Study of a Polymorphic Variant of the Cold Receptor Gene Trpm8 (rs7593557) in 15 Populations of the Altai-Sayan Region and the Far East

Толық мәтін

В связи с тем, что коренные жители Алтае-Саянского нагорья, Западной Сибири и Дальнего Востока проживают на территориях, климатической особенностью которых являются низкие температуры, исследования TRP-ионных каналов актуальны. Восприятие холода играет основную роль в терморегуляции и выживании в холодных условиях, поэтому основным фактором для всех живых организмов является температура окружающей среды.

Гены TRP были открыты при исследовании мутантов Drosophila с нарушением зрения из-за дефицита катионов кальция в фоторецепторах, позже они были найдены во всех многоклеточных организмах [1]. TRP-ионные каналы принимают участие в регуляции метаболизма кальция и магния, роста нейронов, терморецепции, восприятия боли, а также отвечают за передачу температурных, физических и химических стимулов [2]. Всего у млекопитающих известно 30 белков, которые разделяются на семь подсемейств, из них только четыре участвуют в передаче температурного сигнала [2–4]. К холодочувствительным, т. е. активирующимся при понижении температуры, относится только два: TRPА1 (ниже 17 °С) и TRPМ8 (ниже 28 °С) [5].

Ранее проведено исследование гена TRPА1 (rs13268757), активация которого происходит при температуре ниже 17 °С и гена TRPV1 (rs222747), который активируется при температуре выше 42 °С в 15 популяционных выборках, проживающих в разных регионах Северной Азии, Алтае-Саянского нагорья и Канады [6, 7]. Оба полиморфизма являются расоспецифичными [8]. При исследовании гена TRPA1 (rs13268757) у коренных жителей Алтае-Саянского региона, Западной Сибири и Дальнего Востока было выявлено, что данная мутация вероятно возникла в популяции якутов (16.7%) и распространилась по территории России в трех направлениях: восточном, юго-восточном и западном [7]. При изучении гена TRPV1 (rs222747) обнаружено, что наиболее близкими (по частоте данной мутации) к популяциям Восточной Азии были только нанайцы и коряки (56 и 64% соответственно). Сибирские татары, якуты, эвенки наиболее близки к европеоидам. Все популяции Алтае-Саянского региона заняли промежуточное значение между европеоидами и восточными монголоидами. Выявлена отрицательная корреляция между двумя изученными генами –0.545, число степеней свободы df=13, оценка достоверности P-value – 0.048. Полученные данные свидетельствуют о том, что изученные полиморфизмы скоррелированы, что подтверждает ранее полученные данные о том, что присутствие TRPA1 ингибирует функции TRPV1. Результаты, возможно, свидетельствуют о коэволюции данных генов.

Иионный канал TRPM8 является не только холодовым, но и ментоловым, температурный порог активации которого менее 25–28 °С. TRPM8 кодирует катионный канал, который, на сегодняшний день, является единственным известным температурным рецептором, опосредующим эндогенный ответ на умеренный холод. Ген TRPM8 расположен на коротком плече второй хромосомы человека и обладает генетическим разнообразием [9]. При повышенной внутриклеточной концентрации Са²⁺ данный ионный канал может активироваться эвкалиптом и ицилином [10, 11]. TRPM8 обнаружен в эпителиоцитах трахеи и клетках предстательной железы [12], на сенсорных нейронах с малым диаметром заднекорешкового ганглия [13] и на мелких заднекорешковых нейронах с низким порогом температурной активации при охлаждении (около 30 °С) [14], а также при различных типах рака [15].

В связи с вышеизложенным цель данной работы – продолжить исследование генов TRP в 15 популяциях Алтае-Саянского региона, Западной Сибири и Дальнего Востока.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов и исследованные популяции

Образцы крови были собраны в ходе экспедиционных работ 1982–1994 гг. под руководством М.И. Воеводы. Сбор крови проводился из локтевой вены стерильно у добровольцев (взрослых и детей старше десяти лет) с использованием “информированного согласия” обследуемых.

Выборки чукчей были сформированы в поселках Канчалан и Усть-Белая (Анадырского р-на, Чукотского автономного округа), коряков – в п. Оссора (Карагинский район Корякского автономного округа), нанайцев из жителей Хабаровского края, канадских эскимосов – в п. Иглулик (Канада). Выборки эвенков были отобраны из жителей Тындинского р-она, Амурской обл., юкагиров – из п. Нелемное (Верхнеколымского р-на, Республики Саха), якутов – в поселках Тюлях и Верхневелюйск, Республика Саха (табл. 1). Хакасы обследовались в Республике Хакасия, г. Абакан, тувинцы – в Республике Тыва, северные и южные алтайцы и теленгиты – в Усть-Канском, Кош-Агаческом и Турочакском р-нах (Республика Алтай), и шорцы в Мысковском и Таштагольском районах Кемеровской обл., а казахи – в Кош-Агаческом р-не. Выборка татар была сформирована из проживающих в Чановском и Венгеровском р-нах Новосибирской обл. (п. Аул-Тебис, Воробьево, Тебисское, Аул-Кошкуль, Белехта, Чаргары) в ходе экспедиционных работ в 2006–2007 гг. под руководством М.А. Губиной.

