At Shores of a Vanishing Sea: Microbial Communities of Aral and Southern Aral Sea Region

Full Text

До середины ХХ века Аральское море являлось крупнейшим (четвертым по площади) озером мира, располагаясь на границе современных Казахстана и Узбекистана. Площадь Аральского моря в середине ХХ века составляла 66 тыс. км², объем воды равнялся 1070 км³, а минерализация воды составляла лишь 9.9‰. Однако развитие сельского хозяйства в 1960-е годы в Узбекистане и соответствующие ирригационные мероприятия, забирающие воду из рек, впадающих в Аральское море — Амударьи и Сырдарьи, привели к тому, что приток воды в Аральское море сократился на 90%, площадь Аральского моря стала стремительно уменьшаться, а минерализация — возрастать. В настоящее время основная часть площади южной части Аральского моря, так называемого Большого Арала, представляет собой пустынный ландшафт (пустыня Аралкум); собственно море сократилось до узкого гиперсоленого водоема в юго-западной части (Западное Аральское море, рис. S1), минерализация в 2022 году выросла до 22%. Таким образом, современное Аральское море представляет собой экстремальную экосистему. Однако, несмотря на ее уникальность и важнейшее значение для региона, сведения о микробных сообществах Аральского моря и окружающих его местообитаний очень ограничены. Имеется лишь одно сообщение об исследовании этих биотопов методами высокопроизводительного секвенирования, в котором основное внимание уделено микробиомам засоленной почвы (Jiang et al., 2021). Микроорганизмы воды Западного Арала изучались путем создания библиотек клонов генов 16S рРНК архей и бактерий, однако небольшой размер выборки и использование различных систем праймеров для архей и бактерий не позволили дать полноценную количественную характеристику сообществ (Shurygin et al., 2019). Анализ метагенома воды был проведен для Северного (Малого) Арала (Alexyuk et al., 2021), с минерализацией 0.8%, однако эти данные неприменимы к сегодняшнему Западному Аралу, где минерализация гораздо выше. Микробные сообщества почвы, бывшей ранее дном Аральского моря, в том числе ассоциированные с растущими там растениями, исследовались лишь с помощью стандартных культуральных методов, позволивших идентифицировать представителей родов Pseudomonas и Bacillus (Aripov et al., 2016; Stulina et al., 2019). Наконец, данные о разнообразии микроорганизмов в осадках современного Аральского моря и близлежащего озера Судочье отсутствуют.

Целью настоящей работы было исследование с помощью высокопроизводительного секвенирования вариабельных участков генов 16S рРНК микробных сообществ воды и осадков Западного Аральского моря и близлежащего грунта, ранее являющегося дном Аральского моря, а также ассоциированных местообитаний: ризосферы произрастающего на бывшем дне Аральского моря растения и осадков ручья, образовавшегося на месте бывшего дна Аральского моря в результате излива воды из искусственно пробуренной скважины и контрольных точек, не испытывающих влияния вод Аральского моря, а именно плато Устюрт и озеро Судочье.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор образцов для исследования. Образцы воды, осадков и грунта были отобраны осенью 2022 г. из Западного Арала, пустыни Аралкум, с плато Устюрт и из озера Судочье (рис. 1, таблица).

 

Рис. 1. Карта Аральского моря и места отбора образцов

 

Таблица 1. Характеристика образцов Западного Аральского моря и Южного Приаралья, использованных в работе

Обозначение	Координаты	Описание образца	Т,	рН	Минерализация, ‰	Содержание, мг/л
						Cl–	Ca+2	Mg+2	SO4–2	F
Образцы воды и осадков Западного Аральского моря и озера Судочье
AW1	44°33′ 28″ N 58°15′ 40″ E	Вода Аральского моря, 10 м от берега	23	8.3	220.0	117764.1	‒*	‒	10266.8	‒
AW2	44°33′ 32″ N 58°15′ 45″ E	Вода Аральского моря, 100 м от берега	23	8.3	220.0	117764.1	‒	‒	10266.8	‒
AD1	44°33′ 40″ N 58°15′ 43″ E	Осадок Аральского моря, приливная зона	16	‒	‒	87673.1	‒	‒	16036.4	‒
AD2	44°33′ 38″ N 58°15′ 40″ E	Осадок Аральского моря, приливная зона, черный ил	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
AD3	44°33′ 36″ N 58°15′ 39″ E	Осадок Аральского моря, верхняя часть керна	15	‒	‒	101293.4	‒	‒	29177.9	‒
AD4	44°33′ 32″ N 58°15′ 45″ E	Осадок Аральского моря, нижняя часть керна	15	‒	‒	109487.3	‒	‒	8431.3	‒
SD	43°36′ 20″ N 58°30′ 24″ E	Осадок озера Судочье	19	8.1	10.0	3652.0	0.0	0.0	4451.0	0.8
Образцы грунта и почвы у берега Западного Аральского моря и с плато Устюрт
AS	44°33′ 38″ N 58°15′ 35″ E	Грунт бывшего дна Аральского моря, 50 м от кромки воды	‒	8.8	82.0	3640.0	656.0	96.0	4608.0	‒
RS	44°36′ 08.73″ N 58°16′ 57.48″ E	Почва ризоферы Krascheninnikovia еwersmanniana, выросшего на месте бывшего дна Аральского моря	‒	8.4	6.3	105.0	‒	‒	398.0	‒
US1	44°09′ 29.57″ N 58°22′ 31.31″ E	Почва со дна высохшей протоки, плато Устюрт	‒	8.4	4.0	25.0	140.0	12.0	424.0	‒
US2	44°09′ 28.83″ N 58°22′ 31.83″ E	Почва со склона, плато Устюрт N44°33'28''	‒	7.9	13.0	788.0	202.0	52.0	650.0	‒
US3	44°14′ 55.32″ N 58°12′ 01.83″ E	Почва с плато Южный Устюрт	‒	8.8	‒	‒	‒	‒	398.0	‒
Образцы воды из скважин и осадков по изливу ручья, вытекающего из скважины № 1
WW1	43°40′ 52.8″ N 60°02′ 55.1″ E	Вода из скважины № 1, глубина 580 м Немецкий дом	41	7.0	2.1	‒	1.2	0.0	‒	‒
WW2	43°36′ 33.5″ N 60°01′ 46.4″ E	Вода из скважины № 2, глубина 560 м Кувват кран	55	7.6	2.2	‒	2.2	‒	‒	‒
WW3	43°21′ 59.2″ N 59°39′ 57.4″ E	Вода из скважины скважина горячей воды № 3, глубина 0 м	47	8.3	2.5	734.0	3.7	‒	744.0	‒
WM	43°40′ 52.8″ N 60°02′ 55.1″ E	Образец мата, развивающегося на изливе скважины № 1	21	8.0	5.0	598.1	‒	0.0	0	1.1
WD1	43°40′ 52.4″ N 60°02′ 55.1″ E	Осадок под матом на изливе скважины № 1, рыже-черный	19	8.8	6.0	610.0	‒	0.0	681.0	1.0
WD2	43°40′ 52.1″ N 60°02′ 55.1″ E	Черный осадок в 50 м ниже по течению ручья из скважины № 1	18	8.8	20.0	161.0	‒	‒	1900.0	‒

