Genetic characteristics of the Gray Mountain Caucasian Bee Apis mellifera caucasica

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

In this study we present the results of a comparative genetic analysis of bees of the Apis mellifera caucasica subspecies with the subspecies A. m. carnica and A. m. mellifera. We performed polymorphism analysis of nine microsatellite loci (Ap243, 4a110, A24, A8, A113, A88, Ap049, A28, and A43) and determined the haplotypes of the tRNAleu-COII locus. Analysis of the genetic structure of representatives of three subspecies of honey bees, widespread in Russia, showed a significant level of their differentiation even when using a small set of microsatellite loci. An assessment of the prevalence of tRNAleu-COII haplotypes in the three studied samples showed that for A. m. caucasica the predominant haplotype was C2j.

Full Text

Apis mellifera caucasica Gorb. или серая горная кавказская пчела впервые была описана в 1916 г. [1]. Эта пчела привлекла внимание пчеловодов и ученых своей продуктивностью, незлобивостью и способностью опылять красный клевер [2]. Ареалом Apis mellifera caucasica является Кавказ [1–3]. На территории России она обитает в регионах Южного и Северо-Кавказского федеральных округов. Созданная в 1963 г. Краснополянская опытная станция осуществляет свою научную и хозяйственную деятельность по разведению этого подвида медоносной пчелы [4]. В начале ХХ в. начался массовый экспорт A. m. caucasica в другие регионы России и за рубеж [2]. Геном A. m. caucasica был расшифрован в 2020 г. китайскими учеными c помощью технологии секвенирования Pacbio (Genome assembly ASM1384120v1, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_013841205.1/). Помимо того в Генбанке зарегистрирован полный митохондриальный геном A. m. caucasica (GenBank ID: MN714160).

На основании морфометрических и генетических различий все известные подвиды были разделены на четыре эволюционные ветви: африканскую (А), западно- и североевропейскую (М), восточноевропейскую (С) и западно-центральноазиатскую (О) [3, 5, 6]. На основании этой классификации А. m. caucasica принадлежит к эволюционной ветви О наряду с A. m. anatoliaca, A. m. remipes, A. m. macedonica, A. m. cecropia и A. m. cypria [3, 6]. В 1993 г. Л. Гарнери с соавт. установил, что с помощью полиморфизма межгенного локуса tRNAleu-COII (или COI-COII) мтДНК можно дифференцировать пчел из эволюционных ветвей А, М и С [7]. Этот метод, получивший название DraI-тест, основан на анализе длин рестрикционных фрагментов межгенного локуса tRNAleu-COII. Подвид A. m. caucasica по морфометрическим и полногеномным данным относится к ветви О, но при этом имеет общие гаплотипы tRNAleu-COII с подвидами из эволюционной ветви С (A. m. ligustica, A. m. carnica) [8]. Следовательно, с помощью анализа данного локуса невозможно дифференцировать A. m. caucasica от подвидов из ветви С. Однако есть исследования, свидетельствующие о том, что подвиды из ветви С отличаются по частотам гаплотипов tRNAleu-COII [9, 10].

Цель настоящей работы – выявить генетические особенности популяции серой горной кавказской пчелы с помощью анализа микросателлитных локусов и межгенного локуса мтДНК tRNAleu-COII.

Для анализа полиморфизма микросателлитных локусов (Ap243, 4a110, A24, A8, A113, A88, Ap049, A28 и A43) и межгенного локуса мтДНК tRNAleu-COII нами были сформированы три выборки. Выборка A. m. caucasica (N = 90) представлена пчелиными семьями, отобранными на Краснополянской опытной станции пчеловодства (Краснодарский край, Сочинский р-н, п. Красная Поляна) в период 2008–2020 гг. Выборка A. m. mellifera (N = 93) была отобрана в Бурзянском р-не Башкортостана, а также в Пермском крае. Выборка A. m. carnica (N = 118) была отобрана из пасек Республики Адыгея, Оренбургской обл., Узбекистана и Казахстана. Из исследуемых выборок нами были отобраны по 20 особей каждого подвида для оценки гаплотипов локуса tRNAleu-COII с помощью секвенирования.