Молекулярно-генетические методы

Тотальную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракцией с использованием протеиназы К [16]. Генотипирование было выполнено методом ПЦР в реальном времени на приборе AB StepOnePlus с использованием TaqMan-зондов (Applied Biosystems, USA), следуя стандартному протоколу. Для подтверждения полученных результатов 10% образцов были прогенотипированы повторно с помощью ПЦР с использованием аллель-специфичных праймеров. Нами был проанализирован полиморфный сайт rs7593557 гена TRPM8.

Статистические методы

Межпопуляционные различия оценивали по дистанции F_st [19] с помощью программы Arlequin v.3.5.1.2. Уровень значимости дистанций F_st оценивали стохастически, число перестановок – 100, уровень значимости P=0.05. Вычисление ожидаемой гетерозиготности и статистической достоверности отклонения от равновесия Харди–Вайнберга производилось с помощью программы Arlequin v.3.5.1.2 [20] точным критерием с оценкой Монте–Карло. Число шагов Марковской цепи – 1000000, число обнулений состояния памяти – 100000. Многомерное шкалирование, основанное на частотах генотипов, было посчитано с помощью программы XLStat [21] на основе матрицы попарных различий F_st. Подсчет достоверности регрессии выполнен с помощью программы XLStat.com, для расчета использовалась частота редкого аллеля, а число степеней свободы – это число популяций минус 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведен анализ распространения гена терморецептора TRPM8 (rs7593557) в 15 популяционных выборках (1503 человека), относящихся к различным языковым группам и проживающих в регионах Алтае-Саянского нагорья, Западной Сибири, Дальнего Востока, а также в Канаде (табл. 1).

 

Таблица 1. Лингвистическая принадлежность, размер, место проживания исследованных популяций и размер проанализированных выборок

Популяция	Лингвистическая Принадлежность  [17, 18]	Количество  образцов	Размер популяции,  тыс. человек	Локализация
Тувинцы	Алтайская языковая семья,  тюркская группа	151	235	Республика Тыва
Хакасы	То же	78	80.3	Республика Хакасия
Алтайцы южные	«	210	70.8	Республика Алтай
Алтайцы северные	«	40	80	То же
Казахи	«	131	6540	То же
Шорцы	«	141	16	Кемеровская обл.
Теленгиты	«	62	3.8	Республика Алтай
Сибирские татары	«	188	6.7	Новосибирская обл.
Якуты	«	92	478	Республика Саха
Канадские эскимосы	Эскимосско-алеутская яз. семья, эскимосская группа	15	170	Канада
Чукчи	Палеоазиатская языковая  семья, чукотско-камчатская группа	224	16	Чукотский АО
Коряки	Палеоазиатская языковая семья,  северо-восточная группа	56	8.7	Камчатская обл.
Нанайцы	Алтайская языковая семья, тунгусо-маньчжурская группа	56	16	Хабаровский край
Юкагиры	Уральско-юкагирская языковая семья, юкагирская группа	83	1.6	Республика Саха
Эвенки	Алтайская языковая семья, тунгусо-маньчжурская группа	38	77	Амурская обл.

 

Таблица 2. Частота генотипов и аллелей rs7593557 гена TRPМ8 в исследованных популяциях

Популяции	Южные алтайцы n=193	Теленгиты n=18	Хакасы n=77	Тувинцы n=153	Шорцы n=143	Северные алтайцы n=41	Сибирские татары n=189	Казахи n=132	Канадские  эскимосы n=14	Чукчи n=222	Коряки n=56	Нанайцы n=54	Юкагиры n=68	Эвенки n=35	Якуты n=92
Генотипы
AA	12 (6.2)	4 (22.2)	8 (10.4)	13 (8.5)	7 (4.9)	4 (9.7)	6 (3.2)	12 (9.1)	2 (14.3)	28 (12.6)	6 (10.7)	12 (22.2)	5 (7.4)	5 (14.3)	1 (1.1)
AG	77 (39.9)	7 (38.8)	23 (29.9)	69 (45.1)	56 (39.2)	11 (26.8)	58 (30.7)	66 (50)	2 (14.3)	95 (42.8)	26 (46.4)	22 (40.7)	27 (39.7)	16 (45.7)	18 (19.6)
GG	104 (53.9)	7 (38.8)	46 (59.7)	71 (46.4)	80 (55.9)	26 (63.4)	125 (66.1)	54 (40.9)	10 (71.4)	99 (44.6)	24 (42.9)	20 (37.1)	36 (52.9)	14 (40)	73 (79.3)
Аллель
A	101 (26.2)	15 (41.7)	39 (25.3)	95 (31.0)	70 (24.5)	19 (23.2)	70 (18.5)	90 (34.1)	6 (21.4)	151 (34)	38 (33.9)	46 (42.6)	37 (27.2)	26 (37.1)	20 (10.9)
G	285 (73.8)	2 (58.3)	115 (74.7)	211 (69.0)	216 (75.5)	63 (76.8)	308 (81.5)	174 (65.9)	22 (78.6)	293 (66)	74 (66.1)	62 (57.4)	99 (72.8)	4 (62.8)	164 (89.1)

