидролизующих сахарозу) [30]. Взаимодействие подтверждено опытным путем на примере томата при поиске генов-мишеней ТФ RIPENING INHIBITOR (MADS-RIN, подсемейство SEP). ТФ MADS-RIN в комплексе с другими MADS-доменными ТФ – гомологами FRUITFULL (FUL) и AGAMOUS (AG), определяет созревание плода томата; связывание тетрамерных MADS-комплексов с промоторами генов-мишеней задействует два CArG-box мотива [30]. На примере плода банана показано участие MADS-box генов, гомологичных RIN, в регуляции метаболизма крахмала [36].

Проведенный анализ промоторов изучаемых генов деградации крахмала и биосинтеза каротиноидов подтвердил присутствие у большинства генов по два консенсуса CArG-box, необходимых для связывания с комплексом MADS-доменных ТФ (табл. 1). Следовательно, транскрипция генов метаболизма крахмала, как и генов каротиногенеза, может находиться под контролем MADS-доменных ТФ. Таким образом, дифференциальная экспрессия MADS-box генов в ответ на изменение содержания углеводов и каротиноидов, также возможна.

В нашей работе анализируется ткань листа, поэтому мы выбрали для анализа гены NtFUL1, NtSEP1, NtSEP2 и NtSEP3, так как в вегетативной ткани могут экспрессироваться гены подсемейств SEP и FUL [31].

В результате было показано, что у образца Nt1-13, в листе которого наиболее существенно снизилось количество хлорофиллов/каротиноидов и поднялось содержание крахмала, уровень транскриптов всех проанализированных MADS-box генов не отличался от контроля (рис. 5). В то же время у двух других образцов – Nt1-11 и Nt1-15, где количество крахмала выросло, но меньше, чем у Nt1-13, а количество пигментов не изменилось (Nt1-11) или упало (Nt1-15), профиль экспрессии MADS-box генов изменился зависимым от образца образом (рис. 5). Каких-либо корреляций с экспрессией генов деградации крахмала или биосинтеза каротиноидов, а также с содержанием метаболитов в листе выявлено не было. Тем не менее, обнаруженная дифференциальная экспрессия MADS-box генов предполагает их возможное участие в регуляции углеводного метаболизма и биосинтеза каротиноидов в листьях табака.

Таким образом, в данном исследовании мы получили неполный нокаут гена пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1 в геноме N. tabacum с использованием системы CRISPR-Cas9 и проанализировали полученные трансгенные линии на предмет содержания крахмала, сахаров, каротиноидов и хлорофиллов, а также экспрессии генов путей метаболизма крахмала и каротиноидов и регуляторных MADS-box генов. Полученные результаты позволяют предположить, что частичный нокаут гена NtPHO1-L1 может изменять метаболизм транзиторного крахмала в листьях, смещая его в сторону синтеза. Эффект от нокаута распространяется на содержание сахаров, каротиноидов и хлорофиллов, а также профиль экспрессии соответствующих генов. Одним из основных последствий является снижение количества цветков в соцветии, то есть снижение репродукции растения, независимо от того, в какой степени растение смогло нормализовать углеводный обмен. Дифференциальная экспрессия MADS-box генов подсемейств SEP и FUL, а также наличие консенсусов связывания CArG-box в промоторах генов деградации крахмала и синтеза каротиноидов, предполагает участие MADS-доменных ТФ в регуляции метаболизма крахмала и каротиноидов, а также в ответе этих генов на изменение содержания данных метаболитов.

В целом, полученные данные не могут служить основанием для однозначных выводов о роли PHO1 в метаболизме транзиторного крахмала, в том числе из-за неполного нокаутирования гена у редактированных линий. Учитывая участие PHO1 в двух противоположных процессах (синтезе и деградации крахмала), можно предположить, что PHO1 сохраняет свою двойственную роль у мутантных растений, скорее всего, выполняя ее за счет аллелей, не подвергшихся редактированию. В то же время нарушение, вносимое редактированием в функцию PHO1, вызывает изменение содержания крахмала. Это может быть результатом как нарушения уровня активности NtPHO1-L1, так и изменения регуляции других генов метаболизма крахмала в ответ на изменение содержания крахмала. Учитывая разницу в степени изменения содержания крахмала в листьях, можно предположить, что, во-первых, анализируемые растения имеют разный процент нокаутированных по гену клеток. Во-вторых, каждое растение может индивидуальным образом решать проблему, используя значительный генный/ферментный аппарат для восстановления баланса синтеза и деградации крахмала, направленное на выживание и нормализацию поддержания жизненно важных биохимических процессов. Мы полагаем, что наши данные могут быть использованы в дальнейших исследованиях роли пластидной крахмалфосфорилазы PHO1.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ. В работе использована экспериментальная установка искусственного климата (Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.

 

¹ Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: 10.31857/S0015330324050091

Сокращения: ТФ – транскрипционные факторы.

Sobre autores

А. Нежданова

Институт биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: kulakova_97@mail.ru
Rússia, Москва

А. Кулакова

Институт биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Autor responsável pela correspondência
Email: kulakova_97@mail.ru
Rússia, Москва

М. Слугина

Институт биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: kulakova_97@mail.ru
Rússia, Москва

А. Камионская

Институт биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: kulakova_97@mail.ru
Rússia, Москва

Е. Кочиева

Институт биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: kulakova_97@mail.ru
Rússia, Москва

А. Щенникова

Институт биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: kulakova_97@mail.ru
Rússia, Москва

Bibliografia

Arquivos suplementares