ДНК выделяли из мышц торакса рабочих пчел с использованием набора ДНК-ЭКСТРАН-2 (ООО “СИНТОЛ”, Москва). Качество и количество тотальной ДHK анализировали на спектрофотометре Implen N60. Смесь ПЦР на десять образцов общим объемом 150 мкл включала 120 мкл дистиллированной воды, 15 мкл магниевого буфера, 3 мкл смеси DNTP (концентрация – 10 мкм каждого), по 5 мкл F-праймера и R-праймера (концентрация – 10 пикомоль/мкл) и 3 мкл Taq-полимеразы. Режим ПЦР: 3 мин 94 °С, затем 30 циклов с денатурацией 30 с при 94 °С, отжигом 30 с при 49 °С (для локуса tRNAleu-COII) и 55 °С (для микросателлитных локусов), элонгацией 60 с при 72 °С и конечной элонгацией 3 мин при 72 °С. Для визуализации продуктов амплификации использовали электрофорез в 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей детекцией в фотосистеме Gel Doc™ XR+ (BioRad, США).

Данные по микросателлитным локусам были использованы для определения генетической структуры выборок с помощью программы Structure 2.3.4 с заданным числом кластеров от 1 до 10. Количество предполагаемых групп (К) рассчитывали в Structure Harvester [11, 12]. Анализ был выполнен при помощи модели Admixture с указанием информации о географической локализации выборок (LocPrior) и с Burnin Period и MCMC, равных 10 000 и 100 000 повторов соответственно. Результаты анализа обрабатывали в CLUMPP 1.1.2 с помощью алгоритма FullSearch. Стандартное генетическое расстояние Nei [13] было рассчитано в POPULATION ver.1.2.32.

 

Рис. 1. Генетическая структура исследуемых выборок при К = 2 и К = 3.

 

Секвенирование 60 амплификатов tRNAleu-COII выполнили в ООО “Синтол” (Москва). Последовательности ДНК редактировали и обрезали вручную с помощью программного обеспечения MEGA для получения согласованных последовательностей, которые затем выравнивали с ранее опубликованными последовательностями tRNAleu-COII с использованием алгоритма Clustal W. In silico DraI тест последовательностей tRNAleu-COII был выполнен с помощью Unipro UGENE ver. 36.

На первом этапе работы мы выполнили анализ полиморфизма девяти микросателлитных локусов (Ap243, 4a110, A24, A8, A113, A88, Ap049, A28 и A43) в выборках A. m. caucasica, A. m. carnica и A. m. mellifera. На рис. 1 представлены результаты кластерного анализа исследуемых выборок. DeltaK, используемая для расчета оптимального числа кластеров, достигла пиков при K = 2 (deltaK = 1479.4) и при К = 3 (deltaK = 276.6). При К = 2 выборки A. m. caucasica и A. m. carnica вошли в один кластер. Дифференциация трех подвидов наблюдалась при К = 3. Стандартное генетическое расстояние Nei между A. m. caucasica и A. m. carnica составило 0.269. В работе S. Nikolova с соавт. генетическое расстояние Nei между этими двумя подвидами составило 0.384 на основе анализа полиморфизма девяти микросателлитных локусов [14].

 

Таблица 1. Гаплотипы tRNAleu-COII в исследуемых выборках A. m. caucasica, A. m. carnica и A. m. mellifera

Выборка

Место сбора

N

Гаплотипы (число особей)

A. m. caucasica

Краснодарский край

20

C2j (16), C2jd (1), C2jf (1), C2c (1), C2l (1)

A. m. carnica

Республика Адыгея

6

С2с (3), C2j (1), C2 (1), C1 (1)

Оренбургская область

5

С2c (4), C2j (1)

Узбекистан

5

C2c (4), C2 (1)

Казахстан

4

C2c (3), C3 (1)

A. m. mellifera

Республика Башкортостан

8

M17j (8)

Пермский край

12

M17j (4), M17k (6), M17q (2)

 

Следующим нашим шагом было установление гаплотипов локуса tRNAleu-COII. Последовательности гаплотипов с указанием географических данных доступны по ссылке https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22348063. Уникальные последовательности tRNAleu-COII были депонированы в GenBank под номерами OR761847–OR76187.