Примечание. В скобках даны %.

 

В табл. 2 представлены частоты генотипов и аллелей в исследованных популяциях. Самая высокая частота среди популяций Алтае-Саянского региона и Западной Сибири (не только редкого генотипа, но и аллеля) обнаружена у теленгитов (22.2 и 41.7% соответственно), а самая низкая – у сибирских татар (3.2 и 18.5% соответственно). Среди народов севера Сибири и Дальнего Востока высокая частота редкого генотипа и аллеля обнаружена у нанайцев (22.2 и 42.6% соответственно), а самая низкая – у якутов (1.1 и 10.9% соответственно). По данным о частотах генотипов рецептора TRPМ8 (табл. 2) проведен анализ на соответствие равновесию Харди–Вайнберга, отклонений не обнаружено (табл. 3).

 

Таблица 3. Проверка соответствия распределению Харди–Вайнберга гена TRPM8

Гетерозиготность	Канадские эскимосы	Чукчи	Казахи	Эвенки	Якуты	Юкагиры	Хакасы	Теленгиты	Коряки	Нанайцы	Северные алтайцы	Шорцы	Южные алтайцы	Татары	Тувинцы
Ожидаемая	0.349	0.456	0.450	0.473	0.198	0.377	0.380	0.5000	0.456	0.493	0.366	0.372	0.390	0.450	0.432
Наблюдаемая	0.142	0.439	0.496	0.457	0.200	0.375	0.298	0.388	0.472	0.418	0.275	0.391	0.401	0.496	0.456
P-value	0.064	0.652	0.327	1.000	1.000	1.000	0.073	0.378	1.000	0.279	0.178	0.648	0.850	0.329	0.573

 

Таблица 4. Статистически значимые межпопуляционные различия (F_ST)

популяции	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
1	0
2	0.0096	0
3	0.0215	0.0252	0
4	0.0144	0.0000	0.0243	0
5	0.0091	0.0046	0.0056	0.0032	0
6	0.0521	0.0639	0.1421	0.0782	0.0734	0
7	0.0000	0.0028	0.0239	0.0048	0.0037	0.0403	0
8	0.0000	0.0252	0.0231	0.0365	0.0114	0.0397	0.0002	0
9	0.0333	0.0231	0.0067	0.0184	0.0217	0.1878	0.0365	0.0622	0
10	0.0167	0.0000	0.0283	0.0000	0.0044	0.0656	0.0061	0.0331	0.0287	0
11	0.0154	0.0049	0.0423	0.0032	0.0073	0.0298	0.0028	0.0178	0.0598	0.0021	0
12	0.0067	0.0236	0.0331	0.0303	0.0098	0.0263	0.0028	0.0000	0.0756	0.0254	0.0061	0
13	0.0091	0.0000	0.0306	0.0000	0.0051	0.0527	0.0008	0.0237	0.0307	0.0000	0.0001	0.0195	0
14	0.0955	0.0645	0.1639	0.0625	0.0776	0.0317	0.0654	0.1096	0.1904	0.052	0.0271	0.0672	0.0528	0
15	0.0091	0.0046	0.0056	0.0032	0.0000	0.0734	0.0037	0.0114	0.0217	0.0044	0.0073	0.0098	0.0051	0.0776	0

Примечание. 1 – чукчи, 2 – алтайцы, 3 – нанайцы, 4 – северные алтайцы, 5 – казахи, 6 – канадские эскимосы, 7 – тувинцы, 8 – теленгиты, 9 – коряки, 10 – шорцы, 11 – хакасы, 12 – эвенки, 13 – юкагиры, 14 – якуты, 15 – сибирские татары.

 

Статистически значимые межпопуляционные различия (F_ST) гена TRPМ8, приведенные в табл. 4, показывают, что наибольшие различия выявлены между якутами и теленгитами, нанайцами, коряками, казахами, чукчами, тувинцами; хакасами и теленгитами, нанайцами, коряками, эвенками и шорцами; нанайцами и сибирскими татарами. Наиболее близко друг к другу располагаются пять популяций: теленгиты, шорцы, южные и северные алтайцы и казахи, все они относятся к тюркской группе алтайской языковой семьи. На рис. 1 представлены результаты многомерного шкалирования попарных генетических расстояний в исследованных популяциях. Из рисунка следует, что ближе всех друг с другом располагаются теленгиты, нанайцы, коряки, казахи, чукчи и тувинцы.

