Гиперметилирование при раке яичников генов длинных некодирующих РНК: HOTAIR, GAS5, LINC00472, LINC00886, TUG1

Полный текст

Рак яичников (РЯ) относится к наиболее поздно выявляемым видам рака, поскольку он развивается бессимптомно вплоть до тяжелых стадий с обширным метастазированием и устойчивостью к химиотерапии, что приводит к неблагоприятному исходу [1, 2]. Изучение факторов, участвующих в развитии и прогрессии РЯ, необходимо для разработки и налаживания своевременной диагностики этого вида рака.

В последние два десятилетия установлена важная роль некодирующих РНК в регуляции экспрессии генов и сигнальных путей в онкогенезе [3]. Некодирующие РНК (нкРНК) можно условно классифицировать по длине: короткие (20–200 нуклеотидов) и длинные (примерно от 200 до десятков тысяч нуклеотидов) [4]. Среди коротких РНК наиболее изучены микроРНК, для которых установлена ключевая роль в регуляции экспрессии генов [5]. В последние годы выяснилось, что длинные нкРНК (днРНК) также играют важную роль в регуляции генов, в том числе в опухолях [6, 7]. С применением технологий секвенирования нового поколения было доказано, что большинство геномных последовательностей транскрибируются в виде днРНК, число которых больше 100 тысяч (см. http://www.noncode.org и http://www.lncrnadb.org/), что превышает количество известных кодирующих белок генов и идентифицированных микроРНК человека [8]. Хотя исследованных и аннотированных днРНК пока значительно меньше, чем микроРНК и мРНК.

Аберрантное метилирование промоторных CpG-островков рассматривается как одна из первичных и глубинных эпигенетических модификаций генов и геномов в развитии и прогрессии рака. Показано, что гены днРНК могут регулироваться посредством метилирования, как и гены, кодирующие белки и микроРНК, в частности в опухолях [9, 10]. На данный момент имеются только единичные работы, выявляющие гиперметилирование генов днРНК в опухолях больных РЯ, однако, из этих работ следует, что гиперметилирование играет критическую роль в дерегуляции супрессорных и других функций ряда днРНК: MEG3, HAND2-AS1, ZNF667-AS1 и др. [11–14].

Цель данной работы – определить изменение уровня метилирования группы генов днРНК в опухолях больных РЯ и оценить возможную связь этих изменений с развитием и прогрессией РЯ. Для этого нами был проведен отбор группы генов днРНК, имеющих CpG-островки, согласно базам данных (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, http://www.urogene.org/methprimer2/). В исследование были включены шесть генов днРНК: GAS5 (Growth Arrest Specific 5), HOTAIR (HOX Antisense Intergenic RNA), LINC00472 (Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 472), LINC00886 (Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 886), SNHG17 (Small Nucleolar RNA Host Gene 17), TUG1 (Taurine-Upregulated Gene 1). Отбор этих генов днРНК был основан на биоинформатическом анализе данных бисульфитного секвенирования ДНК из базы NCBI’s Gene Expression Omnibus (NCBI GEO), а также базы данных GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/) об изменении уровней экспрессии этих генов при эпителиальном раке яичников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

С использованием сервера NCBI’s Gene Expression Omnibus (NCBI GEO, a public archive and resource for gene expression data) отобраны наборы данных полногеномного бисульфитного секвенирования для генома рака яичников. Использовали две библиотеки данных с порядковыми номерами GEO Number: GSE146556 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE146555), GSE81228 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE81228), включавшие суммарно данные для 33 (6 и 27) пациенток [15, 16]. Далее, с использованием языка программирования R, отбирали гиперметилированные гены, для которых более 70% наборов бисульфитных прочтений показали метилирование, а в контрольных образцах – не более 20%. После этого все отобранные гены разделялись по типу продукта на мРНК, микроРНК и днРНК. Разбиение проводилось с помощью программы Grep, которая входит в состав стандартного дистрибутива Linux (https ://linux.die.net/man/1/grep). Применен GEO Accession viewer. Таблицы для мРНК и микроРНК далее не рассматривались.

