Protein of unknown function from variovorax paradoxus with amino acid substitution n174k is able to form schiff base with plp molecule

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Pyridoxal-5'-phosphate (PLP)-dependent enzymes are one of the most widely represented groups of enzymes in organisms, performing more than 150 different catalytic functions. Based on the three-dimensional structure, members of this group are divided into seven (I-VII) different fold types. Cofactor binding in these enzymes occurs due to the formation of a Schiff base with a conserved lysine residue located in the active site. A recently discovered protein from the bacterium Variovorax paradoxus (VAPA), which belongs to the IV fold type and has significant structural similarity to transaminases, contains an asparagine residue at the catalytic lysine position in the transaminases and, as a result, cannot form a Schiff base with PLP and does not have aminotransferase activity. In this research, a point mutant of VAPA protein with the N174K substitution was obtained and its 3D structure was determined. Analysis of the structural data showed that the introduced mutation restores the ability of VAPAN174K to form a Schiff base with a cofactor.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Большинство известных ферментов с уникальной активностью произошло из ранее существовавших ферментов с другой функцией, относящихся к тому же типу пространственной укладки [1]. В качестве примера можно привести пиридоксаль-5´-фосфат (PLP)-зависимые ферменты, представители которых, относящиеся к одному из семи (I–VII) типов пространственной укладки, могут катализировать различные типы реакций, несмотря на структурную гомологию [2, 3].

К суперсемейству PLP-зависимых ферментов IV типа укладки относятся 4-амино-4-дезоксихоризматлиазы (EC 4.1.3.38) и трансаминазы трех канонических семейств, а именно трансаминазы D-аминокислот (EC 2.6.1.21), трансаминазы разветвленных L-аминокислот (EC 2.6.1.42), (R)-амин:пируваттрансаминазы (EC 2.6.1.X) [3–6]. К данному суперсемейству был ранее отнесен белок VAPA, ген которого обнаружен в геноме β-протеобактерии Variovorax paradoxus штамма B4 при биоинформатическом поиске PLP-зависимых трансаминаз [1]. Отличительной особенностью данного белка являлась замена в его аминокислотной последовательности консервативного у PLP-зависимых ферментов каталитического остатка лизина на аспарагин (N174 по нумерации VAPA). Остаток лизина необходим для образования основания Шиффа с PLP и проведения каталитического цикла у большинства известных PLP-зависимых ферментов [1, 7], исключения крайне редки [8]. Проведенный ранее структурный анализ показал, что помимо высокого уровня сходства по первичной последовательности с PLP-зависимыми трансаминазами IV типа VAPA имеет с ними значительное сходство по трехмерной структуре [1]. Более того, согласно структурным данным, VAPA сохранил в кристалле способность связывать PLP без образования основания Шиффа [1]. Тем не менее оставался открытым вопрос о способности белка связывать кофактор при наличии лизина в его консервативном положении в предполагаемом активном центре.

Для решения поставленной задачи в настоящей работе получили структуру мутантного варианта белка (VAPAN174K), имеющую остаток лизина в позиции, соответствующей каталитическому лизину функциональных PLP-зависимых трансаминаз. Проведенный сравнительный структурный анализ показал, что остаток лизина в варианте VAPAN174K способен образовывать основание Шиффа с PLP по типу трансаминаз, а также выявил уникальные по отношению к классическим трансаминазам остатки, координирующие кофактор в активном центре белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистка и выделение белка. Получение кристаллов холофермента.

Очистку и выделение белка VAPAN174K проводили по протоколу, описанному ранее [1]. Для хранения и кристаллизации в очищенный раствор VAPAN174K добавляли 1 мМ PLP.

Для поиска начальных условий кристаллизации был проведен скрининг условий с использованием роботизированной системы кристаллизации Rigaku (USA) и коммерческого набора PegIon HT (HamptonResearch, USA). Концентрация белка составила 20 мг/мл, кристаллизационный скрининг проводили методом газовой диффузии (вариант “сидячая капля”). Для улучшения качества и размера полученных кристаллов была проведена оптимизация условий с использованием метода газовой диффузии (вариант “висячая капля”). Кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного эксперимента, росли в течение двух недель в следующих условиях: 12% v/v Tacsimate, pH 7.0, 16% Polyethylene glycol 3.350 при температуре 288 К.