На территории России обитают подвиды трех эволюционных ветвей: М (A. m. mellifera), С (A. m. carnica, A. m. ligustica) и О (A. m. caucasica). С помощью разделения продуктов амплификации локуса tRNAleu-COII в 8%-ном ПААГ было установлено, что все образцы A. m. caucasica и A. m. carnica имеют аллельный вариант Q, характерный для представителей эволюционной ветви С (фрагмент размером 571 пн), тогда как все образцы A. m. mellifera имели вариант PQQ размером 825 пн, характерный для ветви М. Несмотря на то, что мы не можем различать эволюционные ветви C и O с помощью анализа локуса tRNAleu-COII, нам было интересно узнать, существуют ли различия в частотах гаплотипов между A. m. caucasica и A. m. carnica. Секвенирование амплификатов локуса tRNAleu-COII показало, что из 20 семей A. m. caucasica 16 имели гаплотип C2j и две семьи имели варианты гаплотипа С2j – C2jd и C2jf. Оставшиеся две семьи имели гаплотипы C2c и C2l. В выборке A. m. carnica преобладающим гаплотипом был C2c. У A. m. mellifera гаплотип M17j был доминирующим. В табл. 1 представлен список выявленных гаплотипов.

Последовательности tRNAleu-COII из Генбанка, принадлежащие A. m. caucasica (Ap018404.1 из России, OP404074.1 и OP404073.1 из Турции, MN714160.1 из США), также относятся к эволюционной ветви C. Последовательности Ap018404.1, OP404074.1 и OP404073.1 относятся к гаплотипу C2j. MN714160.1 отличается от C2j только на одну замену. Образцы A. m. caucasica из Турции из работы С. Tozkar с соавт. также относятся к гаплотипу C2j [15]. Таким образом, по этим немногочисленным данным можно предположить, что для популяции серой горной кавказской пчелы характерным гаплотипом является C2j.

Ранее предполагалось, что подвиды из ветви С отличаются по частотам гаплотипов tRNAleu-COII [9, 10]. Для итальянской пчелы A. m. ligustica доминирующим гаплотипом является С1 [10, 16–18]. Для A. m. carnica, по одним данным, доминирующим гаплотипом является C2c [9], по другим – С2j [10]. В первом случае идентификация гаплотипов была основана на DraI ПДРФ анализе амплификатов tRNAleu-COII. Пчелы были отобраны в Словении, в естественном ареале обитания данного подвида. Во втором случае пчелы были отобраны из разных штатов США, куда пчелы разных подвидов были завезены с XVII в. [2, 17, 19]. Авторы этой работы отмечают, что гаплотип C2j отличается от других гаплотипов гаплогруппы С2. Кроме того, указывается, что пчелы с гаплотипом C2j вошли в общий кластер с образцами A. m. caucasica из Генбанка [10].

К эволюционной ветви О, помимо A. m. caucasica, относятся также подвиды A. m. anatoliaca (Турция), A. m. remipes (Армения), A. m. macedonica (Северная Македония, Греция, Болгария), A. m. cecropia (Греция) и A. m. cypria (Кипр). Последовательности tRNAleu-COII A. m. anatoliaca и A. m. macedonica, доступные в Генбанке, также относятся к гаплотипам ветви C. Например, последовательности A. m. anatoliaca ON933877.1, MN701760.1–MN701763.1 относятся к гаплотипу C2, а FJ357798.1 – к C1. Гаплотипы A. m. macedonica отличаются на одну замену от гаплотипа С2. Для A. m. remipes, A. m. cecropia и A. m. cypria, мы не обнаружили последовательностей tRNAleu-COII.

Митохондриальный локус tRNAleu-COII – информативный и простой в использовании генетический маркер [7]. С его помощью было проанализировано большое число популяций медоносных пчел во всем мире [10, 20–24]. Однако из-за отсутствия правил классификации гаплотипов tRNAleu-COII накопилось большое число неверно обозначенных гаплотипов. Лишь в 2017 г. появилась работа [25], в которой описываются правила номенклатуры гаплотипов и выполнена ревизия гаплотипов из ранее вышедших работ. В нашем исследовании мы использовали эти правила номенклатуры для классификации гаплотипов tRNAleu-COII.

