Hypermethylation of Long Non-Coding RNA Genes GAS5, Hotair, Hotairm1 and SSTR5-AS1 As Factors in the Development and Progression of Metastatic Breast Cancer

Texto integral

Рак молочной железы (РМЖ) по-прежнему занимает первое место по заболеваемости раком во всем мире среди женщин [1]. Причем заболеваемость РМЖ растет с каждым годом, что значительно влияет на здоровье и качество жизни женщин [2]. В последние годы хотя и отмечается значительный прогресс в лечении РМЖ, частота рецидивов и метастазов все еще остается на высоком уровне. Метастазы в лимфатические узлы являются одним из наиболее важных факторов снижения выживаемости больных РМЖ – 5-летняя выживаемость метастатическим РМЖ остается менее 30% [3, 4]. Исследование молекулярных механизмов лимфогенного метастазирования и поиск новых биомаркеров являются крайне актуальной задачей.

Развитие и прогрессирование РМЖ включает и генетические, и эпигенетические изменения [5, 6]. В последние годы эпигенетические события рассматриваются как решающие факторы возникновения и прогрессирования опухолей. В ряде исследований охарактеризован метиломный ландшафт РМЖ на ранних стадиях, однако есть данные, что он изменяется в ходе эволюции рака от ранних до поздних стадий и таким образом, будучи определенным на ранних стадиях, не является репрезентативным на поздних стадиях. Данные о статусе динамического и обратимого метилирования ДНК могут служить источником потенциальных маркеров и терапевтических мишеней для лечения РМЖ [7].

Длинные некодирующие РНК (днРНК) представляют собой класс транскриптов длиной более 200 оснований и хорошо известны своим ограниченным потенциалом кодирования белков [8]. Предыдущие исследования выявили ряд днРНК, участвующих в многоуровневой регуляции экспрессии генов, включая регуляцию транскрипции за счет метилирования ДНК или нарушения активности факторов транскрипции. Хотя сообщалось, что многие днРНК аберрантно экспрессируются при РМЖ [9] и участвуют в таких процессах, как апоптоз [10], пролиферация [11] и метастазирование [12], функции и механизмы большинства днРНК в лимфогенном метастазировании РМЖ не выяснены и требуют дальнейших исследований.

Цель данной работы – изучение вклада метилирования группы генов днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1, включая их ко-метилирование, в развитие и прогрессию РМЖ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Парные (опухоль/прилежащая гистологически нормальная ткань молочной железы) образцы РМЖ были собраны и морфологически охарактеризованы в Отделе патоморфологии опухолей НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина на основании классификации ВОЗ [13]. Диагноз поставлен на основании гистологического заключения. Клинико-морфологические характеристики 108 образцов РМЖ представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Клинико-патоморфологические параметры больных

Клинико-гистологический параметр		Количество образцов
Стадия опухолевого процесса	Ранние стадии (I + II)	80
	III стадия	28
Размер первичной опухоли	Т1	21
	Т2	68
	Т3	9
	Т4	10
Лимфогенное метастазирование	Есть	52
	Нет	56
Экспрессия рецептора эстрогена	Есть	87
	Нет	21
Экспрессия рецептора прогестерона	Есть	83
	Нет	25
Экспрессия рецептора HER2	Есть	65
	Нет	43

 

В исследование брали образцы РМЖ у больных, которые до операции не получали лучевой, химио- или гормонотерапии. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации [14]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток (не менее 70%) проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (3–5 мкм), окрашенных гематоксилином и эозином. Образцы тканей хранили при –70 ºС. Замороженную в жидком азоте ткань измельчали с помощью гомогенизатора-диспергатора TissueRuptor® II (QIAGEN, Хильден, Германия).

Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани по стандартной методике фенол-хлороформной очистки. ДНК хранили при –20 ºС. Концентрацию ДНК определяли по оптической плотности при длине волны 260 нм, степень очистки ДНК определяли по спектру при длинах волн от 230 до 320 нм на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США); качество ДНК определяли электрофорезом в 0.8%-ном агарозном геле с использованием системы горизонтального электрофореза (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) с последующей визуализацией геля с помощью системы документации геля (Bio-Rad, Калифорния, США). Уровень метилирования генов днРНК анализировали с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [15]. Амплификацию проводили на приборе Система ПЦР-детектирования в реальном времени Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, Калифорния) с использованием набора qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”

Москва, Россия) по протоколу производителя. Последовательности олигонуклеотидов и условия проведения ПЦР для генов днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1 и контрольного гена ACTB1 приведены в табл. 2. В качестве контролей для неметилированных аллелей использовали коммерческий препарат ДНК (#G1471; Промега, Калифорния, США). В качестве положительного контроля 100%-ного метилирования использовали коммерческий препарат ДНК (#SD1131; Thermo Fisher Scientific, Уилмингтон, Делавэр).

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и параметры количественной МС-ПЦР

Ген	Праймеры для МС-ПЦР	Тотж, °C	Продукт ПЦР, п.н.
GAS5	MF: CGTTATCGTCGGTATTGGAGGGG	185	60
	MR: CGCCCGACGCCTTATCCC
	UF: TGTTATTGTTGGTATTGGAGGGGTGAG	179	60
	UR: CAACACCTTATCCCCATCTTCTCCA
HOTAIR	MF: CGGGTTTTTATTTTTTCGTTATTGCG	258	54
	MR: CGACTACTCTCGCCAAATTTCACTACTTC
	UF: TGGGTTTTTATTTTTTTGTTATTGTGTTATTTTG	258	52
	UR: CAACTACTCTCACCAAATTTCACTACTTCACAC
HOTAIRM1	MF: TTTAGGCGGCGGTAGTTGTTGC	60	212
	MR: ACCCTCTTCCCTTCTCACCTCTCG
	UF: GATTTGGAGTGTTGGAGTGAAGAAGA	60	229
	UR: TTACAACCACCCAACAAACTCTAACC
SSTR5-AS1	MF: CGGCGTTAGCGGGTCGAGT	59.4	153
	MR: CGCTCCTTCTAACCCTTCGAC
	UF: TGTGGGTGGTGTTAGTGGGTTGAGT	60	168
	UR: ACAAAACACCACATCCTTCTAACCCTTC
ACTB1	F: TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT	60	132
	R: AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA

Примечание. MF/UF — прямой праймер к метилированному/неметилированному аллелю; MR/UR — обратный праймер к метилированному/неметилированному аллелю. Все олигонуклеотиды подобраны по программе SeqBuilder Pro, которая входит в пакет программ Lasergene 17.1 компании DNASTAR.

 

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета статистических программ IBM SPSS Статистика 22 (IBM, Армонк, Нью-Йорк, США) и в программной среде R. Для оценки значимости различий между исследуемыми группами применяли непараметрический U-тест Манна–Уитни для независимых выборок. Различия считали значимыми при р < 0.05. Данные выражали в виде медианы (Me), нижнего (Q1) и верхнего (Q3) квартилей. Корреляционный анализ выполняли с использованием метода ранговой корреляции Спирмена и рассчитывали уровень его значимости. Различия считали достоверными при р ≤ 0.05.

Дискриминантный анализ был проведен для установления зависимости между вероятностью развития метастазов в лимфатических узлах и индексом метилирования генов днРНК. Константа дискриминации, разделяющая исследованные образцы РМЖ на группы, определялась как значение функции, равноудаленное от центроидов. Значимость различий при сравнении средних значений дискриминантной функции устанавливали с помощью коэффициента λ Уилкса (p < 0.001).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Гиперметилирование генов днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1 при РМЖ и их вовлеченность в общие биологические процессы

Для отбора генов днРНК, аберрантно метилированных при РМЖ, нами проанализирована база данных MethMarkerDB (https://methmarkerdb.hzau.edu.cn/), которая содержит в себе информацию о 724 метилированных генах биомаркеров из опубликованных статей в PubMed, а также данных полногеномного секвенирования метилирования ДНК (WGBS). Дополнительно для уточнения набора днРНК для дальнейшего собственного экспериментального исследования провели анализ базы данных GeneCards по ключевому слову “EMT” (epithelial-mesenchymal transition), поскольку известно, что эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) является ключевым процессом прогрессии и метастазирования рака – основной причины смерти больных РМЖ. В результате нами были отобраны четыре гена днРНК – GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1 для анализа уровня метилирования в образцах опухолей молочной железы. Нами показано значимое увеличение уровня метилирования (p < 0.05; критерий Манна–Уитни) в образцах опухоли по сравнению с нормальной прилежащей тканью молочной железы для всех четырех генов днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1 (рис. 1). Метилирование генов HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 при РМЖ показано нами впервые.