Рентгеноструктурное исследование VAPAN174K проводили при температуре 100 К, кристаллы были предварительно криопротектированы 20%-ным раствором глицерина путем обмакивания в него на 10 с. Сбор дифракционных данных проводили на лабораторном дифрактометре Rigaku D XtaLAB Synergy-S (ИОХ РАН, Москва) с использованием детектора HyPix-6000HE (табл. 1), обработку полученных данных – с использованием программного комплекса CrysAlisPro (v.171.42.102a) и программы Aimless [9].

 

Таблица 1. Кристаллографические данные и параметры съемки кристалла варианта VAPAN174K

Пр. гр.

I121

a, b, c, Å

94.25, 87.34, 104.65

α, β, γ, град

90.00, 99.45, 90.00

λ, Å

1.54

T, K

100

Диапазон разрешений, Å

21.81–2.20 (2.27–2.20)

Число уникальных рефлексов

42508 (3658)

Полнота набора, %

99.8 (99.6)

Повторяемость

13.3 (13.8)

I/σ (I)

11.7 (1.90)

Rmeas, %

23 (143)

CC1/2, %

100 (85)

Примечание. В скобках приведены значения для данных высокого разрешения.

 

Решение, уточнение и анализ пространственной структуры VAPAN174K. Решение полученной структуры мутантного варианта VAPAN174K было проведено методом молекулярного замещения при помощи программы MOLREP [10] из пакета CCP4 [11]. В качестве стартовой модели использовали полученную заранее структуру белка VAPA дикого типа из Variovorax paradoxus (VAPAwt, PDB ID: 7Z79).

Кристаллографическое уточнение структуры было проведено с использованием программ Refmac5 [12] и Coot [13] из пакета CCP4 (табл. 2).

 

Таблица 2. Данные уточнения структуры варианта VAPAN174K

Rfact, %

21.2

Rfree, %

27.1

Общий B-фактор, Å2

38.79

Средний B-фактор по белку, Å2

41.85

Средний B-фактор по растворителю, Å2

29.59

Число неводородных атомов

Белок

6773

Лиганды

1

Растворитель

203

Всего

6977

Среднеквадратичные отклонения

RMSD связей

0.014

RMSD углов

2.245

График Рамачандрана

Наиболее благоприятные, %

97.9

Допустимые, %

2.0

Код PDB

9J32

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение, кристаллизационный скрининг и оптимизация мутантного варианта VAPAN174K. Вариант VAPAN174K из растворимой фракции клеточного лизата был очищен до гомогенности (данные не приведены). Молекулярная масса очищенного фермента, определенная методом гель-фильтрации, составила 197 кДа, что соответствует гомогексамерному состоянию фермента, как это было и для VAPAwt [1].

Для поиска начальных условий кристаллизации варианта VAPAN174K провели широкий скрининг условий кристаллизации, по результатам которого были найдены следующие первоначальные условия кристаллизации: 4% v/v Tacsimate, pH 7.0, 12% Polyethylene glycol 3.350.

С целью улучшения качества и размера полученных кристаллов варианта VAPAN174K провели оптимизацию найденных в ходе скрининга условий, заключающуюся в варьировании параметров кристаллизационной системы (концентрация осадителя и молярность раствора) в области найденных ранее условий. По результатам проведенной оптимизации для варианта VAPAN174K найдены следующие условия кристаллизации: 12% v/v Tacsimate, pH 7.0, 16% Polyethylene glycol 3.350, кристаллы из которых были использованы в рентгеноструктурном эксперименте (рис. 1).

 

Рис. 1. Структура димера варианта VAPAN174K. N-концевой домен показан зеленым цветом, C-концевой домен – красным, междоменная петля – светло-зеленым, а соседняя субъединица – серым. Молекула PLP, ковалентно связанная с остатком K174, показана желтым цветом для одной из субъединиц. На врезке справа сверху приведена фотография кристалла варианта VAPAN174K, использованного в рентгеноструктурном эксперименте.

 

Анализ пространственной структуры варианта VAPAN174K. Структура VAPAN174K получена с разрешением 2.2 Å. В независимой части элементарной ячейки кристалла находились три молекулы белка, две из которых образовывали димер, подобный функциональным димерам трансаминаз. Все три субъединицы были весьма схожи друг с другом (RMSD между ними не превышало 0.1 Å по Сα-атомам). Анализ кристаллических контактов показал, что мутантная форма белка в кристалле является гексамером, представляющим собой тример димеров, также как и VAPAwt [1]. Субъединица варианта VAPAN174K включает в себя малый N-концевой (остатки 1–140 и 310–314) и большой С-концевой (остатки 152–309) домены (рис. 1). Междоменная петля (остатки 141–151) в структуре VAPAN174K частично находится в форме α-спирали (остатки 147–151), как и в случае с VAPAwt. При этом остатки междоменной петли имеют относительно слабую электронную плотность и высокие тепловые факторы во всех субъединицах, что отражает подвижность этих участков.

Остаток K174 имеет четкую электронную плотность, ε-аминогруппа остатка лизина образует основание Шиффа с молекулой PLP (рис. 2). Положение ключевых мотивов предполагаемого активного центра варианта VAPAN174K в целом осталось неизменным относительно структуры VAPAwt (рис. 2), за исключением участков 146–151 междоменной петли, представляющих собой α-спираль (RMSD = 1.55 Å), и остатков петли O-кармана 122–125, которые участвуют в формировании его полости (RMSD = 0.99 Å) (рис. 2). Данные изменения, вероятно, являются следствием образования внутреннего альдимина PLP в структуре VAPAN174K.

 

Рис. 2. Структурные различия варианта VAPAN174K (цветовая схема аналогична рис. 1) и VAPAwt (полупрозрачный серый, PDB ID: 7Z79) в предполагаемом активном центре. Электронная плотность (карта 2Fo–Fc) для внутреннего альдимина показана сетчатой поверхностью (уровень срезки 1σ), пунктиром обозначены участки, отличающиеся по конформации от таковых у VAPAwt. Дополнительные цветовые коды: синий – петля O-кармана, образованная остатками соседней субъединицы; оранжевый – βX- и βY-тяжи N-концевого домена; черный – β-поворот C-концевого домена; желтый – последовательность CNST, представляющая собой петлю с мотивом GAGE у других трансаминаз [1].

 

Как и в структуре VAPAwt, фосфатная группа PLP у VAPAN174K координируется характерными для трансаминаз IV типа укладки взаимодействиями с боковыми группами остатков R73, T234 и T270, а также с атомами азота основной цепи остатков I233 и T220 (рис. 3). В структуре VAPAwt боковая цепь остатка F230 имеет двойную конформацию, что, предположительно, затрудняет (но не полностью препятствует) связывание PLP [1]. В структуре варианта VAPAN174K этот остаток стабилизирован в одной конформации, что открывает карман для связывания PLP, пиридиновое кольцо которого расположено на расстоянии 3.7 Å от F230 и стабилизируется боковой группой последнего посредством стекинг-взаимодействий (рис. 3). Отметим, что некоторые взаимодействия кофактора и белка необычны для трансаминаз IV типа. Так, атом N1 пиридинового кольца кофактора у этих ферментов обычно координируется отрицательно заряженным остатком аспартата или глутамата с длинной боковой группой [6], тогда как гидроксильная группа PLP образует водородную связь с остатком тирозина [3, 5]. Позицию аминокислотного остатка, стабилизирующего N1 пиридинового кольца, у VAPA занимает остаток серина, боковая группа которого в данном случае слишком коротка для того, чтобы напрямую стабилизировать кофактор водородной связью, но остаток S207 взаимодействует опосредованно, через молекулу воды (рис. 3). Атом кислорода О3´ PLP в варианте VAPAN174K образует водородную связь с боковой группой остатка R178. Аналогичный остаток аргинина, координирующий гидроксильную группу PLP, встречается у некоторых 4-амино-4-дезоксихоризматлиаз [14].

 

Рис. 3. Аминокислотные остатки, принимающие участие в связывании PLP в структуре варианта VAPAN174K: а – пространственное расположение остатков, цветовая схема аналогична рис. 2. Молекулы растворителя показаны красными сферами. Для сравнения серым полупрозрачным цветом показано положение молекулы PLP в структуре VAPAwt; б – схема связывания молекулы PLP, сделанная с помощью LigPlot [15]. Водородные связи показаны зеленой пунктирной линией с указанием соответствующих расстояний в ангстремах.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получен мутантный вариант белка с неизвестной функцией из бактерии Variovorax paradoxus (VAPAN174K) и установлена его пространственная структура в комплексе с кофактором – молекулой PLP. Показано, что замена N174K приводит к образованию основания Шиффа между остатком K174 и PLP подобно тому, как это наблюдается в трансаминазах.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2021-1354 от 07.10.2021 г.