Анализ генетической структуры представителей трех подвидов медоносной пчелы, широко распространенных на территории России, показал значимый уровень их дифференциации даже при использовании небольшого набора микросателлитных локусов. Оценка распространенности гаплотипов tRNAleu-COII в трех исследуемых выборках показала, что для A. m. caucasica преобладающим гаплотипом является C2j. Генетические исследования популяций медоносной пчелы имеют не только фундаментальное значение для сохранения уникальных генофондов, но и применяются племенными хозяйствами, специализирующимися на разведении определенных подвидов медоносной пчелы.

Дифференциация подвидов с помощью генетических и морфометрических маркеров осложняется тем, что популяции медоносных пчел почти не сохранились в границах своего естественного распространения из-за экспорта пчел. Данные по популяционным исследованиям медоносной пчелы разных подвидов очень разрозненные. Для решения этой проблемы, в первую очередь, необходимо найти аборигенные, или локальные, популяции пчел в границах их естественного распространения, а затем провести полногеномные исследования этих популяций, выполнить морфометрический анализ и анализ межгенного локуса tRNAleu-COII.

 

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-74-00004, https://rscf.ru/project/22-74-00004/ на оборудовании ЦКП УФИЦ РАН.

Исследование одобрено Этическим комитетом ФБУН Ин-том биохимии и генетики – обособленным структурным подразделением Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук, дата 30.01.2024, протокол № 2.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

About the authors

M. D. Kaskinova

Institute of Biochemistry and Genetics – Subdivision of the Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: kaskinovamilyausha@mail.ru
Russian Federation, Ufa, 450054

L. R. Gaifullina

Institute of Biochemistry and Genetics – Subdivision of the Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Email: kaskinovamilyausha@mail.ru
Russian Federation, Ufa, 450054

E. S. Saltykova

Institute of Biochemistry and Genetics – Subdivision of the Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Email: kaskinovamilyausha@mail.ru
Russian Federation, Ufa, 450054

References

  1. Горбачев К.А. Кавказская серая горная пчела (Apis mellifera var. caucasica) и место ее среди других пчел. Тифлис: тип. Труд, 1916. 39 с.
  2. Алпатов В.В. Породы медоносной пчелы. Москва: Изд-во моск. об-ва испытателей природы, 1948. 183 с.
  3. Ruttner F. Biogeography and Taxonomy of Honeybees. Berlin: Springer, 1988. 291 p.
  4. Любимов Е.М., Сокольский С.С., Савушкина Л.Н., Бородачев А.В. Селекция пчел серой горной кавказской породы и производство продукции в пчелоразведенческом хозяйстве. Рязань: Изд-во Ряз. обл. тип., 2013. 192 с.
  5. Cridland J.M., Tsutsui N.D., Ramirez S.R. The complex demographic history and evolutionary origin of the western honey bee Apis mellifera // Genome Biol. Evol. 2017. V. 9. P. 457–472. https://doi.org/10.1093%2Fgbe%2Fevx009
  6. Momeni J., Parejo M., Nielsen R.O., Langa J., et al. Authoritative subspecies diagnosis tool for European honey bees based on ancestry informative SNPs // BMC Genomics. 2021. V. 22. № 101. https://doi.org/10.1186/s12864-021-07379-7
  7. Garnery L., Solignac M., Celebrano G., Cornuet J.-M. A simple test using restricted PCR-amplified mitochondrial DNA to study the genetic structure of Apis mellifera L. // Experientia. 1993. V. 49. P. 1016–1021. https://doi.org/10.1007/BF02125651
  8. Cornuet J.M., Garnery L. Mitochondrial DNA variability in honeybees and its phylogeographic implications // Apidologie. 1991. V. 22. P. 627–642.
  9. Susnik S., Kozmus P., Poklukar J., Meglic V. Molecular characterisation of indigenous Apis mellifera carnica in Slovenia // Apidologie. 2004. V. 35. P. 623–636. https://doi.org/10.1051/apido:2004061
  10. Alburaki M., Madella S., Lopez J., et al. Honey bee populations of the USA display restrictions in their mtDNA haplotype diversity // Frontiers in Genetics. 2023. V. 13. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.1092121
  11. Earl D.A., vonHoldt B.M. STRUCTURE HARVESTER: A website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method // Conservation Genetics Resources. 2012. V. 4(2). P. 359–361. https://doi.org/10.1007/s12686-011-9548-7
  12. Evanno G., Regnaut S., Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: A simulation study // Mol. Ecol. 2005. V. 14(8). P. 2611–2620. https://doi.org/10.1111/j.1365-294X.2005.02553.x
  13. Nei M. Molecular еvolutionary пenetics // DNA Рolymorphism Within and Between Populations. N. Y.: Columbia Univ. Press, 1987. P. 254–285.
  14. Nikolova S.R., Bienkowska M., Gerula D., Ivanova E.N. Microsatellite DNA polymorphism in selectively controlled Apis mellifera carnica and Apis mellifera caucasica populations from Poland // Arch. Biol. Sci. 2015. V. 67(3). P. 889–894. https://doi.org/10.2298/ABS141102048N
  15. Tozkar C.O. Genetic structure of honey bee (Apis mellifera Linnaeus, 1758) subspecies based on tRNAleu-COX2 and ND5 regions of mtDNA // Applied Ecol. and Environ. Res. 2020. V. 18(2). https://doi.org/10.15666/aeer/1802_22692284
  16. Franck P., Garnery L., Celebrano G. et al. Hybrid origins of honeybees from Italy (Apis mellifera ligustica) and Sicily (A. m. sicula) // Mol. Ecol. 2000. V. 9. P. 907–921. https://doi.org/10.1046/j.1365-294x.2000.00945.x
  17. Carpenter M.H., Harpur B.A. Genetic past, present, and future of the honey bee (Apis mellifera) in the United States of America // Apidologie. 2021. V. 52. P. 63–79. https://doi.org/10.1007/s13592-020-00836-4
  18. Kaskinova M.D., Gaifullina L.R., Saltykova E.S. Haplotypes of the tRNAleu-COII mtDNA region in Russian Apis mellifera populations // Animals. 2023. V. 13. https://doi.org/10.3390/ani13142394
  19. Marcelino J., Braese C., Christmon K. et al. The movement of western honey bees (Apis mellifera L.) among U.S. States and territories: History, benefits, risks, and mitigation strategies // Front. Ecol. Evol. 2022. V. 10. https://doi.org/10.3389/fevo.2022.850600
  20. Collet T., Ferreira K., Arias M. et al. Genetic structure of Africanized honeybee populations (Apis mellifera L.) from Brazil and Uruguay viewed through mitochondrial DNA COI–COII patterns // Heredity. 2006. V. 97. P. 329–335. https://doi.org/10.1038/sj.hdy.6800875
  21. Oleksa A., Kusza S., Tofilski A. Mitochondrial DNA suggests the introduction of honeybees of african ancestry to East-Central Europe // Insects. 2021. V. 12. https://doi.org/10.3390/insects12050410
  22. Chavez-Galarza J., Lopez-Montanez R., Jimenez A. et al. Mitochondrial DNA variation in Peruvian honey bee (Apis mellifera L.) populations using the tRNAleu-cox2 intergenic region // Insects. 2021. V. 12. https://doi.org/10.3390/ insects12070641
  23. Tanasković M., Erić P., Patenković A. et al. MtDNA analysis indicates human-induced temporal changes of Serbian honey bees diversity // Insects. 2021. V. 12. https://doi.org/10.3390/insects12090767
  24. Salehi S., Nazemi-Rafie J. Discrimination of Iranian honeybee populations (Apis mellifera meda) from commercial subspecies of Apis mellifera L. using morphometric and genetic methods // J. of Asia-Pacific Entomology. 2020. № 23. P. 591–598. https://doi.org/10.1016/j.aspen.2020.04.009
  25. Chavez-Galarza J., Garnery L., Henriques D. et al. Mitochondrial DNA variation of Apis mellifera iberiensis: Further insights from a large scale study using sequence data of the tRNAleu-cox2 intergenic region // Apidologie. 2017. V. 48. P. 533–544.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Genetic structure of the studied samples for K = 2 and K = 3.

Download (193KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».