Sequencing and Annotation of the Chloroplast Genome of  Triticum militinae  – a “Natural Mutant” of Tetraploid Wheat  Triticum timopheevii  Zhuk.

A. R. Kuluev; Кулуев А. Р.; R. T. Matniyazov; Матниязов Р. Т.; B. R. Kuluev; Кулуев Б. Р.; L. Yu. Privalov; Привалов Л. Ю.; A. V. Chemeris; Чемерис А. В.

doi:10.31857/S0016675824080114

Sequencing and Annotation of the Chloroplast Genome of Triticum militinae – a “Natural Mutant” of Tetraploid Wheat Triticum timopheevii Zhuk.

Authors: Kuluev A.R.¹, Matniyazov R.T.¹, Kuluev B.R.¹, Privalov L.Y.¹, Chemeris A.V.¹
Affiliations:
1. Institute of Biochemistry and Genetics – Subdivision of the Federal State Budgetary Scientific Institution of the Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 60, No 8 (2024)
Pages: 118-121
Section: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
URL: https://journal-vniispk.ru/0016-6758/article/view/271464
DOI: https://doi.org/10.31857/S0016675824080114
EDN: https://elibrary.ru/bfgxhu
ID: 271464

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Triticum militinae Zhuk. et Migusch. – tetraploid wheat with the GAA genome, considered a natural naked mutant of T. timopheevii Zhuk. Previously, experiments were conducted for this wheat to study the karyotype and crossing characteristics. To clarify its origin and relationship with other representatives of the wheat family, analysis of the chloroplast genome of T. militinae, which has previously remained unstudied, is of great interest. The sucrose gradient method was used to isolate chloroplast DNA from leaves. Sequencing was performed using the FASTASeq 300 Sequencing Kit V1.0 100 M reads/flow cell on a Genolab M sequencer (GeneMind, China). For the first time, we sequenced and annotated the complete chloroplast genome of T. militinae with a size of 135898 bp. In the structure of the plastid genome there are a pair of inverted repeats with a size of 21552 bp each, the region of a small single copy (SSC) – 12791 bp and the region of a large single copy (LSC) – 80003 bp. As part of the chloroplast genome of T. militinae 132 structural genes were found, of which 85 protein-coding genes, 31 tRNAs and 4 rRNA genes.

Keywords

wheat, Triticum militinae, Triticum timopheevii, chloroplast genome, sequencing

Full Text

Тетраплоидная пшеница Triticum militinae Zhuk. et Migusch. (пшеница Милитины) считается естественным мутантом тетраплоидной пшеницы Triticum timopheevii Zhuk. Процесс обнаружения пшеницы Милитины от момента «выщепления» в посевах T. timopheevii в 1950 г. некоего мутанта до опубликования в 1969 г. информации о новом виде, названном T. militinae Zhuk. et Migusch., занял почти два десятилетия [1]. Но происхождение этого вида оставалось загадочным, и проведя ранее научное исследование, мы пришли к заключению, что это вполне может быть некий гибрид пшениц персидской и Тимофеева [2]. Схожее предположение высказал ранее и Н.А. Наврузбеков, отметивший, что T. militinae обнаруживает сходство с T. persicum ssp. fuliginosum и при скрещивании последней с T. timopheevii в F₁ образовывались черные плотные колосья, похожие на таковые у пшеницы Милитины [3]. Н.А. Наврузбеков заключил, что T. militinae представляет собой продукт интрогрессии части генома T. persicum в геном и цитоплазму T. timopheevii, при этом посчитал ее продуктом гибридизации этих видов. Но какой из этих видов выступил материнской формой T. militinae можно выяснить путем анализа последовательностей хлоропластного генома этих пшениц. Поскольку о пластоме T. militinae до сих пор не было никакой информации, цель настоящей работы – секвенирование и аннотация хлоропластного генома пшеницы Милитины.

Семена T. militinae var. albimilitinae k-59942 (Белоруссия) были предоставлены Федеральным исследовательским центром Всероссийский институт генетических ресурсов растений (ВИР, Санкт-Петербург). Растения проращивались в теплице при 21 °С в течение трех недель, затем было собрано около 20 г зеленых листьев. Далее эти листья были помещены на 48 ч в холод (+4 °С) и темноту для уменьшения содержания крахмала.

Для выделения хлоропластной ДНК из листьев использовали метод сахарозного градиента [4] с некоторыми модификациями, к примеру, на этапе выделения хлоропластной ДНК из интактных хлоропластов использовали 0.15%-ный Triton X-100 к конечному объему образцов и далее применяли метод фенольно-хлороформной экстракции [5]. Гомогенизацию листьев проводили при помощи ступки и пестика в жидком азоте.

Рис. 1. Представление в виде кольца хлоропластного генома T. militinae var. albimilitinae k-59942. Визуализация пластома проведена при помощи ресурса OGDRAW. Разными цветами отображены гены, участок серого круга посередине отображает уровень GC-участков. IRA – инвертированная область повтора A, IRB – инвертированная область повтора B. Гены, расположенные за пределами внешнего круга, транскрибируются по часовой стрелке, а расположенные внутри гены – против часовой стрелки.