В экспериментальном исследовании использовали 93 образца первичных опухолей, 75 образцов парной гистологически неизмененной ткани. 37 первичных опухолей были взяты от пациенток без метастазов, 56 – от больных с метастазами. Клинико-морфологические характеристики 93 образцов первичных опухолей представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Клинические и гистологические характеристики 93 образцов первичных опухолей больных РЯ

Клинико-гистологический параметр		N = 93
Гистологический тип	серозная аденокарцинома	67
	эндометриоидная аденокарцинома	12
	другие гистологические типы	14
Стадия	I	24
	II	18
	III	50
	IV	1
Размеры и распространенность опухоли	T1	24
	T2	18
	T3	51
Метастазирование	ЕСТЬ	56
	НЕТ	37
	N1	14
	M1	3
	метастазирование в большой сальник	42
	диссеминация по брюшине	38

 

Анализ уровня метилирования генов днРНК проводили с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР) с детекцией в реальном времени. Использован набор реактивов “qPCRmix-HS SYBR” по протоколу фирмы “Евроген”. Амплификацию проводили в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяли с помощью контрольного локуса ACTB с использованием олигонуклеотидов, специфичных к неконвертированной матрице [14]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применялся локус ACTB с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице [14]. Последовательности олигонуклеотидов и условия проведения ПЦР для генов днРНК приведены в табл. 2. В качестве контролей для неметилированных аллелей использовали коммерческий препарат ДНК #G1471 (“Promega”, США). В качестве позитивного контроля 100%-го метилирования использовали коммерческий препарат ДНК #SD1131 (“Thermo Fisher Scientific”).

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и условия МС-ПЦР

Ген днРНК	M/U	Последовательности праймеров	Длина, пн, темп. отж., °С
GAS5	M	MF: CGTTATCGTCGGTATTGGAGGGG	185, 60
		MR: CGCCCGACGCCTTATCCC
	U	UF: TGTTATTGTTGGTATTGGAGGGGTGAG	179, 60
		UR: CAACACCTTATCCCCATCTTCTCCA
HOTAIR	M	MF: CGGGTTTTTATTTTTTCGTTATTGCG	258, 54
		MR: CGACTACTCTCGCCAAATTTCACTACTTC
	U	UF: TGGGTTTTTATTTTTTTGTTATTGTGTTATTTTG	258, 52
		UR: CAACTACTCTCACCAAATTTCACTACTTCACAC
LINC00472	M	MF: AAGGCGTTTTAAGTCGAGGGTA	224, 60
		MR: AACGACTCCGACAACACACC
	U	UF: AAGGTGTTTTAAGTTGAGGGTAAAG	228, 59
		UR: AACAACTCCAACAACACACCCAC
LINC00886	M	MF: CGTGCGATCGTAGTTCGGTAGGTTA	172, 60
		MR: CGCCGAATTACGCGACGAAA
	U	UF: CGTGCGATCGTAGTTCGGTAGGTTA	181; 60
		UR: CCTCACCAAATTACACAACAAAATCAACAC
SNHG17	M	MF: GCGCGAAACGAGCGTA	168, 59
		MR: CGACGCCCTAACGTCGAATA
	U	UF: TTGGTGTGAAATGAGTGTA	170, 57
		UR: CAACACCCTAACATCAAATAACA
TUG1	M	MF: CGGGTTTCGGTTTCGTGGTC	199, 60
		MR: CGACGAAAACGACAACAACACATAATT
	U	UF: TGGTTTTTAAGGATTGGATTGAGGGTAG	159, 60
		UR: CAACAACAACAAAAACAACAACAACACATAAT

Примечание. MF/UF – прямые праймеры к метилированному/неметилированному аллелю, MR/UR – обратные праймеры к метилированному/неметилированному аллелю. Олигонуклеотиды подобраны с использованием базы данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ и программы http://www.urogene.org/methprimer2/ c проверкой в программе SeqBuilder Pro, которая входит в пакет программ Lasergene 17.1 компании DNASTAR (США). Для контрольного локуса ACTB использованы олигонуклеотиды из работы [14].

 

Выделение РНК и получение кДНК проводили по методам, описанным ранее [17]. Анализ уровней экспрессии четырех днРНК выполнен методом количественной ПЦР в реальном времени в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System. Данные анализировали с использованием относительной количественной оценки по методу ΔΔCt [18]. Изменения уровня днРНК менее чем в два раза (|ΔΔCt|≤2) рассматривали как отсутствие изменений. Праймеры для анализа уровня четырех днРНК и контрольного гена B2M приведены в табл. 3. Наличие и размер продуктов ПЦР проверяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле с окрашиванием интеркалирующим красителем бромидом этидия.