 

Рис. 1. Многомерное шкалирование попарных генетических расстояний в 15 исследованных популяциях.

 

Нами была проведена трансассоциация полиморфных локусов генов TRPV1, TRPA1 и TRPM8 с помощью метода регрессионного анализа в 14 популяциях. В связи с малой выборкой и отсутствием полиморфизма по гену TRPA1 популяция канадских эскимосов была исключена из всех расчетов. На рис. 2, а–в представлены результаты регрессионного анализа трех пар генов: TRPV1/TRPM8, TRPV1/TRPA и TRPA/TRPM8. Из всех трех пар только в одной – TRPV1/TRPM8 – была выявлена положительная корреляция – 0.55, df=13, P-value – 0.032 (рис. 2, а). Ранее была выявлена отрицательная корреляция (–0.545) в паре TRPV1/TRPA, df=13, P-value – 0.048 (рис. 2, б) [7]. В третьей паре также была выявлена отрицательная корреляция –0.46, df=13, P-value – 0.097 (рис. 2, в). Наши данные свидетельствуют о том, что изученные полиморфизмы генов TRPV1 и TRPM8 скоррелированы между собой и отрицательно скоррелированы с TRPA. Полученные результаты, возможно, свидетельствуют о коэволюции данных генов.

Ранее проведенные исследования полиморфных вариантов (ОНП) rs28901637, rs11562975, rs13004520, rs17868387, rs7593557 и rs11563071 гена холодового рецептора TRPM8 в этнических группах Сибири и Дальнего Востока показали, что состав гаплотипов русских, немцев и хантов наиболее гомогенны. Центральноазиатские монголоиды (казахи, тувинцы, шорцы, хакасы) по частотам гаплотипов были близки, в то время как другие сибирские популяции – чукчи тундровые, чукчи приморские, эскимосы – различались между собой. Основные различия были выявлены по полиморфному локусу в экзоне 11 (rs7593557), между популяциями чукчей и русских. Авторы выдвинули гипотезу, что в процессе колонизации человеком Евразии минорные аллели исследованных ОНП дивергировали в зависимости от структуры rs7593557 в экзоне 11 [22, 23]. Полученные нами данные по TRPM8 (rs7593557)согласуются с ранее полученными результатами по этому полиморфизму.

 

Рис. 2. График линейной регрессии частот полиморфизмов генов TRPV1/TRPM8 (а), TRPV1/TRPA (б) и TRPA/TRPM8 (в) в 14 популяциях.

 

Таким образом, исходя из полученных в настоящем исследовании данных, можно предположить, что мутация rs7593557 гена TRPМ8, вероятнее всего, пришла на Дальний Восток из Восточной Азии и далее распространилась в двух направлениях – восточном и западном. В восточном направлении – у нанайцев (42.6%), эвенков (37.1%), якутов (10.9%), чукчей (34%), коряков (33.9%), юкагиров (27.2%), и далее у канадских эскимосов (21.4%). В западном направлении – на территорию Алтае-Саянского нагорья и Западной Сибири. На территории Алтае-Саянского нагорья частота данной мутации варьирует от 41.7 в популяции теленгитов до 23.2% у северных алтайцев. Самая низкая частота выявлена на территории Западной Сибири у сибирских татар (18.5%). По всей видимости, данная мутация несет на себе ответственность за регуляцию температурного режима, так как высокие частоты выявлены в популяциях, проживающих на территории Дальнего Востока. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что изученные полиморфные варианты генов TRPV1 и TRPM8 скоррелированы между собой и отрицательно скоррелированы с TRPA, что, возможно, свидетельствует о коэволюции данных генов. Ранее было показано, что TRPV1, так же как TRPM8, выявлен с высокой частотой в популяции нанайцев. Вероятно обе мутации этих генов пришли одновременно с Восточной Азии и распространились по территории России; этим объясняется тот факт, что они скоррелированы между собой положительно.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке Бюджетного проекта: № R2022-0021.

Исследование одобрено Этическим комитетом Института цитологии и генетики СО РАН 31.08.2023 г., протокол № 9. Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого участника исследования или его представителя было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

M. Gubina

Federal Research Center, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: marina@bionet.nsc.ru
Ресей, Novosibirsk, 630090

V. Babenko

Federal Research Center, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: marina@bionet.nsc.ru
Ресей, Novosibirsk, 630090

E. Gubina

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: marina@bionet.nsc.ru
Ресей, Moscow, 119991

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар