Идентификация Bos taurus и Bos grunniens на основании SNP

Полный текст

Домашний як (Bos grunniens) представляет собой доместицированную форму дикого яка (Bos mutus). Эти животные известны своей способностью выживать в экстремальных условиях, таких как низкие температуры, гипоксия и нехватка пищи, что делает их важным объектом для исследования молекулярно-генетических механизмов выживаемости и адаптации к высокогорным районам. Долгая и сложная история доместикации яка, а также физико-географические особенности его местообитания оказывают значительное влияние на генетическое разнообразие современных популяций этого животного. В настоящее время идет активное изучение Bos grunniens по всему миру, включая исследования различий в популяциях, генетического многообразия, геногеографии и филогенетических связей [1].

В горах Кыргызстана активно развивается яководство, в то время как на более низких и средних высотах преобладает разведение крупного рогатого скота (КРС). В отличие от последнего, яки предпочитают использовать пастбищные корма низкого роста, что свидетельствует об их уникальных адаптационных возможностях. Домашний як имеет ограниченное географическое распространение в высокогорных районах Центральной Азии, которое обусловлено его высокой адаптивностью к жизни в условиях гор и плато, подобно дикому родственнику – тибетскому яку.

Оценка генетического разнообразия яков и пород КРС, разводимых в Кыргызстане, в контексте возможной гибридизации между видами проводилась в нашем предыдущем исследовании [2]. Кроме того, в работе [3] были исследованы гибриды яка с КРС, по результатам которой в популяциях яка и гибридов первого поколения был выявлен видоспецифичный для яка паттерн из восьми ISSR-фрагментов. Также на основе микросателлитного анализа ранее был изучен аллелофонд яков и их гибридов с Bos taurus, который показал высокое генетическое разнообразие для гибридов первого поколения в сравнении с исходными видами [4].

Идентификация домашнего яка и КРС имеет важное значение для оценки возможной гибридизации между этими видами. Эта задача актуальна как для селекционеров, так и экспертов-криминалистов, особенно в условиях ограниченной доступности референсных данных и высоких затрат на анализ STR-локусов. Оценка частот распространения видоспецифичных SNP (Single Nucleotide Polymorphism) также представляет интерес с точки зрения динамики эволюционных изменений у домашних видов животных по сравнению с их дикими сородичами, что может быть связано с искусственным отбором, проводимым человеком.

Цель настоящего исследования – использование методов биоинформатики для выявления SNP c высоким потенциалом дифференциации, необходимых для идентификации принадлежности образцов как к биологическому виду Bos taurus, так и Bos grunniens. На основании проведенного анализа предлагается разработать тест-систему, включающую несколько SNP для идентификации домашнего яка и представителей КРС.

Материалы и методы

Биологические образцы. Для молекулярно-генетического исследования были собраны образцы крови от 56 домашних яков (Bos grunniens) из высокогорного региона Калмак-Ашуу (Кочкорский р-н, Нарынская обл., Кыргызская Республика). Эта группа обозначена как YAK. Также были взяты образцы крови у 146 коров (Bos taurus) трех пород: абердин-ангусской (n = 45, группа ABR), голштинской (n = 51, группа HOL) и алатауской (n = 50, группа ALA). Совокупность этих образцов составила выборку COW. Биологический материал был отобран сотрудниками опытных хозяйств и поступал в лабораторию для молекулярно-генетического анализа в пробирках типа Vacutainer (BD Vacutainer® Sodium Citrate Tubes), каждая из которых была снабжена биркой с описанием животного (видовая и породная принадлежность, возраст, пол).

Выделение ДНК. Образцы крови хранились при температуре –20°С в течение 1–2 мес. либо при –80°С при долговременном хранении. ДНК экстрагировали с использованием набора Blood-Animal-Plant DNA Preparation Kit (Jena Bioscience, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Количественная оценка выделенной ДНК проводилась с помощью NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Средняя концентрация ДНК составила 72.4 ± 23.3 нг/мкл, при соотношении 260/280 – 1.89 ± 0.09.

KASP. Определение генотипа по SNP (версия генома Bos_taurus_UMD_3.1.1, GCF_000003055.6) Сhr4:68609356G>T (JAZF1), Chr14:35695388G>T (SLCO5A1), Chr19:63181970C>G (CEP112) проводилось с применением технологии, основанной на конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP, Kompetitive allele specific PCR). Генотипирование проводили с использованием KASP Assay mix (KASP by Design, KBD) и KASP Master mix (LGC Biosearch Technologies, Великобритания; ООО “Максим Медикал”, РФ) в объеме 10 мкл в термоциклере QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System (Thermo FS, США) в соответствии с рекомендациями производителя. На рис. 1 представлены 2D-графики аллельной дискриминации для SNP Сhr4:68609356G>T (JAZF1), Chr14:35695388G>T (SLCO5A1), Chr19:63181970C>G (CEP112), использовавшихся в тестах для идентификации домашних яков и КРС.

 

Рис. 1. График аллельной дискриминации результатов KASP для полиморфизмов: a – Сhr4:68609356G>T (JAZF1); б – Chr14:35695388G>T (SLCO5A1); в – Chr19:63181970C>G (CEP112).

 

Определение генотипа in silico. Для проведения генотипирования in silico использовались геномы животных, доступные в базе данных NCBI, конвертированные в формат *.fasta с помощью пакета SRA-Toolkit версии 2.11. Для определения генотипов использовалось оригинальное программное обеспечение GENIS, разработанное на языке Python версии 3.10. Подробности методологии описаны в статье [5].

В рамках исследования генотипирование было проведено для 316 особей домашнего яка и 385 особей КРС. Таким образом, в биоинформатическом анализе был задействован 701 отсеквенированный геном, файлы для которых расположены в базе Sequence Read Archive (SRA) [6]: PRJNA74739 (2012, Китайская Народная Республика – КНР), PRJNA217895 (2013, КНР), PRJNA285834 (2015, КНР), PRJEB18113 (2016, Швейцария), PRJNA508864 (2018, КНР), PRJNA431934 (2018, Австралия), PRJNA531398 (2019, КНР), PRJNA762180 (2021, Великобритания), PRJNA766811 (2021, КНР), PRJNA842787 (2022, КНР), PRJNA899924 (2022, КНР), PRJNA950586 (2023, КНР).

Статистический анализ данных. Для оценки потенциала SNP в качестве идентификационных маркеров использовался ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic analysis) в программе SPSS версии 20.0. SNP полагался высокоэффективным маркером при условии, что нижняя граница асимптотического 95%-ного доверительного интервала (ДИ) для параметра площади под кривой (AUC) превышала 0.8.

Комплексную оценку дифференцирующего потенциала для совокупности SNP проводили с использованием программы MDR v.3.0.2 [7]. Вклад конкретного генотипа определялся величиной энтропии Н (выраженной в %). При H = 100% генотип способен однозначно дифференцировать, к какой группе относится образец. В программе MDR для определения оптимальной модели дифференциации использовались следующие высоко консервативные настройки: количество атрибутов (attribute count range) – от 1 до n (где n – количество переменных в модели); воспроизводимость модели (cross-validation count) – 100; анализ топ-моделей (track top models) – 1000; поиск конфигурации модели (search method configuration) – всесторонний (exhaustive); метод сравнения (ambiguous cell analysis) – точный тест Фишера (Fisher’s exact test); классификация ячеек (ambiguous cell assignment) – неклассифицированные (unclassified). Корректность модели оценивалась по значению сбалансированной точности (adj. Balanced Accuracy). Вероятность отнесения образца к одной из двух выборок – YAK или COW – рассчитывалась в SPSS v.20.0 с использованием логистической регрессии.

Результаты и обсуждение

Отбор наиболее информативных SNP включал два этапа. На первом этапе были сформированы две тестовые группы, образцы в которые были включены случайным образом: BG-1 (домашний як, n = 56) и BT-1 (КРС, n = 60), для которых были определены генотипы по 947 SNP (перечень SNP представлен в файле “Дополнительные материалы”, табл. Д-1). В перечень потенциально информативных SNP вошли как ранее описанные SNP [8], так и фланкирующие их SNP из BovineHD BeadChip от Illumina© [9].

Для оценки информативности SNP был проведен ROC-анализ, который позволил выделить 64 SNP с наибольшими значениями параметра AUC (area under ROC curve) – площади, ограниченной ROC-кривой и осью доли ложных положительных классификаций. Эти маркеры были отобраны для дальнейших исследований. На втором, расширенном этапе генотипы этих 64 SNP были определены для дополнительных 260 животных Bos grunniens (группа BG-2) и 325 животных Bos taurus (группа BT-2). Список отобранных для генотипирования in silico животных представлен в табл. Д-2 (доп. мат.). Повторный ROC-анализ был проведен для уточнения SNP с наибольшим дифференцирующим потенциалом для различения домашнего яка и крупного рогатого скота. Полученные результаты использовались для построения ROC-кривых и оценки показателя AUC. По результатам биоинформатического анализа, значения AUC для отобранных SNP находились в диапазоне от 0.899 до 0.999, что указывает на их высокий дифференцирующий потенциал (доп. мат., табл. Д-3).

Для исследования взаимодействий SNP был использован метод многомерного сокращения размерности (MDR v.3.0.2). На основе данных, полученных в ходе биоинформатического анализа SRA, были отобраны три SNP с наибольшим дифференцирующим потенциалом: Сhr4:68609356G>T (JAZF1), Chr14:35695388G>T (SLCO5A1) и Chr19:63181970C>G (CEP112). Значения энтропии H для этих SNP составили 78.19, 77.79 и 77.07% соответственно. Далее, с использованием технологии KASP, были определены генотипы для 202 образцов домашнего яка и крупного рогатого скота из Кыргызстана. Повторный анализ с использованием метода MDR позволил рассчитать величину энтропии H для каждого SNP: для Сhr4:68609356G>T (JAZF1) H = 85.16%, для Chr14:35695388G>T (SLCO5A1) H = 85.16%, для Chr19:63181970C>G (CEP112) H = 82.76%. Результаты генотипирования представлены в табл. Д-4 (доп. мат.).

В результате ROC-анализа было установлено, что все три SNP обладают высочайшим дифференцирующим потенциалом для различения домашнего яка и крупного рогатого скота. Значения AUC для SNP составили: Сhr4:68609356G>T (JAZF1) AUC = 1.0, 95%ДИ = [1.0–1.0], p = 4.17*10^–28; Chr14:35695388G>T (SLCO5A1) AUC = 1.0, 95%ДИ = [1.0–1.0], p = 4.17*10^–28; Chr19:63181970C>G (CEP112) AUC = 1.0, 95%ДИ = [0.999–1.0], p = 4.56*10^–28. Частоты аллелей также подтвердили их значимость: аллель G для Сhr4:68609356G>T в выборке COW составил 100%, аллель G для Chr14:35695388G>T – 100%, аллель С для Chr19:63181970C>G – 99.32%. В выборке YAK частоты аллелей были следующими: аллель T для Сhr4:68609356G>T – 97.32%, аллель T для Chr14:35695388G>T – 99.11%, аллель G для Chr19:63181970C>G – 97.32%.

Таким образом, в тест-систему были включены три SNP, графическая интерпретация модели на основании анализа 202 образцов представлена на рис. 2, а. Согласно полученным результатам, сбалансированная точность идентификации, (adj. Balanced accuracy) домашнего яка и КРС при анализе 202 образцов по SNP Сhr4:68609356G>T (JAZF1), Chr14:35695388G>T (SLCO5A1) и Chr19:63181970C>G (CEP112) составила 98.87% (специфичность модели – 100%, чувствительность – 100%). При объединении двух массивов данных – образцов из Кыргызстана и образцов из NCBI-SRA, для которых имелись данные по трем SNP, с последующим анализом в MDR определено, что сбалансированная точность идентификации (adj. Balanced accuracy) домашнего яка и КРС составила 99.67% (специфичность модели – 100%, чувствительность – 100%). Графическая интерпретация модели на основании анализа 611 образцов представлена на рис. 2, б.

 

Рис. 2. Графическое представление модели из трех полиморфизмов для идентификации домашнего яка и КРС: а – 202 образца (образцы из Кыргызстана); б – 611 образцов (образцы из Кыргызстана и данные SRA).

 

При оценке точности отнесения образца к одной из двух групп: домашний як или КРС, с использованием логистической регрессии, получены следующие данные (доп. мат., табл. Д-5):

при наличии генотипа CC (Chr19:63181970C>G) / GG (Сhr4:68609356G>T) / GG (Chr14:35695388G>T) вероятность отнесения образца к выборке COW составляет 100% (в совокупности распространенность особей с данными генотипами в группе COW – 94.79%);

при наличии генотипа CG (Chr19:63181970C>G) / GG (Сhr4:68609356G>T) / GG (Chr14:35695388G>T) или CС (Chr19:63181970C>G) / GG (Сhr4:68609356G>T) / TG (Chr14:35695388G>T) вероятность отнесения образца к выборке COW составляет 100% (в совокупности распространенность особей с данными генотипами в группе COW – 4.22%);

при наличии генотипа GG (Chr19:63181970C>G) / TT (Сhr4:68609356G>T) / TT (Chr14:35695388G>T) вероятность отнесения образца к выборке YAK составляет 100% (в совокупности распространенность особей с данными генотипами в группе COW – 90.87%);

при наличии генотипа CG или GG (Chr19:63181970C>G) / TT или TG (Сhr4:68609356G>T) / TT (Chr14:35695388G>T) вероятность отнесения образца к выборке YAK составляет 100% (в совокупности распространенность особей с данными генотипами в группе COW – 7.21%);

в 1.31% случаев особь не удалось отнести ни к одному кластеру с заявленным в MDR уровнем точности в 99.0%.

Таким образом, в настоящей работе мы показали, что сбалансированная точность дифференциации Bos taurus и Bos grunniens составила более 99%, что вполне достаточно для решения большинства задач популяционной генетики. Однако в 1.31% случаев (согласно модели, рис. 2, б) образцы домашнего яка и КРС не могут быть корректно дифференцированы c уровнем значимости p < 0,01. Это обусловлено относительно небольшим количеством особей с редкими генотипами, такими как CC (Chr19:63181970C>G) / TG (Сhr4:68609356G>T) / GG (Chr14:35695388G>T) – для КРС, или GG (Chr19:63181970C>G) / TT (Сhr4:68609356G>T) / TG (Chr14:35695388G>T) – для домашнего яка. Если же использовать уровень значимости p < 0.05 при MDR-анализе, то все 611 образцов дифференцируются корректно. Аналогичная ситуация показана для результатов дифференциации при использовании логистической регрессии.

В перспективе для увеличения точности модели, особенно для криминалистических приложений, может быть рекомендовано увеличение выборки исследуемых образцов за счет включения новых образцов с заведомо известной видовой принадлежностью. Увеличение числа редких генотипов при сохранении их относительной частоты в выборках домашнего яка и КРС приведет к снижению процента образцов, которые не могут быть корректно дифференцированы.

Характеристика исследуемых генов

Ген JAZF1 (JAZF zinc finger 1, NCBI Gene ID 616701) расположен на 4-й хромосоме (NC_037331.1 (67992971..68321145), ARS-UCD2.0 (GCF_002263795.3)). Ортолог данного гена у человека кодирует ядерный белок с тремя цинковыми пальцами типа C2H2 и действует как репрессор транскрипции. Этот ген участвует в липидном обмене, подавляя липогенез и усиливая липолиз, что приводит к уменьшению накопления липидов в жировой ткани. JAZF1 также задействован в гомеостазе глюкозы, улучшая метаболизм глюкозы и чувствительность к инсулину. Белки JAZF1 у КРС и человека имеют схожий размер. В исследовании Eusebi G.P. et al. изучались профили экспрессии генов в префронтальной коре агрессивных пород КРС, включая JAZF1, который показал пониженную экспрессию у испанской породы Lidia, известной своим агонистическим поведением [10]. Jin M. et al. обнаружили, что JAZF1 участвует в адаптации овец Ovis aries к высокогорным условиям [11]. Zhao F. et al. выделили JAZF1 как один из ключевых генов, влияющих на продуктивные характеристики КРС [12]. Исследователи установили, что полиморфизм JAZF1 ассоциирован с ростом у людей [13].

Ген SLCO5A1 (solute carrier organic anion transporter family member 5A1, NCBI Gene ID 535202) расположен на 14-й хромосоме (NC_037341.1 (33483001..33770931), ARS-UCD2.0 (GCF_002263795.3)). Ортолог данного гена у человека отвечает за активность трансмембранного переносчика органических анионов, независимую от натрия. Белок SLCO5A1 расположен во внутриклеточных мембраносвязанных органеллах и плазматической мембране. Размер белков у КРС и человека различается незначительно – 846 и 848 аминокислот соответственно. При ассоциативном анализе репродуктивных признаков у Sus scrofa domesicus и генных сетей на основании полногеномных исследований было показано, что ген SLCO5A1 связан с транскрипционными факторами, участвующими в функционировании молочной железы и скелетных мышц [14]. В работе Gaddis K.L.P. et al. была обнаружена связь гена SLCO5A1 с восприимчивостью к кетозу у джерсейской породы КРС [15]. В другом исследовании был определен регион на 14-й хромосоме генома Bos taurus (абердин-ангусы) с потенциально высокой ассоциацией с массой при рождении, где также расположен ген SLCO5A1 [16].

Ген CEP112 (centrosomal protein 112, NCBi Gene ID 617266) расположен на 19-й хромосоме (NC_037346.1 (62280043..62600661), ARS-UCD2.0 (GCF_002263795.3)). Ортолог этого гена у человека кодирует белок со спиральным доменом, который принадлежит к семейству эффекторных белков, контролирующих клеточное деление. CEP112 был идентифицирован как компонент центросомы человека. Для этого гена характерен альтернативный сплайсинг, что приводит к образованию множества вариантов транскрипта. В исследовании Kim S. и соавт. установлено, что полиморфизм rs42699274 гена CEP112 может служить генетическим маркером при оценке генетического разнообразия и дивергенции среди корейских пород КРС [17]. В другом исследовании, направленном на повышение точности геномного прогнозирования характеристик телосложения у корейского КРС голштинской породы, было показано, что полиморфизм гена CEP112 является важным маркером для понимания генетических основ этих признаков и может служить надежной основой для прогнозов, основанных на геномных данных [18].

Известно, что прямое перенесение результатов, полученных для одного биологического вида, на другой вид некорректно и требует дополнительных исследований. Тем не менее полученные результаты могут быть полезны для дальнейшего изучения эволюции филогеографической структуры популяций домашнего яка и пород КРС в Кыргызстане. Они также могут способствовать сохранению генетических ресурсов для будущих селекционных исследований и расширить понимание того, как животные могут адаптироваться к изменениям климата. Все три SNP, включенные в тест-систему, расположены в интронных областях генов и не должны оказывать влияние на функционирование экспрессируемых белков. Однако различные события одомашнивания, адаптация к различным климатическим зонам и дивергентный отбор по продуктивным признакам сформировали геномные различия между исследуемыми видами.

Ранее нами было показано, что при анализе пяти STR-локусов (BM1818, BM1824, BM2113, CSSM66 и ILSTS006) точность классификации для Bos grunniens составила 98.8 ± 3.4%, для Bos taurus – 99.1 ± 1.2% [2]. При использовании же трех SNP (Сhr4:68609356G>T, Chr14:35695388G>T и Chr19:63181970C>G) точность классификации составила 99.67% при максимально возможных значениях специфичности и чувствительности. При этом образцы YAK_107, YAK_117 и YAK_131, для которых по результатам STR-анализа точность отнесения к своему кластеру составила 70.3, 75.5 и 72.3% соответственно, по результатам SNP-анализа были однозначно (100% точность) классифицированы как домашние яки.

Итак, в настоящем исследовании нами предложена тест-система для дифференциации домашнего яка (Bos grunniens) и крупного рогатого скота (Bos taurus), основанная на анализе трех SNP в генах JAZF1, SLCO5A1 и CEP112. С использованием методов биоинформатики были определены SNP с высоким дифференцирующим потенциалом. Эти полиморфные варианты подтвердили свою эффективность на практике. Модель, основанная на трех SNP (Сhr4:68609356G>T в гене JAZF1, Chr14:35695388G>T в гене SLCO5A1 и Chr19:63181970C>G в гене CEP112), продемонстрировала высокую сбалансированную точность (не менее 99.67%) при анализе 611 образцов. Применение данного подхода позволило достичь 100% чувствительности и 100% специфичности в дифференциации двух видов. Метод KASP, используемый в молекулярно-генетическом анализе, отличается одностадийностью, что снижает риск кросс-контаминации и уменьшает трудовые затраты благодаря исключению этапов рестрикции и электрофореза. Дальнейшее расширение базы данных образцов с помощью генотипирования, особенно in silico, остается актуальной задачей для совершенствования и применения данной тест-системы.

Программное обеспечение GENIS разработано в рамках НИР “Биоинформатический подход к анализу данных полногеномного секвенирования для поиска однонуклеотидных замен, способных дифференцировать близкородственные биологические виды” (БРФФИ, 2023–2025 гг., Б23-060, рег. № 20231076).

Сбор биологических образцов домашнего яка и КРС выполнен в рамках правительственного задания Министерства образования и науки Кыргызской Республики (договор № 30-21 от 02.15.2021, № 129/1).

Молекулярно-генетические исследования выполнены при частичной финансовой поддержке OOO “МАКСИМ МЕДИКАЛ” в рамках частной научной инициативы ANALYSIS OF SRA DATA USING BIOINFORMATICS METHODS.

Исследование одобрено Этическим комитетом Научно-исследовательского института молекулярной биологии и медицины (Бишкек, Кыргызская Республика, 12.06.2024, протокол № 6).

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

В. Н. Кипень

Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси

Автор, ответственный за переписку.
Email: v.kipen@igc.by
Белоруссия, Минск

Ж. Т. Исакова

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и медицины; Кыргызско-Турецкий Университет “Манас”

Email: v.kipen@igc.by
Казахстан, Бишкек; Бишкек

М. М. Патрин

OOO “Максим Медикал”

Email: v.kipen@igc.by
Россия, Москва

К. Б. Чекиров

Кыргызско-Турецкий Университет “Манас”

Email: v.kipen@igc.by
Казахстан, Бишкек

К. А. Айтбаев

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и медицины

Email: v.kipen@igc.by
Казахстан, Бишкек

А. Р. Карыпова

Кыргызско-Турецкий Университет “Манас”

Email: v.kipen@igc.by
Казахстан, Бишкек

М. И. Ирсалиев

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и медицины

Email: v.kipen@igc.by
Казахстан, Бишкек

Список литературы

Дополнительные файлы