 

Таблица 3. Праймеры, условия ПЦР и размеры продукта ПЦР для 4 днРНК и контрольного гена

РНК	Последовательность праймеров	Tотж, °C	Размер, н.о.
GAS5	F: GAGCAAGCCTAACTCAAGCC R: TCAAGCCGACTCTCCATACCC	60	157
HOTAIR	F: CAGTGGGGAACTCTGACTCG R: GTGCCTGGTGCTCTCTTACC	60	94
SNHG17	F: GGGATCTGGGTTTGCTGATATT R: GTAGCCTCACTCTCCATTCTCT	62	89
TUG1	F: GTGCAGAAGCCCAGAGTAAA R: CCACGGTGGTAAAGGAAGATAG	62	152
B2M	F: TGACTTTGTCACAGCCCAAGATAG R: CAAATGCGGCATCTTCAAACCTC	62	81

Примечание. Праймеры подбирали в программе Beacon Designer (Premier Biosoft International) и с использованием PrimerSelect, Lasergene (http://www.dnastar.com/t-primerselect.aspx).

 

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 22 и в программной среде R. Для оценки значимости различий между исследуемыми группами применяли непараметрический U тест Манна–Уитни для независимых выборок. Данные выражали в виде медианы, нижнего (Q1) и верхнего (Q3) квартилей. Корреляции между изменениями уровней метилирования и экспрессии оценивались с применением коэффициента корреляции Спирмена (r_s). Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Биоинформатический анализ базы данных GEO, направленный на отбор гиперметилируемых генов днРНК

При анализе базы данных GEO, входящей в среду NCBI (NCBI’s Gene Expression Omnibus, a public archive and resource for gene expression data), была поставлена задача отбора гиперметилируемых в опухолях яичников генов днРНК. Анализ данных полногеномного бисульфитного секвенирования ДНК из ткани яичника позволил определить несколько наборов генов днРНК, содержащих 2177 генов днРНК (библиотека GSE146556) и 3716 генов днРНК (библиотека GSE81228) [15, 16]. В результате удалось отобрать пять предположительно гиперметилированных при РЯ генов: HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17, TUG1. В исследование дополнительно включен ген GAS5, для которого ранее на выборке из 40 образцов РЯ нами были получены предварительные данные о его возможном частичном метилировании [14].

Затем, с помощью ресурса GEPIA2 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis [19]), был проведен анализ дифференциальной экспрессии 6 отобранных генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1). В результате анализа было показано, что для наиболее распространенного гистологического подтипа РЯ (серозной цистаденокарциномы яичника) характерно значительное снижение уровня экспрессии GAS5 и TUG1, малозначимое снижение экспрессии HOTAIR и LINC00472, а также малозначимое повышение экспрессии LINC00886 и SNHG17. Отмеченное снижение уровня экспрессии для генов GAS5, HOTAIR, LINC00472, TUG1 указывало на возможную роль гиперметилирования в подавлении экспрессии данных генов, что характерно для генов-супрессоров в опухолях.

Изменения уровня метилирования шести генов днРНК в опухолях больных РЯ

По результатам МС-ПЦР проведен анализ уровня метилирования шести генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1) в 93 образцах первичных опухолей и 75 образцах парной гистологически неизмененной ткани. С применением непараметрического критерия Манна–Уитни проведено сравнение уровня метилирования шести генов днРНК в образцах первичных опухолей и гистологически неизмененной ткани. Статистически значимое (p < 0.05) повышение уровня метилирования наблюдается для всех 6 исследованных генов днРНК (рис. 1). Причем, для четырех генов (GAS5, HOTAIR, LINC00886 и TUG1) показано многократное (в 3–10 раз) и высоко значимое (p < 0.001) повышение уровня метилирования в первичных опухолях РЯ в сравнении с условной нормой. Повышение уровней метилирования двух других генов в (1.5–2 раза) также статистически значимо: LINC00472 (p = 0.016) SNHG17 (p = 0.005).

 

Рис. 1. Сравнение уровней метилирования шести генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1) в 93 образцах опухоли РЯ и в 75 парных образцах условной нормы; рассчитано с применением непараметрического критерия Манна–Уитни, показано в виде тепловой карты

 

Следует отметить, что данные по гиперметилированию четырех генов днРНК (LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1) при РЯ ранее не были опубликованы (PubMed 12.10.2023).

На более тяжелых клинических стадиях (III–IV, 51 образец опухолей РЯ) в cравнении с менее тяжелыми стадиями (I–II, 42 образца опухолей РЯ) наблюдается дальнейшее статистически значимое (в 2–4 раза, p < 0.05) повышение уровня метилирования пяти генов днРНК (кроме SNHG17), причем наиболее высоко значимое (p < 0.001) повышение уровней метилирования выявлено для трех генов днРНК (GAS5, LINC00472, LINC00886), что показано на рис. 2.

 

Рис. 2. Повышение уровня метилирования пяти генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886 и TUG1) на более поздних клинических стадиях (III–IV (51 образец) против I–II (42 образца)). На оси абсцисс – стадия заболевания

 

Аналогичный результат получен при сопоставлении данных для образцов, различающихся по размеру и степени распространенности рака (T3, 52 образца, против Т1–T2, 40 образцов): высоко значимое различие (p < 0.001) найдено для тех же трех генов (GAS5, LINC00472, LINC00886). Повышение уровня метилирования для генов HOTAIR и TUG1 менее значимо (p = 0.03), для SNHG17 – не выявлено.

Анализ образцов первичных опухолей РЯ от пациенток с метастазами (56 образцов) и без метастазов (37 образцов) выявил высоко значимую связь повышенного уровня метилирования с наличием метастазирования для генов LINC00472 (p < 0.001) и HOTAIR (p = 0.002). Для трех других генов днРНК значимость различия уровней метилирования в первичных опухолях между группами пациентов с метастазами и без таковых составили: GAS5, p = 0.022; TUG1, p = 0.024; для гена SNHG17 различие не значимо (рис. 3).

 

Рис. 3. Повышение уровня метилирования генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, TUG1) в первичных опухолях больных РЯ с метастазами (56 образцов) в сравнении с образцами опухолей больных без метастазов (37 образцов). По оси абсцисс – наличие или отсутствие метастазов

 

Влияние аберрантного метилирования на изменение уровня экспрессии генов днРНК GAS5, HOTAIR, SNHG17 и TUG1

Если для генов днРНК GAS5, LINC000472, LINC000886 имелись данные о влиянии метилирования на экспрессию в некоторых видах рака, то для генов HOTAIR, SNHG17 и TUG1 такие данные полностью отсутствовали (PubMed, 30.09.2023). В связи с этим исследовано изменение уровня экспрессии для четырех днРНК GAS5, HOTAIR, SNHG17 и TUG1 в образцах РЯ относительно условной нормы; исследование выполнено на общей выборке из 36–53 образцов РЯ, использованных также в анализе аберрантного метилирования (рис. 4).

 

Рис. 4. Профиль изменения уровня экспрессии днРНК GAS5, HOTAIR, SNHG17 и TUG1 на выборке из 36–53 образцов РЯ относительно условной нормы

 

Наблюдается незначительное снижение уровня экспрессии днРНК GAS5 (14/53 – 26%, против 18/53 – 34%, в 1.3 раза) в опухолях больных РЯ, высоко значимое снижение уровня экспрессии днРНК HOTAIR (8/36 – 22%, против 26/36 – 72%, в 3.2 раза, p < 0.001), а также довольно значительное повышение уровня экспрессии днРНК SNHG17 (18/36 – 55%, против 12/36 – 33%, в 1.5 раза) и незначительное повышение днРНК TUG1 (9/45 – 20%, против 11/45 – 24%, в 1.2 раза). Многократное и высоко значимое снижение уровня экспрессии гена HOTAIR указывает на возможную роль метилирования в подавлении его экспрессии в опухолях РЯ. Полученные данные не исключают возможность вовлеченности метилирования в дерегуляцию экспрессии генов GAS5 и TUG1. Однако значительное (в 1.5 раза) повышение уровня экспрессии днРНК SNHG17 не согласуется с возможным участием выявленного гиперметилирования в подавлении экспрессии этой днРНК. Сопоставление результатов по изменениям уровней метилирования и экспрессии для этих четырех днРНК показало статистически значимую корреляцию только для гена GAS5 (r_s = −0.47, p < 0.001), исследованного на большей выборке образцов (рис. 5).

 

Рис. 5. Отрицательная корреляция между изменениями уровней метилирования и экспрессии гена GAS5 (в 53 парных образцах РЯ); на рисунке приведен коэффициент корреляции Спирмена: rs = −0.47, p < 0.001

 

Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные подтверждают функциональную роль метилирования в подавлении экспрессии гена GAS5. При этом можно также предполагать, что метилирование может участвовать в регуляции генов HOTAIR и TUG1, но не гена SNHG17, который отличается наиболее повышенной экспрессией как по данным ресурса GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/), так и по результатам нашего экспериментального исследования.

