Comparison of mass spectra characteristics using statistical analysis methods for the case of ionisation of organic molecules by electron impact with different electron energies

S. V. Silkin; Силкин С. В.; A. V. Sakharov; Сахаров А. В.; S. I. Pekov; Пеков С. И.; V. A. Eliferov; Елиферов В. А.; V. G. Tkachenko; Ткаченко В. Г.; D. V. Kolesnik; Колесник Д. В.; E. N. Nikolaev; Николаев Е. Н.; I. A. Popov; Попов И. А.

doi:10.31857/S0023119324060071

Сравнение характеристик масс-спектров при помощи методов статистического анализа для случая ионизации органических молекул электронным ударом с различной энергией электронов

Авторы: Силкин С.В.¹, Сахаров А.В.¹, Пеков С.И.²^,3, Елиферов В.А.¹, Ткаченко В.Г.¹, Колесник Д.В.¹, Николаев Е.Н.², Попов И.А.¹^,3
Учреждения:
1. Московский физико-технический институт
2. Сколковский институт науки и технологий
3. Сибирский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 58, № 6 (2024)
Страницы: 472-482
Раздел: РАДИАЦИОННАЯ ХИМИЯ
URL: https://journal-vniispk.ru/0023-1193/article/view/281554
DOI: https://doi.org/10.31857/S0023119324060071
EDN: https://elibrary.ru/THOJOH
ID: 281554

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Повышение чувствительности и точности идентификации летучих органических соединений в случае их исследования при помощи масс-спектрометрических газоанализаторов с ионизацией на основе электронного удара может быть осуществлено путем увеличения числа образующихся в ионном источнике ионов за счет варьирования энергии ионизирующих электронов. В работе представлено сравнение данных, полученных ионизацией электронным ударом при значениях энергии электронов (ЭЭ) в диапазоне 25–105 эВ для ряда органических веществ, принадлежащих различным классам органических соединений. Для интерпретации динамики изменения интенсивностей пиков ионов-фрагментов был проведен анализ с использованием матриц подобия, основанных на различных метриках сходства и было показано влияние ЭЭ на вероятность образования основных фрагментарных частиц исследуемых веществ и, соответственно, на сходство регистрируемого масс-спектра с эталонным масс-спектром из базы данных.

Ключевые слова

масс-спектрометрия, электронный удар, ионизация, фрагментация, молекулярный ион

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Одним из наиболее распространенных методов ионизации в масс-спектрометрии органических соединений является электронный удар [1]. Распространенность этого метода связана с его простотой, надежностью и универсальностью, что позволяет получать воспроизводимые масс-спектрометрические данные. Ионизация электронным ударом при количественном измерении масс-спектров обычно осуществляется при энергии электронов, определяемой в условиях конкретного эксперимента, и находится в интервале от 40 до 90 эВ, в большинстве методов энергию электронов конвенционально устанавливают равной 70 эВ [2, 3]. Эта величина выбрана масс-спектрометрическим сообществом исходя из близости интенсивностей пиков в масс-спектрах к максимуму при ионизации большинства нейтральных молекул и из-за отсутствия при такой энергии ионизации двухзарядных ионов [3]. Основные базы данных масс-спектров (БД-МС) содержат спектры, измеренные при энергии электронного удара в 70 эВ. Самыми известными из них являются референсные базы NIST и Wiley. В настоящее время разрабатываются новые базы данных масс-спектров с ионизацией электронным ударом и новыми быстрыми алгоритмами их сопоставления [4].

В практических аналитических задачах при идентификации соединений по масс-спектрам электронного удара принято сравнивать измеренный спектр со спектральными данными из упомянутых выше БД-МС. Их прямое совпадение позволяет констатировать идентификацию конкретного вещества. Однако масс-спектры аналитов из-за особенностей масс-спектрометров и отличий условий измерения масс-спектров, даже после разделения на хроматографической колонке, часто имеют лишь частичное совпадение с данными БД-МС, что приводит к неопределенности в интерпретации спектральных данных. Для разрешения этой проблемы используют различные методики обработки данных и метрики сходства спектров. Типичные шаги при этом включают удаление фонового спектра, программное подавление шумов, а также разделение перекрывающихся пиков. После проведения процедуры обработки данных становится возможным сравнивать спектры, применяя различные метрики сходства, такие как косинусная мера, коэффициент корреляции Пирсона, евклидово и манхэттенское расстояния [5–7].

Каждая из этих метрик имеет свои особенности, преимущества и недостатки. Косинусная мера позволяет сравнивать вектора в многомерном пространстве. Ее величина лежит в диапазоне от –1 до 1 [8, 9]. Большая величина косинусной меры говорит о высокой схожести векторов, а значит, схожести соответствующих им масс-спектров. Необходимо заметить, что так как вектора, соответствующие масс-спектрам, имеют только неотрицательные компоненты, косинусная мера может принимать лишь неотрицательные значения, т.е. в рассматриваемой задаче ее величина лежит в диапазоне от 0 до 1. Такую метрику называют нормированной. Похожей метрикой является коэффициент корреляции Пирсона [10]. Она позволяет установить линейную зависимость между двумя многомерными векторами. К недостаткам этой метрики можно отнести чувствительность к выбросам и предположение о линейной зависимости данных. Величина коэффициента корреляции Пирсона лежит в диапазоне от –1 до 1, то есть эта метрика не является нормированной, что представляется еще одним недостатком по сравнению с косинусной мерой. Евклидово и манхэттенское расстояния являются мерами дистанций между точками в многомерном пространстве, что позволяет учитывать изменение абсолютных величин интенсивностей пиков в масс-спектрах [11–13]. К существенным недостаткам этих метрик можно отнести их ненормированность, а также невозможность интерпретации абсолютных значений расстояний. Другими словами, уместно говорить лишь о сравнении расстояний, а не их значениях по отдельности, что нивелирует эффект влияния общей интенсивности масс-спектра на величину метрики.

Увеличение эффективности ионизации может не только повышать чувствительность масс-спектрометрического анализа, но и увеличивать точность идентификации соединений [14–16]. При ионизации электронным ударом поиск оптимальных условий эффективной ионизации может осуществляться путем варьирования величины энергии электронного удара. Действительно, органические молекулы, относящиеся к различным классам органических соединений, будут по-разному фрагментироваться под действием электронного удара. Варьирование величины ЭЭ, вероятно, может влиять на изменение фрагментарного состава органических молекул, относящихся к разным классам соединений. Качественный состав совокупности осколочных и перегруппировочных фрагментов при этом не должен меняться в силу относительной устойчивости химических связей, образующих ионизируемую молекулу [17].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Эксперименты проводились на высоколетучих веществах, принадлежащих к различным классам органических соединений – н-гексан, 2,2,4-триметилпентан, циклогексан, нитрометан, хлороформ, изопропанол, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран, этилформиат, этилацетат, изопропилацетат, бутилацетат, толуол, анилин и пиридин. Все вещества соответствовали маркам ЧДА или ОСЧ. Предварительно чистоту выбранных органических соединений проверяли методом газовой хроматографии, совмещенной с масс-детектором с помощью ГХ-МС Альфа Маэстро (Интерлаб, Россия).

Спектры измеряли с помощью газового масс-анализатора Residual Gas Analyzer (RGA-300) с прямым интерфейсом ввода пробы. Данный анализатор представляет собой масс-спектрометр квадрупольного типа и позволяет изменять ЭЭ от 25 до 105 эВ, поэтому были выбраны следующие энергии электронов: 25, 45, 70, 90 и 105 эВ.

В эксперименте добивались устойчивого сигнала от молекул атмосферного воздуха при энергии электронного удара 70 эВ и записывали фоновые масс-спектры при скорости сканирования 1491 а.е.м/с в диапазоне 1–150 а.е.м. Затем в анализатор вводилась проба исследуемого вещества из виалы, и измерялся масс-спектр без изменения параметров анализатора. Эксперимент проводился с трехкратным повторением. Аналогично получались масс-спектры при остальных значениях ЭЭ. Перед началом ввода пробы очередного вещества входной интерфейс промывали смесью растворителей с последующей дегазацией, в результате чего удалось добиться отсутствия сигналов от них.

Для получения корректных масс-спектров органических веществ из спектров аналитов вычитались соответствующие фоновые спектры при каждой энергии ионизации в автоматическом режиме. Фоновые спектры содержали пики с m/z равными 2, 14, 16, 18, 28, 32, 40 и 44 Да, соответствующих основному составу атмосферного воздуха.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Среди проанализированных веществ присутствуют алифатические органические соединения без функциональных групп, алкилгалогениды, нитрозамещенные алканы, одноатомные спирты, простые и сложные эфиры, а также ароматические соединения, содержащие гетероатом в цикле и, соответственно, не содержащие его. Представленные в данной работе вещества не покрывают все классы органических соединений, но позволяют наблюдать общие закономерности изменения масс-спектров при изменении ЭЭ. Гораздо больший интерес вызывает сравнение гомологов, изомеров или соединений с единственным различием, например, функциональной группы.

После нормирования интенсивностей пиков на максимальную величину ионного тока, полученные масс-спектры органических веществ при ионизации электронным ударом в 70 эВ сравнивали с таковыми из базы данных NIST 2020 (рис. 1а). Для вычисления метрик сходства масс-спектры представлялись в виде векторов одинаковой размерности, для которых можно использовать классические метрики: косинусную меру, коэффициент корреляции Пирсона, евклидово и манхэттенское расстояния. Для каждого вещества были составлены матрицы сходства из приведенных выше метрик [6]. Составление матриц осуществлялось с помощью написанной нами на языке Python программы, включающей загрузку спектральных данных, их предобработку, вычисление метрик и визуализацию результатов.

Рис. 1. Масс-спектры изопропанола, полученные ионизацией электронным ударом. (а) при 70 эВ в сопоставлении со спектром из БД NIST; (б) при 25 эВ в сопоставлении со спектром, полученным при 70 эВ; (в) при 105 эВ в сопоставлении со спектром, полученным при 70 эВ.

При детальном анализе полученных при различных ЭЭ спектров, нами учитывались только ионные фрагменты, соответствующие значениям m/z из базы данных NIST. При этом не принимались во внимание пики, интенсивность которых оказывалась менее 0.9% от максимального. Каждое массовое число в спектре из БД-МС NIST было соотнесено с ионным фрагментом молекулы и сравнивалось с полученным спектром при ЭЭ в 70 эВ, затем этот спектр сравнивался со спектрами, полученными при других энергиях электронного удара (рис. 1). Как видно из рис. 1, в масс-спектре изопропанола, измеренного при ЭЭ = 25 эВ, наблюдается пик, соответствующий молекулярному иону, а в масс-спектре, регистрируемом при ЭЭ = 105 эВ, он исчезает.

Максимальные интенсивности пиков в масс-спектрах, представленных в данной работе веществ, соответствовали наиболее устойчивым ионам. Так, например, в спектрах изопропанола пик с максимальной интенсивностью соответствует этанольному карбкатиону, полученному при отщеплении одной метильной группы. При этом интенсивность изопропанольного карбкатиона оказывается достаточно низкой (3.8%) несмотря на то, что такой карбкатион более стабилен. Вместо этого наблюдается максимальный пик с массовым числом 45, соответствующий иону C2H5O+, что объясняется правилом выброса максимального алкила [2]. Таким образом, интенсивность пика зависит не только от устойчивости иона, но и от геометрического строения молекулы. Это позволяет различать изомеры при регистрации масс-спектров по соотношению интенсивностей пиков [8, 9, 18]. Также максимальной или, по крайней мере, весьма высокой интенсивностью обладают пики, соответствующие реакции перегруппировки по Мак-Лафферти. Такое поведение демонстрируют, например, сложные эфиры. Вместе с тем при электронном ударе могут образовываться малоустойчивые катионы и катион-радикалы, которые тем не менее могут быть детектированы, но с низкой интенсивностью. Например, образование крайне неустойчивого арильного карбкатиона при регистрации масс-спектра толуола маловероятно, в то время как устойчивый аллильный карбокатион дает сигнал в масс-спектре изопропанола.

Понижение ЭЭ ниже 70 эВ ожидаемо приводит к меньшей фрагментации и, как следствие, повышению интенсивности молекулярного иона (рис. 1) [14]. Однако в случае, если молекулярный ион не наблюдается в спектре при 70 эВ, то при понижении ЭЭ его появление не ожидается по причине неустойчивости конкретного молекулярного иона. Фрагментация исходной молекулы происходит даже при значительном понижении ЭЭ. В случае же устойчивого молекулярного иона малые ионные фрагменты молекулы могут не наблюдаться при снижении ЭЭ либо их интенсивность оказывается существенно ниже референсной интенсивности, представленной в БД. Следует отметить, что интенсивности сигналов от ионных фрагментов в абсолютных величинах падают относительно регистрации спектра при 70 эВ.

Повышение ЭЭ относительно 70 эВ приводит к росту фрагментации молекул. При этом качественного изменения ионных форм не наблюдается, происходит лишь более глубокая фрагментация молекул (рис. 2). Так, например, масс-спектры ТГФ, полученные при ионизации электронным ударом (рис. 2), демонстрируют наличие молекулярного иона при 25 эВ, уменьшение его интенсивности при 45 эВ и отсутствие при 105 эВ. При этом в спектре, полученном при 105 эВ, растут интенсивности пиков, соответствующих малым ионным фрагментам молекулы ТГФ (рис. 2г).

Рис. 2. Масс-спектры ТГФ, полученные ионизацией электронным ударом (а) при 70 эВ в сопоставлении со спектром из БД NIST; (б) при 25 эВ в сопоставлении со спектром, полученным при 70 эВ; (в) при 45 эВ в сопоставлении со спектром, полученным при 70 эВ; (г) при 105 эВ в сопоставлении со спектром, полученным при 70 эВ.

Однако с увеличением энергии электронного удара интенсивности сигналов от ионных фрагментов растут в абсолютных величинах. В ряде случаев это приводит к появлению наблюдаемого молекулярного иона и крупным ионным фрагментам молекул, нерегистрируемых при ЭЭ ниже 70 эВ (рис. 3). Как правило, это наблюдается для небольших органических соединений, при электронной бомбардировке которых образуются стабильные молекулярные ионы. В масс-спектрах этилацетата, представленных на рис. 3, при ЭЭ 90 эВ наблюдается молекулярный ион, в то время как при ЭЭ 70 эВ он отсутствует. Следует отметить, что в эталонном спектре этилацетата (БД-МС NIST) присутствует пик с массовым числом 88 и интенсивностью 7%, соответствующий молекулярному иону, что показывает его принципиально возможную устойчивость. Молекулярный ион, однако, может не наблюдаться в конкретных условиях (давление, конструкция ионной оптики), реализованных в используемом в настоящей работе масс-спектрометре. Повышение энергии электронов приводит к увеличению абсолютного количества образующихся ионов, что позволяет детектировать их.

Рис. 3. Масс-спектры этилацетата, полученные ионизацией электронным ударом (а) при 70 эВ в сопоставлении со спектром из БД NIST; (б) при 90 эВ в сопоставлении со спектром, полученным при 70 эВ.

Таким образом, нельзя однозначно считать, что повышение ЭЭ приводит к исчезновению в масс-спектрах крупных ионных фрагментов молекул или молекулярных ионов, равно как и понижение энергии электронного удара не всегда приводит к регистрации молекулярных ионов и отсутствию мелких ионных фрагментов молекул. Данная неоднозначность продиктована спецификой строения каждой из органических молекул и электронными эффектами в них.

Кривые эффективности ионизации для ряда катион-радикальных ионов н-гексана (рис. 4) имеют характерный вид с максимумом при 70 эВ и дальнейшим монотонным спадом. Похожие зависимости наблюдалась для заряженных частиц, полученных при ионизации большинства соединений, участвовавших в данном исследовании (циклогексан, изопропанол, нитрометан, бутилацетат, толуол, анилин и пиридин). Для вещества из того же класса органических соединений – 2,2,4-триметилпентана – наблюдается аналогичный вид кривой, хотя максимум приходится на 90 эВ. Такой вид семейства кривых наблюдался для большинства заряженных частиц этилацетата, изопропилацетата и тетрагидрофурана.

Рис. 4. Кривые эффективности ионизации для основных фрагментарных ионов (а) н-гексана, (б) 2,2,4-триметилпентана.

Однако кривые эффективности ионизации сложных эфиров, за исключением бутилацетата, имеют монотонно восходящий вид (рис. 5). Вероятно, точка перегиба находится при ЭЭ выше 105 эВ. Это может быть связано с высокой устойчивостью образующихся заряженных частиц в условиях образования довольно небольших фрагментов молекул. Рост массового числа фрагментов от более тяжелых сложных эфиров приводит, по-видимому, к снижению эффективности ионизации при увеличении ЭЭ, в результате чего кривая приобретает классический вид (рис. 5).

Рис. 5. Кривые эффективности ионизации для основных фрагментарных ионов (а) этилформиата, (б) бутилацетата.

На рис. 6 приведены матрицы сходства спектров 2,2,4-триметилпентана, полученные на энергиях 25, 45, 70, 90 и 105 эВ, а также со спектром этого соединения из базы данных NIST. Эти матрицы позволяют сделать вывод о хорошем сходстве экспериментальных спектров 2,2,4-триметилпентана с эталонным спектром, взятым из БД NIST. Спектры на одинаковых уровнях энергий совпадают с хорошей точностью, о чем свидетельствуют значения косинусных мер и коэффициента корреляции Пирсона близкие к 1 и сравнительно небольшие значения расстояний, из чего следует сходимость эксперимента. При сравнении спектров, полученных при разных ЭЭУ, метрики показывают меньшее сходство.

Рис. 6а. Матрица косинусных мер для 2,2,4-триметилпентана.

Рис. 6б. Корреляционная матрица (Пирсона) для 2,2,4-триметилпентана.

Рис. 6в. Матрица евклидовых расстояний для 2,2,4-триметилпентана.

Рис. 6г. Матрица манхэттенских расстояний для 2,2,4-триметилпентана.

Поскольку косинусная мера обладает рядом существенных преимуществ, по сравнению с остальными метриками, далее будем использовать только ее для определения сходства спектров. Она нормирована (в отличие от коэффициента корреляции Пирсона) и обладает информативностью величины (в отличие от евклидового и манхэттенского расстояний, где смыслом обладают лишь отношения расстояний друг к другу).

Матрица косинусных мер для серии масс-спектров н-гексана показывает наибольшее сходство с базой данных NIST при 70, 90 и 105 эВ (рис. 7а). При сравнении спектральных данных между собой на разных энергиях ионизации видно высокое сходство спектров, полученных при 70 эВ, со спектрами, полученными при других энергиях ионизации. В тоже время заметна слабая корреляция между образцами, измеренными при 25 и 45 эВ. Это связано прежде всего с различиями интенсивностей пиков или вовсе их отсутствием для малых осколочных катион-радикальных фрагментов молекулы. Матрицы косинусных мер для масс-спектров этилацетата и бутилацетата (рис. 7б, в) показывают хорошую повторяемость эксперимента, сходимость спектральных данных с БД-МС NIST, а также свидетельствуют о высоком подобии спектров при изменении ЭЭ.

Рис. 7. Матрица косинусных мер

(а) для н-гексана, (б) для этилформиата, (в) для бутилацетата.

ВЫВОДЫ

Сравнение данных масс-спектрометрических экспериментов с помощью матриц подобия, основанных на метриках сходства, наглядно подтверждают, что понижение ЭЭ приводит к снижению эффективности ионизации и, как следствие, уменьшению интенсивности сигналов от ионных фрагментов в абсолютных величинах. Ионизация молекул электронным ударом с энергией ниже 70 эВ может приводить к менее жесткой ионизации и образованию молекулярных ионов за счет снижения эффективности фрагментации генерируемых ионов. При этом не следует ожидать образования молекулярных ионов, если они не наблюдаются в спектре ЭЭ 70 эВ, поскольку это связано с их низкой стабильностью, а следовательно, понижение ЭЭ не может служить методом получения молекулярных ионов. Малые ионные фрагменты молекулы при ЭЭ с энергией электронов ниже 70 эВ могут отсутствовать в масс-спектре, или их интенсивности окажутся ниже эталонных интенсивностей, представленных в БД.

Напротив, увеличение ЭЭ приводит к повышению эффективности ионизации и росту интенсивностей сигналов от ионных фрагментов в абсолютных величинах. Повышение ЭЭ может приводить к появлению наблюдаемого молекулярного иона и крупным ионным фрагментам молекул, не регистрируемых при более низких ЭЭ, что, однако, связано не с изменением механизма ионизации, а с ростом абсолютных интенсивностей всех сигналов. Повышение ЭЭ приводит к увеличению интенсивностей малых фрагментов молекул, при этом новых ионных форм не образуется, а лишь увеличиваются интенсивности пиков, соответствующих небольшим ионным фрагментам.

Зависимости интенсивности сигнала от энергии электронного удара для многих заряженных частиц проходят через максимум в районе 70–90 эВ, но возможно смещение максимума в область больших ЭЭ. Поиск таких областей является одной из фундаментальных задач масс-спектрометрии и может быть осуществлен путем анализа полученных на спектрометрах с широким диапазоном варьирования ЭЭ-данных с применением матриц подобия. Среди матриц подобия наиболее информативными и удобными в использовании являются матрицы, основанные на косинусных мерах. Таким образом, создание программ по обработке и сравнению масс-спектрометрических данных и приборов с широким диапазоном варьирования ЭЭ также является актуальной задачей для будущих исследований.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена в рамках госзадания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-03-2023-106).