* Нет данных.

 

Параллельно отбирались образцы для исследования физико-химических характеристик и для выделения ДНК с целью последующего профилирования микробных сообществ по гену 16S рРНК. Образцы воды Аральского моря, обозначенные индексом AW (Aral Water), отбирались в 5 л бутыли на расстоянии 100 м от берега на глубине 1 м. В течение 4‒6 ч после отбора эти образцы были отфильтрованы через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (“Трековая мембрана”, Дубна, Россия) для сбора микробной биомассы. Образцы осадков Аральского моря (AD, Aral Deposits) были отобраны в приливно-отливной зоне и в 10 м от берега; в последнем случае был отобран керн осадков с глубины около 1 м от поверхности воды. Глубина керна составила 40 см, и он был разделен на верхнюю (0‒20 см) и нижнюю (20‒40 см) части. Образец осадков озера Судочье (SD, Sudoch’e Deposit) был отобран с помощью металлического пробоотборника с 15 см глубины осадков.

В непосредственной близости от современного берега Аральского моря (50 м) был отобран образец грунта, ранее являвшегося дном Аральского моря и представляющего собой влажный песок (AS, Aral Soil), и аналогичный образец из ризосферы растения терескена Эверсманна — Krascheninnikovia еwresmanniana (RS, Rhizosphere Soil). В качестве контрольной группы были отобраны образцы почвы плато Устюрт (US, Ustyurt Soil). Все образцы грунта и почвы отбирались с глубины от 2 до 20 см (таблица).

Еще одним объектом исследования стали микробные сообщества, развивающиеся на изливе воды одной из скважин, пробуренных на глубину от 560 до 630 м в осушенном дне Арала. Образцы собственно воды из скважин (WW, Well Water) были отобраны в стерильные пятилитровые бутыли. В течение 4‒6 ч после отбора эти образцы были отфильтрованы через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (“Трековая мембрана”, Дубна, Россия). Также были отобраны образцы цианобактериального мата (WM, Well Mat), развивающегося на изливе воды из скважины WW1 и осадков (WD, Well Deposits) ручья, образованного изливом воды из этой же скважины. Образцы мата и осадков отбирались стерильным шпателем.

Все образцы переносились в стерильные пластиковые пробирки типа Фалькон объемом 50 мл (“Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.”, Китай), где были зафиксированы в 20% этаноле в буфере (0.10 М Трис, 0.15 М ЭДТА; рН 7.6) для последующего выделения ДНК, и затем хранились при 4.

Определение физико-химических характеристик образцов. рН воды и водной вытяжки определяли на откалиброванном рН метре Mettler Toledo Five easy F20 (Китай). Концентрацию ионов кальция и магния определяли методом комплексонометрического титрования водной вытяжки раствором 0.05N Трилона Б с использованием хрома кислотного темно-синего в качестве индикатора. Содержание хлорид-иона в водной вытяжке определяли аргентометрически, с добавлением в испытуемый раствор для установления конечной точки титрования хромата калия, который с избытком серебра образует осадок, вызывающий переход окраски раствора от желтой до красно-бурой. Определение сульфата-иона проводили гравиметрическим методом путем осаждения сульфатов раствором BaCl₂ с последующим взвешиванием прокаленного осадка. Определение растворимых форм фтора проводили потенциометрически с использованием фторидных ионоселективных электродов.