ОБСУЖДЕНИЕ

С применением биоинформатического анализа было отобрано шесть генов днРНК GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1, потенциально метилируемых при РЯ, из которых пять (HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17, TUG1) определены при анализе базы данных NCBI GEO. Чтобы оценить роль возможного участия метилирования в регуляции экспрессии этих генов в опухоли была использована платформа GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/). Результаты анализа позволили первично оценить уровень экспрессии каждого гена в опухоли яичника относительно нормальной ткани. Так, в отличие от рака легкого, почки и РМЖ, при серозной цистаденокарциноме яичника (доминирующем типе РЯ) выявлено сильное снижение уровня экспрессии днРНК GAS5 и TUG1, которое могло быть вызвано аберрантным метилированием CpG-островков в промоторных участках этих генов. Кроме того, в международных исследованиях имеются единичные работы о характере метилирования этих генов и влиянии метилирования на потенциал экспрессии. Так, согласно литературным источникам, получены данные о роли гиперметилирования в подавлении экспрессии гена GAS5 в опухолях желудка, а также в меланоме и злокачественных опухолях молочной железы [20–22]. Таким образом, в настоящем исследовании поставлена задача выяснить значимость метилирования шести генов (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1) в развитии и прогрессии опухолей яичников, включая развитие метастазов, а также в дерегуляции экспрессии кодируемых ими днРНК. Проведенный анализ метилирования шести отобранных генов днРНК с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной МС-ПЦР показал статистически значимое повышение уровня метилирования всех шести исследованных генов: GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, SNHG17 и TUG1.

Сравнение уровней метилирования генов в образцах РЯ на разных клинических стадиях и в зависимости от размеров и распространенности рака показало дальнейшее возрастание уровня метилирования с прогрессией РЯ для пяти генов днРНК, кроме SNHG17. Для четырех генов (GAS5, HOTAIR, LINC00472, TUG1) также установлена связь аберрантного метилирования с метастазированием РЯ (в лимфатические узлы, брюшину или другие органы).

Проведенный анализ изменения уровня экспрессии днРНК SNHG17 в парных образцах РЯ позволил определить значимое повышение уровня ее экспрессии в опухоли. При этом связи гиперметилирования с экспрессией гена SNHG17 выявлено не было. Характерно, что именно для гена этой днРНК не обнаружено также связи метилирования с какими-либо параметрами прогрессии РЯ (стадией, распространенностью, метастазированием). На основании этих результатов можно заключить, что аберрантное метилирование гена SNHG17 не участвует в дерегуляции экспрессии этой днРНК. Этот результат согласуется с данными литературы об онкогенных свойствах днРНК SNHG17, в частности в патогенезе РЯ [23].

Для гена днРНК GAS5 выявлено гиперметилирование при раке желудка, меланоме и в других видах рака [20–22]. В настоящей работе установлено гиперметилирование гена GAS5 на представительной выборке образцов РЯ и впервые показана статистически значимая отрицательная корреляция между уровнями метилирования и экспрессии, подтверждающая участие аберрантного метилирования в подавлении экспрессии этой днРНК. Полученные нами данные согласуются с данными о супрессорной функции днРНК GAS5 в опухолях разных локализаций, включая РЯ [24, 25].

Результат о гиперметилировании гена HOTAIR согласуется с данными о выявленном ранее аберрантном метилировании этого гена в клетках и тканях РЯ [26]. Снижение уровня экспрессии одновременно с увеличением уровня метилирования гена HOTAIR, и связь гиперметилирования с прогрессией РЯ, в том числе с клинической стадией, степенью распространённости и наличием метастазирования, позволяют предполагать участие процесса аберрантного метилирования гена HOTAIR в регуляции его экспрессии и супрессорную роль этой днРНК при РЯ.

Для днРНК TUG1 ранее была показана повышенная экспрессия и онкогенные свойства во многих опухолях [27, 28]. Однако обнаруженное нами в настоящей работе многократное и статистически значимое повышение уровня метилирования гена TUG1 в первичных опухолях РЯ, а также дальнейшее возрастание уровня метилирования с прогрессией РЯ (учитывая стадию, размеры и распространенность, а также метастазирование) позволяют предположить функциональное значение метилирования в инактивации этой днРНК и в патогенезе РЯ. C этим предположением согласуются данные сервиса GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/) о сильном снижении уровня экспрессии днРНК TUG1 при серозной цистаденокарциноме яичника (доминирующем типе РЯ) в отличие от рака легкого, почки и РМЖ, при которых наблюдается повышенная экспрессия.