 

Рис. 1. Уровень метилирования генов днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1 в опухолевых образцах молочной железы и в парной норме. Т – tumor/опухоль; N – norm / прилежащая гистологически нормальная ткань молочной железы.

 

Подверженность гиперметилированию ряда генов днРНК при РМЖ и ко-метилирование могут указывать на их общее участие в биологических процессах при РМЖ. Нами проведен анализ обогащения по функциональной принадлежности с привлечением базы данных ncPath (http://ncpath.pianlab.cn/#/Home) для четырех исследуемых днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1, по результатам которого установили, что днРНК GAS5, HOTAIR и HOTAIRM1 вовлечены в регуляцию mTOR – (hsa04150), MAPK – (hsa04010), FoxO – (hsa04068) и Hippo – (hsa04390) сигнальных путей и имеют множество общих мишеней в каждом из путей. Например, общей мишенью для днРНК GAS5 и HOTAIR в mTOR сигнальном пути могут выступать такие гены, как PTEN, PI3K, SOS, PKC, RSK и др.

 

Рис. 2. Корреляция относительного уровня метилирования генов днРНК HOTAIR и GAS5.

 

Методом статистического анализа с применением коэффициента корреляции Спирмена с поправкой на множественные сравнения Беньямини–Хохберга установили высокую статистически значимую положительную корреляцию для пары GAS5 – HOTAIR (r_s = 0.68; p < 0.001) (рис. 2), а также умеренную положительную корреляцию для пары SSTR5-AS1 – HOTAIRM1 (r_s = 0.42; p = 0.04). Таким образом, полученные данные по ко-метилированию генов днРНК, как и биоинформатические предсказания, свидетельствуют об их взаимном участии в общих сигнальных путях и биологических процессах.

Связь гиперметилирования генов днРНК HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 с прогрессией РМЖ. Метилирование HOTAIRM1 как фактор прогноза лимфогенных метастазов

При сравнении уровня метилирования четырех генов днРНК на более поздней стадии (III) по сравнению с таковым на ранних стадиях (I–II) нами показано значимое (p < 0.05) увеличение уровня метилирования на поздней стадии для генов HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 (рис. 3, а). Также уровень метилирования генов HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 был значимо (p < 0.05) выше в образцах опухолей молочной железы пациенток с размером опухоли T3–T4 по сравнению с T1–T2 (см. рис. 3, б). При оценке уровня метилирования генов днРНК в образцах опухолей молочной железы в зависимости от наличия метастазов нами установлено высокозначимое (p < 0.005) повышение уровня метилирования для генов днРНК HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 в образцах с наличием метастазов в лимфатических узлах (N1–N3) (см. рис. 3, в).

 

Рис. 3. Связь уровня метилирования генов днРНК HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 со стадией онкологического процесса (а), с размером опухоли (б) и лимфогенным метастазированием (в). См. текст. NO – образцы без метастазов в лимфатических узлах.

 

Таким образом, нами определены два гена днРНК HOTAIRM1 и SSTR5-AS1, уровень метилирования которых статистически значимо коррелирует с такими показателями прогрессии РМЖ, как стадия, размер опухоли, наличие метастазов в лимфатических узлах. При сопоставлении уровня метилирования с иммуногистохимическими показателями образцов от больных РМЖ, такими как экспрессия рецепторов PR, ER и HER2, нами установлено значимое снижение уровня метилирования для гена днРНК GAS5 в опухолевых образцах от пациенток с РМЖ, экспрессирующих рецептор PR, по сравнению с опухолевыми образцами от пациенток с РМЖ, не экспрессирующими рецептор PR (р = 0.04).

Для установления зависимости между развитием лимфогенных метастазов и уровнем метилирования генов днРНК нами проведен дискриминантный анализ, в результате которого была получена следующая модель:

$Y_{\mathrm{lm}} = –1.817 + 0.087 * X_{\mathrm{mi}} \left(HOTAIRM1\right)$,

где $Y_{\mathrm{lm}}$ – дискриминантная функция, характеризующая вероятность наличия лимфогенного метастазирования, $X_{\mathrm{mi}}$(HOTAIRM1) – индекс метилирования днРНК HOTAIRM1 (%).

Константа дискриминации, разделяющая исследуемых на две группы, определялась как значение функции, равноудаленное от центроидов, которые составили в группе с отсутствием лимфогенного метастазирования –0.33, а при наличии лимфогенного метастазирования 0.456. Соответственно, константа дискриминации равна 0.063. При сравнении средних значений дискриминантной функции в обеих группах с помощью коэффициента λ Уилкса были установлены статистически значимые различия (p = 0.008). Индекс метилирования (mi) днРНК HOTAIRM1 характеризовался прямой связью с вероятностью лимфогенного метастазирования: при увеличении mi днРНК HOTAIRM1 вероятность лимфогенного метастазирования возрастала. Принадлежность пациентов к группе высокого или низкого риска лимфогенного метастазирования определялась исходя из рассчитанных значений прогностической дискриминантной функции: при значении функции более 0.063 – к группе высокого риска лимфогенного метастазирования, при значении функции менее 0.063 – относился к группе низкого риска. Чувствительность модели составила 71.4%, специфичность – 72.4%. К сожалению, представленная модель не была валидирована на дополнительной выборке образцов на момент подготовки публикации.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее показано, что метилирование ДНК является маркером злокачественных опухолей [16] и происходит на ранних стадиях развития РМЖ [17], а также играет важную роль в регуляции развития метастазов в лимфатических узлах. Имелось также сообщение, что метилирование межгенных областей может иметь биологическое значение в регуляции экспрессии HOTAIR [18]. В настоящей работе исследовано метилирование четырех генов днРНК GAS5, HOTAIR, SSTR5-AS1, HOTAIRM1; гиперметилирование генов днРНК HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 обнаружено при РМЖ впервые. Ранее нами сообщалось о гиперметилировании гена GAS5 [19] на небольшой выборке образцов РМЖ, однако в текущем исследовании нам удалось подтвердить полученные ранее данные на более представительной выборке образцов РМЖ.

Полученные данные по ко-метилированию в парах генов GAS5 – HOTAIR и SSTR5-AS1 – HOTAIRM1 согласуются с данными биоинформатического анализа о совместном участии исследуемых днРНК в общих сигнальных путях и биологических процессах. Кроме того, данными литературы также подтверждается участие исследуемых нами днРНК в перечисленных выше сигнальных путях. Например, днРНК GAS5 может действовать как супрессор при раке гортани, поскольку она подавляет пролиферацию клеток и метастазирование, регулируя сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR [20]. В работе [21] отмечается, что днРНК HOTAIR играет роль в прогрессировании РМЖ, возможно, за счет активации сигнального пути PI3K/AKT/mTOR. днРНК HOTAIRM1 способствует пролиферации клеток остеосаркомы и подавляет апоптоз за счет усиления эффекта Варбурга через ось miR-664b-3p/Rheb/mTOR [22]. Таким образом, наше предположение о совместном участии исследуемых днРНК в общих биологических процессах и сигнальных путях подтверждается как данными биоинформатического анализа, так и данными литературы.

Таким образом, нами определены гены днРНК GAS5, HOTAIR, HOTAIRM1, SSTR5-AS1, аберрантно метилированные при РМЖ, а также установлена положительная корреляция между уровнями метилирования для пар генов днРНК GAS5 – HOTAIR и SSTR5-AS1 – HOTAIRM1. Для днРНК GAS5 – HOTAIR, чьи гены проявляют синергизм в изменениях уровней метилирования, биоинформатически предсказано участие в регуляции общих сигнальных путей и биологических процессов, что находит подтверждение в данных литературы. Для генов днРНК HOTAIRM1 и SSTR5-AS1 установлена связь уровня метилирования с показателями прогрессии РМЖ (стадией опухолевого процесса, размером опухоли, наличием метастазов в лимфатические узлы); предложена математическая модель для оценки риска развития лимфогенных метастазов в зависимости от уровня метилирования гена HOTAIRM1.

 

Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 22-75-00132). 
Исследование одобрено Этическим комитетом Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии (18.04.2023, № 8-23-2).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Все обследованные – совершеннолетние.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Sobre autores

E. Filippova

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Autor responsável pela correspondência
Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 125315

S. Lukina

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 125315

V. Loginov

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Medical Genetic Research Center

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 125315; Moscow, 115522

A. Burdennyy

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 125315

I. Pronina

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 125315

N. Arzhanukhina

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, the Ministry of Health of Russia

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 115478

T. Kazubskaya

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, the Ministry of Health of Russia

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 115478

E. Braga

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Medical Genetic Research Center

Email: p.lenyxa@yandex.ru
Rússia, Moscow, 125315; Moscow, 115522

Bibliografia

Arquivos suplementares