Определение филогенетического состава исследуемых микробных сообществ. ДНК из отобранных образцов выделяли, используя коммерческий набор реактивов FastDNA Spin Kit (“MP Biomedicals”, США), в соответствии с инструкцией производителя. Библиотеки V4 гипервариабельного участка гена 16S рРНК были приготовлены с помощью ПЦР по ранее описанной методике (Fadrosh et al., 2014). При этом использовалась следующая система праймеров 515F (5'-GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3') (Hugerth et al., 2014) и Pro-mod-805R (5'-GACTACNVGGGTMTCTAATCC-3') (Merkel et al., 2019). Секвенирование производили на платформе MiSeq (“Illumina”, США), используя реагенты, позволяющие читать по 150 нуклеотидов с каждого конца ампликона. Предполагая достаточно низкую микробную биомассу в исследованных образцах, для обработки последовательностей микробиома был использован метод ASV (ASV — Amplicon Sequence Variant; Callahan et al., 2017; Caruso et al., 2019). Методы, основанные на ASV, позволяют элиминировать из последующего анализа последовательности, содержащие ошибки ПЦР или секвенирования, и, тем самым, позволяют достоверно отличать природные филотипы, различающиеся даже лишь одним нуклеотидом. Этот подход дает возможность более полно и детально описать имеющееся в образце разнообразие филотипов в сравнении с ОТЕ-анализом (Callahan et al., 2017). ASV-таблица была создана с помощью ПО Dada2 (Callahan et al., 2016) и базы данных SILVA 138 (Quast et al., 2013). Статистическая обработка данных, в том числе и подсчет индексов альфа-разнообразия, производили с помощью ПО Rhae (Lagkouvardos et al., 2017) по результатам ASV, что дает возможность учесть полное биологическое разнообразие анализируемых последовательностей. Последовательности фрагментов гена 16S рРНК были депонированы в базе данных SRA (NCBI) под номером биопроекта PRJNA980688.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика исследованных местообитаний

Исследованные нами местообитания можно подразделить на три группы:

(1) естественные водоемы: Западное Аральское море (вода, AW и осадки, AD) и озеро Судочье (осадки, SD);

(2) почвы: грунт дна бывшего Аральского моря (AS), ризофера выросшего там же растения (RS) и взятая в качестве контроля почва плато Устюрт (US);

(3) подземные воды и образуемые ими наземные ручьи: вода из скважин, пробуренных на месте бывшего дна Аральского моря (WW); микробный мат (WM) и осадки ручья (WD).

Основные характеристики отобранных образцов представлены в табл. 1.

Аральское море и озеро Судочье. Образцы воды Аральского моря (АW1 и AW2) отличаются высокой минерализацией, превышающей 200‰, одинаковой в обоих образцах, отобранных в 100 м от берега на расстоянии 100 м друг от друга. Вода Аральского моря также отличается высокой концентрацией сульфат-иона, превышающей 10 г/л.

Осадки Аральского моря были отобраны в 3-х точках, две из которых располагались в приливной зоне (AD1 и AD2), а третья находилась в 10 м от берега с глубиной воды 1 м. Грунт в приливной зоне, откуда отбирались образцы, был покрыт коркой, под которой содержался черный ил. Осадки, находящиеся на глубине 1 м, также представляли собой черный ил. Минерализацию осадков не определяли, однако по содержанию ионов Cl^– видно, что она лишь незначительно ниже минерализации воды. При этом содержание сульфатов в поверхностных пробах осадков было ниже, чем в воде, что говорит о том, что в них, вероятно, идут процессы трансформации соединений серы. Наиболее низкая концентрация сульфатов была в нижнем слое керна, что указывает на возможность протекания там процесса микробной сульфатредукции.

В осадках оз. Судочье (образец SD) общая минерализация составляла лишь 10‰, что соответствует данным о значительном опреснении озера за счет притока воды из канала, соединяющего его с Амударьей. Низкой минерализации соответствовало значительно более низкое, чем в Аральском море, содержание хлорид- и сульфат-ионов.

Засоленные грунты и почвы. Два образца были отобраны на берегу Аральского моря и представляли собой грунт, в прошлом являвшийся морским дном. Образец AS, состоящий из влажного песка, был отобран в 50 м от современного уреза воды Аральского моря. Минерализация этого образца была значительно ниже по сравнению с водой Аральского моря, однако существенно выше, чем в осадках оз. Судочье, при одинаковом содержании хлорид- и сульфат-ионов. В отличие от оз. Судочье, в грунте бывшего дна Аральского моря было отмечено высокое содержание ионов кальция и магния. Образец RS представлял собой почву из ризосферы растения терескена Эверсманна — Krascheninnikovia еwresmanniana, растения, принадлежащего к группе ксерогалофилов, известных своей устойчивостью к засухе и сульфатному засолению. Из таблицы видно, что почва ризосферы K. ewresmanniana при достаточно высоких значениях рН отличается от образца AS значительно более низкой минерализацией и содержанием хлоридов и сульфатов.

Образцы почвы плато Устюрт (US1, US2, US3) были отобраны в качестве контроля. Они отличались высокими значениями рН; минерализация и содержание хлоридов и сульфатов примерно соответствовали параметрам, наблюдавшимся в образце ризосферы терескена (RS).

Подземные воды и ручей. Из трех скважин были отобраны образцы изливающейся воды — WW1, WW2 и WW3. Вода поступала с глубины от 560 до 630 м, изливаясь в виде ручьев, протекающих по засоленной почве, аналогичной образцу AS. Были отобраны образцы осадков ручья, вытекающего из скважины WW1 (образцы WD1и WD2) и микробного мата, развившегося по току этого ручья (образец WM). Исходно температура изливающейся воды достигала значений 41‒55, причем она не коррелировала с глубиной скважин. Далее по току исследуемого ручья температура постепенно снижалась. Минерализация, наоборот, была минимальной на изливе воды (2.1‒2.5 г/л), но повышалась по току ручья, протекающего по засоленной почве, достигая 20 г/л в образце WD2, отобранном в 50 м ниже излива.

Филогенетическое разнообразие микробных сообществ Западного Аральского моря и Южного Приаралья

Общая характеристика. В настоящей работе было проанализировано 18 образцов воды, осадков и грунта из местообитаний, ассоциированных с Аральским морем: морской воды и осадков, осадков обособившегося от Аральского моря оз. Судочье, бывшего дна Аральского моря, пробуренных в нем скважин и вытекающего из одной из них ручья, а также контрольные образцы почвы с плато Устюрт, не подвергавшиеся влиянию Аральского моря и процесса его обмеления.

Исследованные сообщества очень сильно различались между собой даже на уровне филумов (рис. 2).

 

Рис. 2. Относительная представленность (%) филумов прокариот в исследованных образцах. Показаны только филумы с относительной представленностью >1%

 

Наименьшим разнообразием отличались сообщества воды Аральского моря (AW1, AW2), причем отличительной их чертой была значительная представленность галофильного архейного филума Halobacterota. В осадках Аральского моря (AD1–4) число присутствующих филумов значительно возрастало; наибольшим разнообразием отличались осадки оз. Судочье (SD).

Из исследованных сообществ почвы резко выделяется сообщество грунта, ранее являвшегося дном Аральского моря (AS). Как и в воде, там доминируют представители Halobacterota; общее разнообразие филумов незначительно превышает разнообразие в образцах воды. Остальные образцы почвы, включая ризосферу терескена, выросшего на бывшем дне Аральcкого моря, были близки между собой и характеризовались важным признаком почвенных сообществ — присутствием значительного количества представителей Actinomycetota.

Исходно низкое разнообразие филумов в образцах подземной воды (WW1–3) сменяется значительным их разнообразием в образцах мата и грунтов по течению ручья, вытекающего из скважины № 1 (WW1), подложкой которому служит бывшее дно Аральского моря (WM, WD1 и WD2). Сообщества осадков по составу филумов не напоминают ни воду скважин, ни грунт бывшего Аральского моря, а оказываются наиболее близкими осадкам оз. Судочье. Здесь хорошо представлены Cyanobacteriota (образцы MW и WD2); также особенностью сообществ ручья является присутствие значительного количества представителей филума Nitrospirota.

Во всех без исключения образцах доминируют представители филума Pseudomonadota, однако, учитывая высокое филогенетическое и метаболическое разнообразие внутри этого филума, его высокая представленность не поддается интерпретации.

Разнообразие и количественная характеристика исследованных микробных сообществ на уровне наиболее представленных родов иллюстрируется тепловой картой (рис. 3).

 

Рис. 3. Тепловая карта, отражающая численность представителей некоторых родов, составляющих более 5% всего сообщества (синий цвет). Коричневым цветом показаны те же представители в количестве менее 5%

 

В целом родовое разнообразие подтверждает выводы, сделанные на уровне филумов, однако дает более конкретную информацию о присутствующих в сообществе группах микроорганизмов.

Вода и осадки Аральского моря и оз. Судочье. Образцы воды Аральского моря (AW1 и AW2; рис. 3 и рис. S2), оказались качественно схожими и различались лишь в относительных долях доминирующих групп. Галобактерии оказались представлены членами семейства Haloferacaceae (24 и 43% соответственно), включающими три ASV филотипа, до сих пор не полученные в лабораторной культуре. Среди бактерий доминировали бактерии рода Spiribacter (семейство Nitrosococcaceae) (43 и 36% от общего числа прокариот), представленные во всех образцах тремя ASV филотипами. Также в обоих образцах с долей 6 и 9% присутствовал один ASV филотип бактерии рода Psychroflexus (Bacteroidota, порядок Flavobacteriales). В небольших долях (3% и ниже) присутствовали и другие бактерии, представляющие культивируемые и некультивируемые таксоны, в частности, семейств Rhodobacteraceae (9 ASV филотипов) и Balneolaceae (4 филотипа).

Образцы осадков более существенно различались по составу на родовом уровне (рис. 3 и рис. S2). В образце, отобранном в приливной зоне и покрытом сверху минеральной коркой (AD1), доминировали разнообразные бактерии (77% от общего числа прокариот), среди которых следует отметить представителей рода Guyparkeria (8%, один ASV филотип) и сульфатредуцирующих бактерий филума “Desulfobacterota” (29%). Среди них наиболее многочисленными были некультивируемые группы — Desulfosarcinaceae (9%), состоящие из 17 филотипов, и три филотипа группы SEEP-SR81 (6%). Архей было только 17%, и среди них преобладали некультивируемые Woesearchaeales — SCGC AAAВ11-D5, всего 33 ASV филотипа.

В другом образце осадков из приливной зоны (AD2), доминировали представители двух ASV филотипов рода Fusibacter (39%) и 12 ASV филотипов Halanaerobium (11%), а также девять ASV филотипов “Candidatus Omnitrophus” (6%). Археи составляли только 2%, но были достаточно разнообразны и представлены 23 ASV филотипами; среди них можно отметить 12 ASV филотипов Halobacterales и 5 филотипов некультивируемых представителей порядка Woesearchaeales — группа SCGC AAAВ11-D5.

В образцах осадков, взятых в 10 м от берега, также доминировали бактерии: в верхнем слое (AD3) присутствовали два ASV филотипа бактерий рода Guyparkeria (21%), пять филотипов Marinobacter (12%), три филотипа Idiomarina (9%), один филотип Thiomicrospira (5%) и два филотипа Fusibacter (7%), а также 17 филотипов “Candidatus Omnitrophus” (5%). В нижнем слое осадков (AD4) состав бактерий был примерно таким же, но значительно возрастали доли Guyparkeria (34%), представленного одним филотипом, и Thiomicrospira (28%, 1 филотип); доля рода Marinobacter (11%), состоящего из четырех филотипов, снижалась незначительно, Idiomarina (3 филотипа) и Fusibacter (2 филотипа) исчезли совсем, в то время как появился новый член сообщества — Salinivibrio (7%, 1 филотип).

Осадки оз. Судочье (SD) существенно отличались от осадков Аральского моря, в первую очередь присутствием цианобактерий, причем помимо Synechococcus (1 филотип) и Cyanobium (4 филотипа), значительную часть всех Cyanobacteriota (23%) составляли семь разных видов (филотипов) хлоропластов (рис. 3 и рис. S2). Класс Alphaproteobacteria (12% от всех прокариот, 36 филотипов) был представлен разнообразными родами, среди которых доминировали Tropicimonas (1 филотип), Rubribacterium (2 филотипа) и Porphirobacter (2 филотипа). Среди Gammaproteobacteria (33 филотипа) выделялись микроорганизмы цикла серы: Thiobacillus (1 филотип) и семейство Chromatiaceae (10 филотипов), в том числе Thiocapsa (2 филотипа), Thiohalocapsa (1 филотип) и некультивируемые роды. Филум “Desulfobacterota”, включавший 28 филотипов, в образце SD был представлен разнообразными сульфатредуцирующими бактериями: родом Desulfatiglans (7 филотипов) и семейством Desulfosarcinaceae, в котором наиболее значительную долю (21%) занимала некультивируемая группа SVA 0081 (2 филотипа). Также достаточно многочисленными были представители семейства Desulfocapsaceae (3% от всех прокариот, 6 филотипов). Интересно, что 12% от всех “Desulfobacterota” приходилось на бактерии incertae cedis — микроорганизмы неопределенного таксо- номического положения, по всей видимости, представляющие глубокие филогенетические линии. Филум Planctomycetota включал 19 филотипов (4% от всех прокариот) и был в равной доле представлен классами Planctomycetia (38%, 9 филотипов) и Phycisphaerae (37%, 8 филотипов); оставшиеся 25% составляли некультивируемые планктомицеты (4 глубоких линий уровня класса). Филум Verrucomicrobiota (12 филотипов), также был представлен в основном некультивируемыми организмами, в том числе “Candidatus Omnitrophus” (1 филотип) и пятью филотипами класса Kiritimatiellae (1% от общего числа прокариот). Археи оз. Судочье составляли 1.6% от всего сообщества прокариот и были представлены тремя ASV филотипами Woesearchaeales (62%), двумя филотипами Thermoplasmata (18%), причем основным компонентом Thermoplasmata были представители Marine Benthic Group D и DHVEG-1, и одним филотипом Bathyarchaeia (12%). Halobacterota (1 филотип) составили 5% от всех архей и были представлены родом Haladaptatus (1 филотип).

Грунты и почвы. В образце бывшего дна Аральского моря (AS) археи были в основном (95%) представлены разнообразнейшими Halobacterota (12%, 65 филотипов), среди которых наиболее массовыми были представители семейства Haloferacaceae: роды Halonotius (10% от всех прокариот, 5 филотипов) и Halorubrum (5%, 3 филотипа), оба относящиеся к семейству (рис. 3 и рис. S3). Также значительная доля микробиома приходилась на 6 филотипов некультивируемых архей семейства Halomicrobiaceae (всего 24 филотипа; 4% от всех прокариот). 1.9% всего сообщества приходилось на пять филотипов Nanosalinaceae, которые характеризуются наноразмерными клетками и, возможно, симбиотическим образом жизни (Zhao et al., 2022). Бактерии были очень разнообразны: наиболее массовой формой (15% от всех прокариот, три ASV филотипа) были некультивируемые представители семейства Nitrococcaceae (класс Gammaproteobacteria); по 3% приходилось на роды из 5 филотипов Halomonas, 1 филотип Aquisalimonas, Aliidiomarina (4.8%, 1 филотип), также относящиеся к этому классу.

В образце почвы, являвшемся ризосферой терескена (K. еwresmanniana), профиль сообщества абсолютно изменялся. Археи составляли всего 4%, и на 99% были представлены семейством Nitrososphaeraceae (9 филотипов) (рис. 3 и рис. S3). Остальные 96% были представлены бактериями, причем Pseudomonadota составляли только 24% от общего числа прокариот, среди которых доминировали не Gamma-, a Alfaproteobacteria. Единственным родом в этой группе, доля которого достигала 4% от общего числа прокариот, был род Skermanella (сем. Azospirillaceae). 8% от всех прокариот приходилось на филум Bacteroidota (23 филотипа), 33% — на филум Actinomycetota (57 филотипов), представленный родом Rubrobacter (класс Rubrobacteria, 6 филотипов, 5.6%), а также некультивируемыми представителями класса Acidimicrobia и семейства Solirubrobacteraceae (класс Thermoleophilia, 3 филотипа). В филуме Chloroflexota (10% от всех прокариот в образце) доминировали некультивируемые Thermomicrobiales (7 филотипов), относящиеся к группе JG30-KFCM45. Planctomycetota (18 филотипов) составляли 5% от всех прокариот и были представлены классами Planctomyces (75%, в основном некультивируемые представители семейств Pirellulaceae, 9 филотипов), Isosphaeraceae (3 филотипа), Gemmataceae (3 филотипа), а также тремя филотипа Phycisphaerae (WD2101 soil group).

Микробные профили образцов почв плато Устюрт неожиданно оказались сходными с микробным сообществом ризосферы K. ewresmanniana. Главной общей чертой всех почвенных образцов и образца ризосферы оказалось присутствие тех же представителей филума Actinomycetota — Rubrobacter, некультивируемых Acidomicrobia и Solirubrobacteraceae. Среди Chloroflexi во всех образцах существенное место занимали Thermomicrobiales, представленные некультивируемым таксоном JG30-KF-CM45. В образце US2, так же как и в ризосфере терескена, присутствовали бактерии рода Bradirhizobium, в образце US1 — бактерии рода Skermaniella (рис. S4).

Подземные воды и ручьи. Подземные воды локализованы на глубине 560‒630 м под бывшим дном Аральского моря и обладают крайне низкой минерализацией. В этих образцах преобладали бактерии филума Pseudomonadota (от 83 до 88% от общего числа прокариот), причем во всех трех случаях это были бактерии класса Gammaproteobacteria. Доминирующие организмы при этом в каждом случае были различными (рис. 3 и рис. S5). В образце воды WW1 43% от общего микробного разнообразия приходилось на четыре филотипа рода Thiobacillus, 25% — на некультивируемые Gammaproteobacteria; в этом образце присутствовали также представители 34 филотипов Bacillota (7%), Actinomycetota (3%, 19 филотипов), два филотипа Desufobacterota (2%). В образце WW2 доминирующим родом с долей 60% был род Acinetobacter в виде трех филотипов; присутствовали также представители родов, Thiobacillus (6%, 4 филотипа), один филотип Aquabacterium (4%), один филотип Bradyrhizobium (5%). В образце WW3 первое место занимает семейство Comamonadaceae (65%), за ним следуют два филотипа Hydrogenophaga (6%) и два филотипа Sphingomonas (4%).

На изливе воды из скважины К1 развивается зеленый мат (образец WМ). Основными продуцентами органического вещества в нем являются цианобактерии (15% от всех прокариот), причем доминирует среди них один филотип — Leptococcus. Другой массовой группой в образце зеленого мата является филум Nitrospirota, представленный практически единственным родом — Nitrospira, в состав которого входят три филотипа (18% от всех прокариот). Вместо Gammaproteobacteria в цианобактериальном мате доминируют Alphaproteobacteria, доля которых возросла до 26%; наиболее массовой формой там является “Candidatus Alysiosphaera”, представленные тремя филотипами (11%; семейство Genuinicoccaceae).

В сообществе черно-рыжего осадка, находящегося под цианобактериальным матом (образец WD1), снова обнаруживается высокое содержание бактерий филума Nitrospirota (29%), в том числе представителей собственно рода Nitrospira, включающего в себя два филотипа (20%), один филотип Thermodesulfovibrio (5%) и пять некультивируемых филотипов класса Thermodesulfovibrionia (3.3%). Помимо Thermodesulfovibrio, в цикле серы в этом сообществе могут участвовать шесть некультивируемых филотипов некультивируемой группы Sva0485 (11%), для которой была показана способность к сульфатредукции, и бактерии рода Sulfurifustis (6%, 1 филотип), окисляющие соединения серы. Интересно также присутствие в сообществе бактерий рода “Candidatus Brocadia” (1 филотип, 2.7%), осуществляющих анаэробное окисление аммония.

И еще больше возрастает разнообразие прокариот в образце WD2 — черном осадке в 50 м от излива скважины — большинство прокариот в нем представлены долями менее 3%. Исключение составляют хлоропласты, говорящие о присутствии в сообществе эукариотных водорослей — 15%. Следует отметить также присутствие в сообществе пяти филотипов некультивируемых Gammaproteobacteria, обозначаемых индексом Run-SP154 (2%), и десяти некультивируемых ASV филотипов Anaerolineaceae (6.4%). На Desulfobacterota приходился 21 филотип, что составляет 8.5% от всего сообщества.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этой работе мы исследовали разнообразие прокариот в трех группах местообитаний: (1) водоемов — современного Западного Аральского моря и озера Судочье, в прошлом соединенного с морем протокой (вода и осадки); (2) почвы, являвшейся ранее дном Аральского моря, в том числе в области ризосферы произрастающего на ней растения; (3) сообществ, развивающихся на бывшем дне Аральского моря при увлажнении его водой, вытекающей из пробуренной скважины. В результате анализа вариабельного участка гена 16S рРНК архей и бактерий исследованные сообщества были охарактеризованы по уровню имеющегося в них разнообразия прокариот. На рис. 4 представлены значения индекса Шеннона для исследованных местообитаний.

 

Рис. 4. Индекс разнообразия Шеннона (ось Y). Наименьшее разнообразие ASV филотипов наблюдается в образцах AW2, WW3, AW1, AD4 и WW2. Наибольшее разнообразие ASV филотипов выявлено в образцах ризосферы (RS), с плато Устюрт и из оз. Судочье (SD)

 

Наименьшим разнообразием отличаются сообщества воды Аральского моря с минерализацией 22%. Значительную часть обитающих в воде Аральского моря прокариот составляют некультивируемые археи семейства Haloferacaceae — их средняя доля, вычисленная на основании двух независимых измерений, составляла 33%. Представители Haloferacaceae являются облигатными аэробами и органотрофами, экстремальными галофилами, растущими в интервале солености от 2.5 до 5.2 мМ. Бактериальная часть сообщества воды Аральского моря представлена разнообразными бактериями, также аэробами и органотрофами. И в том, и в другом исследованном образце доминировали три филотипа бактерий рода Spiribacter (среднее содержание 39%), типовой вид которого был выделен из солеварни в Испании (Leon et al., 2014). Этот организм также является аэробным органотрофом, но уже умеренным галофилом, растущим в интервале 10‒25% NaCl. Из других обнаруженных в воде Аральского моря бактерий (8.5% от всего сообщества) можно отметить один филотип представителей рода Psychroflexus (Bowman et al., 1998) — аэробных органотрофов, среди которых имеются и мезофильные, умеренно-галофильные виды (Donachie et al., 2004). Следует отметить полное отсутствие фототрофных прокариот в образцах воды Аральского моря; можно предположить, что энергетическими субстратами эту экосистему обеспечивают микроскопические эукариоты, не учтенные в этом исследовании.

Еще одной группой образцов с низким значением индекса Шеннона были образцы воды из глубинных скважин, что соответствует представлению о подземной биосфере как крайне разреженной. Наконец, низкое разнообразие было выявлено в одном из образцов донных осадков (AD4), представляющем собой нижнюю часть 40 см керна, что, видимо, объясняется малым притоком энергетических субстратов в нижние слои осадков. Те же самые образцы, которые характеризуются низкими значениями индекса Шеннона, оказались наиболее бедными с точки зрения видового богатства (рис. 5).

 

Рис. 5. Богатство (Richness) ASV филотипов. Ось Y — количество ASV филотипов. Наименьшее количество филотипов представлено в образцах AW2, AW1 и WW3. Наибольшее количество филотипов представлено в образце SD (оз. Судочье)

 

Оба использованных индекса возрастают в случае трех оставшихся образцов осадков Аральского моря (рис. 4 и 5). В образцах AD1–3 архей значительно меньше, чем в воде (от 2 до 17%), и среди них доминируют некультивируемые представители Woesearchaeales, причем везде одной и той же группы — SCDC AAA B11-D5. Среди бактерий, обитающих в осадках Аральского моря, присутствуют аэробные (Marinibacter, Idiomarina), факультативно-анаэробные (Salinivibrio) и облигатно-анаэробные (Halanaerobium, Fusibacter) органотрофы. Разнообразие и обилие сульфатредуцирующих (Desulfobacterota) и сероокисляющих (Thiomicrospira, Guyparkeria) свидетельствует об активно протекающем в осадках Арала цикле серы, что коррелирует с высоким содержанием в них сульфатов (от 8 до 29 г/л).

Нельзя не обратить внимание на присутствующую в некоторых образцах осадков некультивируемую бактерию “Candidatus Omnitrophus”. Ее доля составляет 5‒6% от общей численности прокариот, и появляется она в осадках с преобладанием анаэробных условий — черном сероводородном иле прибрежной зоны (образец AD2) или нижнем горизонте осадков, отобранных в 10 м от берега (AD3). “Omnitrophota” — недавно описанная глубокая линия уровня филума, которая повсеместно распространена, однако обычно ее доля не превышает 0.1%. Культивировать эти бактерии до сих пор не удавалось, однако сведения об их метаболизме и образе жизни удалось воссоздать путем single-cell секвенирования (Perez-Molphe-Montoya et al., 2022). Исследованные нами местообитания с относительно высоким содержанием “Omnitrophota” могут стать оптимальным полигоном для их исследования.

Микробное сообщество бывшего дна Аральского моря, представляющего теперь засоленный песок, по своему составу оказались ближе к сообществам воды Арала, чем к осадкам, в первую очередь по примерно равным долям архей и бактерий и доминированию Halobacterota. Оно находится в середине графика, характеризующего индекс Шеннона (рис. 4) и в нижней части графика, иллюстрирующего видовое богатство исследуемых сообществ (рис. 5). Однако проведенные нами исследования того же грунта, но подвергшегося влиянию произрастающего на нем растения или изливающейся из глубинной скважины воды, показывают, как легко возвращается микробное разнообразие при снижении минерализации. Так, в ризосфере растущего на этом же засоленном песке растения минерализация резко падает, и одновременно меняется состав сообщества, приобретая черты почвы, характерной для плато Устюрт (рис. 4 и 5). Точно так же увлажнение песка водой из скважины, содержащей крайне бедный микробиом, дает возможность развиваться цианобактериальным матам и сопутствующим им органотрофам, осуществляющим разложение новообразованного органического вещества (рис. 4 и 5).

Наконец, самым богатым из всех исследованных образцов с точки зрения разнообразия является озеро Судочье. Ранее оно подпитывалось водами Амударьи и соединялось протокой с Аральским морем. Так же как и Аральское море, в связи с развитием системы оросительных каналов оз. Судочье стало пересыхать, однако затем его водный режим был восстановлен, в основном за счет отвода воды из Амударьи через систему коллекторов. Согласно нашим данным, сейчас минерализация воды в оз. Судочье составляет 1%, что соответствует минерализации Аральского моря до его обмеления. В осадках озера Судочье мы обнаружили большое разнообразие бактерий. Прежде всего, здесь, в отличие от осадков Аральского моря, присутствовали значительно более разнообразные фототрофы, в том числе пурпурные несерные бактерии рода Rubribacterium (9%), ранее найденные в содовых озерах (Болдарева и соавт., 2009). Цианобактерии — главным образом Synechococcus и Cyanidium — также присутствовали в значительном количестве (7%); можно предположить, что доля фототрофных прокариот в толще воды озера была еще выше. Аэробные и анаэробные органотрофы и бактерии цикла серы в оз. Судочье были гораздо разнообразнее, чем в Аральском море, в результате чего явно доминирующие группы практически отсутствовали. Как и в осадках Аральского моря, археи в оз. Судочье были немногочисленны; доминировали те же Woesearchaeales, в то время как на Halobacterota приходилась лишь малая часть архей. Таким образом, в оз. Судочьe сохраняется богатство таксонов, видимо, свойственное Аралу до его обмеления.

Итак, наиболее бедными с точки зрения разнообразия оказались местообитания с высоким содержанием соли: вода Аральского моря и его бывшее дно. Одновременно любое снижение солености — в ризосфере растения или за счет излива подземной воды из скважины — немедленно отражается в увеличении микробного разнообразия, как филогенетического, так, вероятно, и метаболического.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность С. С. Буриеву и А. И. Кулонову за помощь в организации экспедиции и отборе природных образцов, Н. Ю. Бешко за идентификацию растений-галофитов и А. Р. Строевой за помощь в выделении ДНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Основные работы выполнены при поддержке проекта А-ФА-2021–428 “Микробные сообщества современного Арала и зон Приаралья: разнообразие, свойства и биотехнологический потенциал”. Работы по анализу результатов секвенирования были выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Отбор образцов — Н. А. Черных, А. Ю. Меркель, А. И. Слободкин, Ж. Э. Алимов; физико-химическая характеристика — К. В. Кондрашева; выделение метагеномной ДНК — Н. А. Черных, А. Ю. Меркель; баркодирование и пулирование библиотек генов 16S рРНК — А. А. Клюкина; секвенирование библиотек генов 16S рРНК ‒ А. Ю. Меркель; профилирование микробного сообщества на основе результатов секвенирования — А. Ю. Меркель; анализ данных и подготовка статьи — Н. А. Черных, А. Ю. Меркель, А. И. Слободкин, К. Д. Давранов, Е. А. Бонч-Осмоловская; руководство проектом — К. Д. Давранов, Е. А. Бонч-Осмоловская. Все авторы участвовали в обсуждении результатов.

Дополнительные материалы к статье

 

Рис. S1. Гистограмма, отражающая филогенетический состав (уровень семейства или рода) по результатам профилирования по гену 16S рРНК микробных сообществ воды, донных осадков и грунта Западного Аральского моря, а также донного осадка озера Судочье

 

Рис. S2. Гистограмма, отражающая филогенетический состав (уровень рода) по результатам профилирования по гену 16S рРНК микробных сообществ, взятых на берегу Западного Аральского моря, состоящая из влажного песка и из ризосферы терескена – Krascheninnikovia еwersmanniana (RS и AS)

 

Рис. S3. Гистограмма, отражающая филогенетический состав (уровень рода) по результатам профилирования по гену 16S рРНК микробных сообществ, приуроченных к почвам плато Устюрт (US3, US1 и US2)

 

Рис. S4. Гистограмма, отражающая филогенетический состав (уровень рода) по результатам профилирования по гену 16S рРНК микробных сообществ, приуроченных к пресноводным скважинам (WW1-WW3, WM, WD1-WD2)

 

Фото 1. Вид на Западный Арал с плато Устюрт

About the authors

N. A. Chernyh

Winogradsky Institute of Microbiology, FRC Fundamentals of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: chernyh3@yandex.com
Russian Federation, Moscow

A. Yu. Merkel

Winogradsky Institute of Microbiology, FRC Fundamentals of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: chernyh3@yandex.com
Russian Federation, Moscow

K. V. Kondrasheva

Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Uzbekistan

Email: chernyh3@yandex.com
Uzbekistan, Tashkent

Zh. E. Alimov

International Agricultural University

Email: chernyh3@yandex.com
Uzbekistan, Tashkent

A. A. Klyukina

Winogradsky Institute of Microbiology, FRC Fundamentals of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: chernyh3@yandex.com
Russian Federation, Moscow

E. A. Bonch-Osmolovskaya

Winogradsky Institute of Microbiology, FRC Fundamentals of Biotechnology, Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: chernyh3@yandex.com
Russian Federation, Moscow; Moscow

A. I. Slobodkin

Winogradsky Institute of Microbiology, FRC Fundamentals of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: chernyh3@yandex.com
Russian Federation, Moscow

K. D. Davranov

Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Uzbekistan

Email: chernyh3@yandex.com
Uzbekistan, Tashkent

References

Supplementary files