На начальном этапе секвенирования был проведен контроль качества выделенной хлоропластной ДНК. Для этого концентрация ДНК была измерена на спектрофотометре NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США) и проведена оценка соотношений A260/280 и А260/230. Количество ДНК определяли флуориметрическим методом с использованием набора SpectraQ BR (Raissol, Россия) и флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Подготовка ДНК-библиотек проводилась методом shotgun при помощи набора SG GM Plus (Raissol). В работу по секвенированию брали 200 нг хлоропластной ДНК. На первом этапе подготовки проводилась ферментативная фрагментация хлоропластной ДНК до размера фрагментов 350 пн с одновременным восстановлением концов. На втором этапе проводились лигирование адаптеров и очистка продукта реакции на магнитных частицах Smart beads (Raissol, Россия). На третьем этапе проводились индексная ПЦР и очистка продукта реакции на магнитных частицах Smart beads (Raissol). Контроль качества полученной ДНК-библиотеки проводили при помощи биоаналайзера Qsep400 (Bioptic, Тайвань). Флуориметрическое измерение концентрации ДНК-библиотеки проводили с использованием набора SpectraQ BR (Raissol) и флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). ДНК-библиотеки пулировали и проводили секвенирование при помощи набора FASTASeq 300 Sequencing Kit V1.0 100 M reads/flow cell на секвенаторе Genolab M (GeneMind, Китай). Режим секвенирования 2´-х 150 пн. Файлы формата base были демультиплексированы на приборе Genolab M с получением файлов с расширением fastq. В общей сложности было получено 13 млн чтений. Чистку чтений проводили при помощи программы Trimmomatic v0.22 [6]. Чтения, содержащие неопределенные нуклеотиды “N”, были удалены. Сборку пластома проводили при помощи программы NOVOwrap [7] с использованием последовательности хлоропластного генома T. timopheevii (KJ614408) в качестве референсного. Полный хлоропластный геном T. militinae был аннотирован при помощи ресурса Chloroplast Genome Annotation, Visualization, Analysis, and GenBank Submission 2 (CPGAVAS2) (http://47.96.249.172:16019/analyzer/home) [8]. Круговую карту хлоропластного генома визуализировали при помощи программы OGDRAW (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html) [9].

Размер хлоропластного генома T. militinae var. albimilitinae составил 135898 пн. Длина области инвертированных повторов – 21552 пн, области SSC – 12791 пн, области LSC – 80003 пн. Содержание GC-пар во всем пластидном геноме T. militinae – 38.3%, в области SSC оно составляет 32.19%, в области LSC – 36.28%. В области IR T. militinae GC-содержание достигает 43.91%.

У пшеницы Милитины было аннотировано 132 структурных гена, из которых 85 белок-кодирующих, 31 ген тРНК и четыре гена рРНК. Семь генов, кодирующих белки (rps19, rpl2, rpl23, ndhB, rps7, rps12, rps15), восемь генов тРНК (trnH-GUG, trnM-CAU, trnL-CAA, trnV-GAC, trnT-CGU, trnA-UGC, trnR-ACG, trnN-GUU), четыре гена рРНК (rRNA4.5, rRNA23, rRNA16 и rRNA5) были дублированы из-за того, что находятся в области повтора IR. При этом в SSC-области обнаружено девять белок-кодирующих генов и один ген тРНК, в LSC-области – 69 белок-кодирующих генов и 22 гена тРНК. Кроме того, из 132 генов 14 имеют по одному интрону (trnK-UUU, rps16, trnS-CGA, atpF, trnV-UAC, petB, petD, rpl16, rpl2, ndhB, trnI-GAU, trnA-UGC, ndhA, trnL-UAA) и один ген (ycf3) – два интрона. Самый крупный интрон (2558 пн) находится в гене trnK-UUU, внутри которого располагается другой ген – matK. Также в хлоропластном геноме T. militinae присутствует транс-сплайсируемый ген rps12. Все полученные результаты представлены на рис. 1 в виде кольцевой структуры, полученной при помощи программы OGDRAW. Различные цветовые блоки отображают принадлежность генов к тем или иным функциональным группам.

Представляет большой интерес происхождение пшеницы Милитины, чаще всего она считается мутантом пшеницы Тимофеева. Но секвенирование хлоропластного генома этого вида и его сравнение с другими подобными геномами пшениц показывает, что T. militinae, скорее всего, не мутант, а гибрид, чему мы уделили отдельное внимание в нашей предыдущей публикации [2]. Однако для окончательных выводов требуются еще дополнительные исследования хлоропластных геномов других пшениц, в особенности T. persicum. Нуклеотидная последовательность хлоропластного генома T. militinae была депонирована в GenBank и доступна по номеру OR936057.

Авторы выражают искреннюю признательность коллективу Отдела пшениц Всероссийского института генетических ресурсов растений (ВИР, Санкт-Петербург) за предоставление семенного материала для исследований.

Работа выполнена в рамках государственного контракта по проекту РНФ № 23-24-00275 “Филогенетические взаимоотношения отдельных видов пшенично-эгилопсного комплекса разных уровней плоидности через призму их полных хлоропластных геномов с прицелом на происхождение B- и G-субгеномов полиплоидных форм пшениц линий turgidum–aestivum и timopheevii–zhukovskyi”.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объектов животных и людей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.