×

About the authors

I. O. Ilyasov

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

M. E. Minyaev

Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

T. V. Rakitina

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

A. K. Bakunova

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

V. O. Popov

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

E. Y. Bezsudnova

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

K. M. Boyko

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: kmb@inbi.ras.ru
Russian Federation, Moscow

References

  1. Boyko K.M., Matyuta I.O., Nikolaeva A.Y. et al. // Crystals. 2022. V. 12. P. 619. https://doi.org/10.3390/cryst12050619
  2. Christen P., Mehta P.K. // Chem. Rec. 2001. V. 1. P. 436. https://doi.org/10.1002/tcr.10005
  3. Bezsudnova E.Y., Popov V.O., Boyko K.M. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020. V. 104. P. 2343. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10369-6
  4. Catazaro J., Caprez A., Guru A. et al. // Proteins. 2014. V. 82. P. 2597. https://doi.org/10.1002/prot.24624
  5. Bezsudnova E.Y., Boyko K.M., Popov V.O. // Biochemistry (Moscow). 2017. V. 82. P. 1572. https://doi.org/10.1134/S0006297917130028
  6. Bezsudnova E.Y., Dibrova D.V., Nikolaeva A.Y. et al. // J. Biotechnol. 2018. V. 271. P. 26. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.02.005
  7. Liang J., Han Q., Tan Y. et al. // Front. Mol. Biosci. 2019. V. 6. P. 4. https://doi.org/10.3389/fmolb.2019.00004
  8. Cook P.D., Thoden J.B., Holden H.M. // Protein Sci. 2006. V. 15. P. 2093. https://doi.org/10.1110/ps.062328306
  9. Evans P.R., Murshudov G.N. // Acta Cryst. D. 2013. V. 69. P. 1204. https://doi.org/10.1107/S0907444913000061
  10. Vagin A., Teplyakov A. // J. Appl. Cryst. 1997. V. 30. P. 1022. https://doi.org/10.1107/S0021889897006766
  11. Collaborative Computational Project // Acta Cryst. D. 1994. V. 50. P. 760. https://doi.org/10.1107/S0907444994003112
  12. Murshudov G.N., Skubak P., Lebedev A.A. et al. // Acta Cryst. D. 2011. V. 67. P. 355. https://doi.org/10.1107/S0907444911001314
  13. Emsley P., Cowtan K. // Acta Cryst. D. 2004. V. 60. P. 2126. https://doi.org/10.1107/S0907444904019158
  14. Wallace A.C., Laskowski R.A., Thornton J.M. // Protein Eng. Des. Sel. 1995. V. 8. P. 127. https://doi.org/10.1093/protein/8.2.127
  15. Dai Y.N., Chi C.B., Zhou K. et al. // J. Biol. Chem. 2013. V. 288. P. 22985. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.480335

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Dimer structure of the VAPAN174K variant. The N-terminal domain is shown in green, the C-terminal domain in red, the interdomain loop in light green, and the adjacent subunit in gray. The PLP molecule covalently linked to the K174 residue is shown in yellow for one of the subunits. The inset at the top right shows a photograph of the VAPAN174K variant crystal used in the X-ray crystallography.

Download (507KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Structural differences between the VAPAN174K variant (color scheme similar to Fig. 1) and VAPAwt (translucent gray, PDB ID: 7Z79) in the putative active site. Electron density (2Fo–Fc map) for the internal aldimine is shown as a grid surface (cutoff level 1σ), dotted lines indicate regions that differ in conformation from those in VAPAwt. Additional color codes: blue – O-pocket loop formed by residues of the adjacent subunit; orange – βX- and βY-strands of the N-terminal domain; black – β-turn of the C-terminal domain; yellow – CNST sequence, which is a loop with a GAGE ​​motif in other transaminases [1].

Download (286KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Amino acid residues involved in PLP binding in the VAPAN174K variant structure: a – spatial arrangement of residues, color scheme similar to Fig. 2. Solvent molecules are shown as red spheres. For comparison, the position of the PLP molecule in the VAPAwt structure is shown in gray translucent color; b – PLP molecule binding scheme made using LigPlot [15]. Hydrogen bonds are shown as a green dotted line with the corresponding distances in angstroms indicated.

Download (231KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».