Для межгенной днРНК LINC00472 ранее была установлена роль гиперметилирования в регуляции её экспрессии в патогенезе рака молочной железы и желудка, а также супрессорные свойства в патогенезе некоторых видов рака [29, 30]. Однако повышенный уровень метилирования гена LINC00472 в опухолях больных РЯ, а также данные о дальнейшем возрастании метилирования этого гена с повышением стадии и появлением метастазов выявлены нами впервые. Для гена LINC00886 также имелись данные литературы о роли гиперметилирования в снижении экспрессии этой днРНК при раке гортани и при плоскоклеточном раке пищевода и в подавлении эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [31, 32]. Однако аберрантное метилирование гена LINC00886 в опухолях больных РЯ, а также данные о связи гиперметилирования этого гена с прогрессией РЯ обнаружены нами впервые. Наш результат вместе с данными литературы позволяет предполагать, что аберрантное метилирование генов LINC00472 и LINC00886, выявленное в настоящей работе в РЯ, вовлечено в дерегуляцию их экспрессии в РЯ.

Для оценки функциональной значимости шести исследованных днРНК, мы провели предварительный биоинформатический скрининг мРНК-мишеней, позитивно коррелирующих с днРНК, с применением NCBI GEO (NCBI’s Gene Expression Omnibus). Взята библиотека данных GSE211669 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE211669) с результатами для 130 пациентов с диагнозом РЯ. По данным этого анализа, днРНК GAS5 и TUG1 наиболее задействованы в регуляции белковых генов. GAS5 может прямо или опосредованно участвовать в позитивной регуляции 196 мРНК, а TUG1 – 531 мРНК, SNHG17 – 53 мРНК, LINC00472 – 21 мРНК, HOTAIR – 4 мРНК и LINC00886 – 2 мРНК (r_s ≥ 0.5, p ≤ 10^-9).

По данным PubMed (30.09.2023), к наиболее изученным днРНК в отношении патогенеза рака, и в частности РЯ, относятся именно GAS5 (455 работ и 25 работ при РЯ ) и TUG1 (342 работы и 15 работ при РЯ). GAS5 участвует в подавлении РЯ через активацию PTEN, Sprouty homolog 2 (SPRY2) и других онкосупрессоров [24, 33]. GAS5 может подавлять инвазию и метастазирование рака поджелудочной железы и рака легкого, ингибируя ЭМП и стволовость раковых клеток [34, 35]. Эта днРНК выступает в роли супрессора в РМЖ, колоректальном раке, раке шейки матки, и вообще может подавлять до 20 видов рака, хотя при раке печени функционирует как онкоген [36]. В отношении TUG1 опубликованные данные свидетельствуют об онкогенных функциях этой днРНК, например, через активацию ЭМП [28], хотя могут быть исключения, как для GAS5 при раке печени. И можно предположить, что ингибирование гена TUG1 в РЯ, по крайней мере частично, осуществляется за счет гиперметилирования, и что эта днРНК способна выступать супрессором при РЯ.

По итогам настоящего исследования можно утверждать, что процесс гиперметилирования генов GAS5, LINC00472 и LINC00886 в опухоли яичников является значимым регулятором экспрессии этих днРНК, что подтверждает супрессорный характер этих трех днРНК. При этом роль этого процесса для гена SNHG17 как фактора регуляции экспрессии не значима, а определение роли гиперметилирования в дерегуляции генов TUG1 и HOTAIR требует дальнейших исследований.

Интересно отметить, что гиперметилирование промоторного участка гена днРНК LINC00473, выявленное недавно в ДНК свободной от клеток плазмы больных колоректальным раком, предложено для ранней неинвазивной диагностики этого вида рака [37]. Обнаруженное нами гиперметилирование группы генов днРНК также открывает перспективы в разработке новых тестов для ранней диагностики РЯ.

Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (грант РНФ №20-15-00368П).

Исследование одобрено Этическим комитетом Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии (18.04.2023, № 8-23-2).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Все обследованные – совершеннолетние.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

А. М. Бурдённый

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

С. С. Лукина

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

Л. А. Урошлев

Институт общей генетики им. Вавилова Российской академии наук

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

Е. А. Филиппова

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

И. В. Пронина

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

М. В. Фридман

Институт общей генетики им. Вавилова Российской академии наук

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

К. И. Жорданиа

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения России

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

Т. П. Казубская

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения России

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

Н. Е. Кушлинский

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Министерства здравоохранения России

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

В. И. Логинов

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Email: burdennyy@gmail.com
Россия, Москва

Э. А. Брага

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии; Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова

Email: eleonora10_45@mail.ru
Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы