Effect of Hydrocarbon Pollution on the Fungal Communities of the White and Barents Sea Littoral Sediments

Full Text

Загрязнение морских акваторий и литоральных зон нефтепродуктами — одна из распространенных проблем в современном мире (Немировская, 2013). Загрязнение углеводородами (УВ) оказывает сильное воздействие на различных гидробионтов (Андрианов и соавт., 2016), но о его влиянии на морские грибы и их сообщества сведений пока крайне мало. В основном такие исследования связаны с катастрофическими разливами нефти или нефтепродуктов в тропических и субтропических регионах (Sadaba, Sarinas, 2010; Bik et al., 2012; Bovio et al., 2017), и пока только одна подобная работа была сделана в арктических морях (Исакова и соавт., 2023). Данные о связи численности УВ-окисляющих грибов с количеством углеводородов в морской среде противоречивы. С одной стороны, было показано, что в сообществах микобиоты под влиянием загрязнения вследствие разлива большого количества топлива заметно увеличилась доля УВ-окисляющих штаммов (Bovio et al., 2017). С другой стороны, и численность, и доля УВ-окисляющих грибов в микобиоте в целом снижались по мере увеличения количества углеводородов в грунтах и почвах литорали на участках, в разной степени подверженных постоянной антропогенной нагрузке (Исакова и соавт., 2023). Последнее неожиданно, и, с нашей точки зрения, труднообъяснимо. Метагеномные исследования трансформации сообществ про- и эукариот при нефтяном загрязнении показали, что в таких условиях грибы из минорной могут становиться преобладающей группой: их обилие увеличивается в десятки раз, хотя при этом разнообразие снижается (Bik et al., 2012). Но, в то же время, обнаружено, что после такой трансформации микобиота восстанавливается довольно быстро и через три года уже может вернуться к своему исходному состоянию, о чем свидетельствуют увеличение как общего видового разнообразия грибов, так и доли минорных видов (Sadaba, Sarinas, 2010).

Способность (зачастую высокая) к окислению как алифатических (АУВ), так и полициклических ароматических (ПАУ) углеводородов, входящих в состав нефти и нефтепродуктов, была показана для морских изолятов грибов из различных родов (Артемчук, 1981; Simister et al., 2015; Batista-García et al., 2017; Bovio et al., 2017; Barnes et al., 2018; Maamar et al., 2020; Velez et al., 2020). В качестве активных окислителей УВ указываются, например, Aspergillus terreus и Fusarium solani (Simister et al., 2015), A. terreus и Penicillium citreonigrum (Bovio et al., 2017), P. polonicum, P. chrysogenum и P. cyclopium (Maamar et al., 2020). В работе Р. Л. Симистера и соавт. (Simister et al., 2015) было отмечено, что грибы чаще разлагают короткоцепочечные (<C₁₈), нежели длинноцепочечные (С₁₉–С₃₆) АУВ; линейные С₁₇ и С₁₈ АУВ, нежели разветвленные, а среди ПАУ более подверженными разложению были низкомолекулярные соединения. Однако в других работах изученные штаммы отдавали предпочтения более длинноцепочечным (>C₂₄) АУВ (Bovio et al., 2017; Barnes et al., 2018).

В целом, следует отметить, что сведения, как о влиянии УВ загрязнения на сообщества грибов в морских экосистемах, так и об УВ-окисляющей способности выделяемых из этих экосистем штаммов, пока не очень многочисленны и зачастую противоречивы. Кроме того, в арктических морях было проведено пока только одно исследование влияния нефтяного загрязнения на микобиоту литорали Баренцева моря.

Цель работы состояла в изучении и сравнении влияния УВ загрязнения на микобиоту литорали Баренцева и Белого морей, а также УВ-окисляющую активность обитающих здесь грибов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор образцов. Материалами нашего исследования послужили 30 образцов грунта средней литорали, собранных в начале августа 2020 года в 10 точках на Белом (3 в городе Кандалакша и 3 в его окрестностях; 4 в окрестностях ББС — Беломорской биостанции им. Н. А. Перцова в Кандалакшском заливе) и в 5 точках на Баренцевом море (2 в городе Мурманск и 3 — в поселке Териберка и окрестностях), по 2 образца в каждой точке (представлены далее в табл. 1). Образцы отбирали из верхних 2 см грунта, в локациях, в разной степени загрязненных углеводородами: от припортовых зон Мурманска и Кандалакши — до удаленных от крупных населенных пунктов относительно “чистых” участков в районе природного заказника (ББС) и поселка Териберка. Впоследствии для каждой точки определяли гранулометрический состав и соленость грунта, содержание АУВ и ПАУ, а также С_орг — массовую долю органического углерода от общей массы осадка и долю УВ от С_орг — массовую долю углеводородов от общей массы органического углерода. Первые два показателя были определены самостоятельно, остальные — в лаборатории отдела современных и древних осадков и взвеси Мирового океана Института океанологии им. П. П. Ширшова РАН (Москва, Россия).

Определение видового состава грибов. Для определения видового состава грибов в образцах использовали метод комочков на агаризованных питательных средах: сусло-агар (Malt Extract Agar — MEA: на 1 л — 2 г общего содержания сахаров, при расчете разведения исходного ячменно-солодового концентрата, ТУ 9185-020-93454900-12; 20 г соли морской для аквариумов Red Sea Salt, “RS”, Израиль; 15 г агара) и дизель-агар (Diesel Oil Agar — DOA: на 1 л — 10 мл дизельного топлива зимнего, добавляли после стерилизации; 20 г соли морской для аквариумов Red Sea Salt, “RS”, Израиль; 15 г агара). В среды добавляли антибиотик цефатоксим, 0.8 г/л. Для посевов брали по 0.1 г грунта от каждого образца на каждую среду и стерильным шпателем равномерно распределяли его по поверхности среды; инкубировали при 8℃ (MEA), 8 и 25℃ (DOA) в течение 4‒6 недель.

По окончании инкубации выделяли чистые культуры мицелиальных грибов для идентификации. Первичную идентификацию проводили по морфолого-культуральным признакам. Для уточнения таксономического положения ряда изолятов применяли молекулярно-генетические методы. Геномную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора LumiPure from AnySample (“Lumiprobe”, Германия), согласно приложенному протоколу. Для проведения ПЦР использовали праймеры ITS1F и ITS4R (Simister et al., 2015). Секвенирование ПЦР-продукта после очистки с помощью ацетата аммония (0.125 М) и 80% спирта проводили в компании “Синтол” (Москва, Россия). Полученные хроматограммы обрабатывали в программе CodonCode Aligner. Последовательности сравнивали с GenBank (Benson et al., 2017) с помощью алгоритма BLAST (Altschul et al., 1990). Пороговое значение сходства для идентификации на видовом уровне было принято равным 99%. Синонимию и актуальное положение всех идентифицированных таксонов приводили в соответствие с данными в базе MycoID (https://www.mycobank.org/page/). Последовательности ITS1-5.8S-ITS2 67 изолятов депонированы в GenBank, им присвоены номера OR269188-OR269254.

Определение углеводородокисляющей активности выделенных грибов. Для определения углеводородокисляющей (УВО) активности, отобрали 11 чистых культур разных видов из числа тех, которые первично были выделены на среду DOA. Это были изоляты факультативных морских грибов: Acrostalagmus luteoalbus, Penicillium brevicompactum, P. chrysogenum, P. glabrum, Tolypocladium inflatum, T. tundrense из Белого моря и Cadophora fastigiata и C. malorum из Баренцева; а также — изоляты облигатных морских грибов: Acremonium fuci и Paradenryphiella arenariae из Белого и Asteromyces cruciatus из Баренцева морей. Культивирование проводили в трех повторностях в колбах со 100 мл модифицированной среды Чапека (на 100 мл: 1 мл дизельного топлива зимнего, добавляли в колбы после стерилизации; 0.2 г NaNO₃; 0.1 г KH₂PO₄; 0.05 г MgSО₄ ∙ 7H₂O; 0.05 г KCl; 2 г соли морской для аквариумов Red Sea Salt, “RS”, Израиль; 0.1 мл Tween 80). В качестве контроля использовали ту же среду, без инокуляции культурами. Колбы инкубировали на орбитальном шейкере Innova 43R (“New Brunswick Scientific”, США) при температуре 8℃ и 130 об./мин в течение пяти недель. Экстракцию углеводородов нефти гексаном проводили в соответствии со стандартом (ГОСТ Р 52406-2005, ISO 9377-2:2000). Элюат высушивали и взвешивали на аналитических весах вместе с тарой, также взвешивали тару отдельно и высчитывали массу остаточных углеводородов (ОУВ). Процент биотического вклада в убыль углеводородов рассчитывали по формуле: 100 × (M _{ОУВ контроль} — М _{ОУВ образец})/М _{ОУВ контроль}.

Определение видового разнообразия. Для определения видового разнообразия рассчитывали индекс Шеннона (Magurran, 1988). Для первичного исследования связей структуры микобиоты с известными параметрами среды (Jongman et al., 1999) применяли анализ соответствий (Correspondence Analysis — СА). Расчет различий таксономического состава микобиоты географических точек проводили с использованием индекса Брея-Кёртиса (Jongman et al., 1999). На основании полученных матриц различий проводили ординацию методом неметрического многомерного шкалирования (Multidimensional Scaling — nMDS) для выявления общих тенденций в распределении сообществ (Jongman et al., 1999). Для проверки правильности группировки вариантов была проведена проверка неслучайности группировки объектов (Analysis of Similarities — ANOSIM); пороговым уровнем значимости, ниже которого группировка считалась неслучайной, принимали равным 5% (Clarke, Warwick, 2001). Были проверены объединения вариантов в следующие группы: 1) по признаку локации (Кандалакша и окрестности; ББС и окрестности; Мурманск; Териберка и окрестности); 2) по типу грунта (песок без ила; песок слабозаиленный; ил с песком); 3) по уровню солености, psu (около 5; около 15; 20‒25); 4) по содержанию АУВ, мкг/г (10‒30; 50‒75); 5) по содержанию ПАУ, нг/г (0; 0‒500; 800‒5000; более 5000); 6) по содержанию С_орг, % (менее 0.1, 0.1‒0.2, более 0.2); 7) по доле УВ от С_орг, % (около 1; 1.5‒2.5; более 2.8). Оценку вклада отдельных видов во внутригрупповое сходство и выявление индикационных видов проводили с помощью процедуры SIMPER. Для расчетов использовали программу PRIMER v6 (Clarke, Warwick, 2001).

Статистическая обработка результатов. При выделении чистых культур грибов на каждой чашке подсчитывали число колоний каждого морфотипа, в дальнейшем суммировали результаты, полученные по двум образцам в каждой точке, и вычисляли обилие каждого морфотипа в каждой географической точке как отношение числа его колоний к общему числу колоний, выраженное в процентах. Во всех дальнейших расчетах использовали этот показатель.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Численность выделенных грибов. Из навески одного образца массой 0.1 г выделялось 1‒52 колонии на среду MEA и 0‒8 колоний на среду DOA, или суммарно от 4 до 77 колоний на MEA и от 0 до 15 колоний на DOA из каждой географической точки (табл. 1). В пересчете на 1 грамм это дает десятки‒сотни пропагул грибов. В целом, такой порядок численности характерен для грунтов холодноводных морей (Бубнова, Коновалова, 2018; Bubnova et al., 2020; Исакова и соавт., 2023), хотя в некоторых случаях численность может быть на порядок выше (Khusnullina et al., 2018). Ранее отмечалось, что чем ниже заиление, тем ниже содержание пропагул грибов в грунте (Bubnova et al., 2020). В данном случае также из песчаных не заиленных грунтов выделялось наименьшее число колоний грибов на обе среды. Еще одной особенностью исследованных образцов явилось то, что во всех случаях на среду DOA выделялось грибов меньше, чем на среду MEA (табл. 1). Это было ожидаемо, и мы связываем с неспособностью части грибов использовать УВ в качестве единственного источника питания, а также с возможным токсическим действием УВ на часть штаммов (Bovio et al., 2017; Maamar et al., 2020). В то же время в недавнем исследовании микобиоты побережья Баренцева моря, во многих случаях была обнаружена более высокая численность УВ-окисляющих грибов, а также увеличение их доли в сообществе при уменьшении содержания углеводородов в среде (Исакова и соавт., 2023).

 

Таблица 1. Характеристики отобранных образцов

Показатели	Баренцево море					Белое море
	Мурманск		Териберка			Кандалакша						ББС
	BS-01	BS-02	BS-03	BS-04	BS-05	WS-01	WS-02	WS-03	WS-04	WS-05	WS-06	WS-07	WS-08	WS-09	WS-10
Географическое положение
Северная широта (°)	68.99	68.99	69.16	69.17	16.17	67.07	67.03	64.15	67.13	67.12	67.13	66.55	66.55	66.55	66.54
Восточная долгота (°)	33.05	33.05	35.13	35.14	35.17	34.40	32.32	32.40	34.43	32.47	32.41	33.10	33.10	33.07	33.13
Соленость и тип грунта
Соленость (psu)	13.3	13.1	11.9	20	23.7	13.8	13.5	6.1	5.2	12.3	10.9	22.3	23.2	23.2	24.8
Тип грунта	3	3	2	1	1	2	2	2	2	2	2	3	3	2	2
Параметры углеводородного загрязнения
АУВ (мкг/г)	53.87	70.09	50.48	15.89	12.37	16.62	23.80	27.06	16.72	17.74	27.27	11.95	30.60	16.75	15.66
ПАУ (нг/г)	121500	141200	3750	310	480	820	0	150	260	110	4680	360	0	170	0
Сорг (%)	0.130	0.182	0.150	0.075	0.042	0.164	0.334	0.080	0.104	0.034	0.040	0.115	0.265	0.252	0.157
Доля УВ от Сорг (%)	3.56	3.45	2.89	1.82	2.53	0.87	0.61	2.91	1.38	4.49	5.86	0.89	0.99	0.57	0.86
Полученные количественные характеристики микобиоты
Число колоний	41/6	42/10	30/7	9/1	4/2	63/14	77/5	38/9	20/9	18/7	35/5	49/15	46/9	7/6	37/6
Число морфотипов	8/3	9/5	13/5	3/1	3/2	20/5	20/4	14/7	8/6	8/5	13/4	13/6	13/1	4/5	6/2
Индекс Шеннона	1.8/0.9	1.8/1.4	2.1/1.5	0.7/0	1.1/0.7	2.6/1.2	2.6/1.3	2.3/3.1	1.7/1.7	1.8/1.5	2.4/1.3	2.1/1.2	2.3/0	1.3/1.6	1.5/0.7

Примечание. Тип грунта: 1 — песок; 2 — песок слабозаиленный; 3 — ил с песком. Данные о присутствии грибов (число колоний и число морфотипов) и значениях индекса разнообразия Шеннона приводятся отдельно по разным средам (MEA/DOA).

 

Общее разнообразие микобиоты. Всего из всех посевов мы выделили представителей 88 морфотипов мицелиальных грибов, из которых 66 идентифицировали до вида по морфологическим или генетическим критериям, а оставшиеся 22 — до уровня рода, или выше по генетическим критериям (табл. 2). Обнаружены представители только двух отделов: Mucoromycota — 3 морфотипа и Ascomycota — все остальные. Наиболее многочисленными были представители классов Sordariomycetes (всего 235 колоний в 24 образцах), Eurotiomycetes (191 колония в 29 образцах) и Leotiomycetes (142 колоний в 18 образцах); представители класса Dothideomycetes были более редкими (40 колоний в 17 образцах). Наиболее разнообразными были классы Sordariomycetes (46 морфотипов) и Dothideomycetes (18 морфотипов). Высокое обилие эвроциевых обусловлено высокой представленностью рода Penicillium: в общей сложности 190 колоний восьми его видов были обнаружены во всех точках отбора, в 29 образцах. Также очень заметной группой был род Acremonium: 100 колоний десяти его морфотипов также обнаружены во всех точках, но в 21 образце. Из видов чаще других встречались Penicillium chrysogenum (107 колоний в 23 образцах из 14 точек), Pseudogymnoascus pannorum (89 колоний в 10 образцах из 9 точек) и Acremonium fuci (66 колоний в 15 образцах из 12 точек). Остальные морфотипы встречались реже и менее обильно, многие — единично. Подобная структура микобиоты в целом характерна для грунтов холодноводных морей. Класс Eurotiomycetes зачастую бывает наиболее многочисленным и/или разнообразным, именно за счет рода Penicillium (Бубнова, Коновалова, 2018; Khusnullina et al., 2018; Luo et al., 2020; Исакова и соавт., 2023). Большую численность и разнообразие представителей сордариевых и леоциевых, также как и дотидеевых, ранее отмечали для грунтов разных арктических морей (Khusnullina et al., 2018; Bubnova et al., 2020; Luo et el., 2020). И также во многих случаях высокое разнообразие этих групп выявлялось молекулярными методами, причем даже их использование не всегда помогало установить принадлежность исследуемых культур к каким-то видам, а только к категориям более высокого ранга (Rämä et al., 2017; Luo et el., 2020), как и в нашем случае. Большинство обнаруженных нами видов известны не только из морских, но и из наземных экосистем. Облигатно морскими являются только четыре: Acremonium fuci, Asteromyces cruciatus, Paradendryphiella arenariae, P. salina. Из этих четырех A. cruciatus был впервые обнаружен нами в арктических морях, а остальные довольно обычны здесь (Rämä et al., 2017). Кроме A. cruciatus, еще 11 видов ранее не были известны в арктических морях (табл. 2), все они выделялись небольшим числом колоний, чаще — единичными, из отдельных образцов.

 

Таблица 2. Таксономическое разнообразие исследованной микобиоты

MUCOROMYCOTA
Mucoromycetes	Mucor hiemalis Wehmer (3/0), Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. (8/0)
Umbelopsidomycetes	Umbelopsis ramanniana (Möller) W. Gams (3/0)
ASCOMYCOTA
Incertae sedis	Ascomycota i. s.* (1/0), Pezizomycotina i. s.* (1/0)
Dothideomycetes	Capnodiales i. s.* (1/0), Dydimellaceae i. s. 1* (1/2), Dydimellaceae i. s. 2* (1/0), Sympoventuriaceae i. s.* (0/1) Alternaria alternata (Fr.) Keissl. (1/0), A. chlamydospora Mouch.* (0/1), A. phragmospora Emden * (0/1), Alternaria i. s.* (1/0), Aureobasidium pullulans (de Bary & Löwenthal) G. Arnaud (2/0), Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries (2/1), C. sphaerospermum Penz. (5/0), Cladosporium i. s. (1/0)*, Juxtiphoma eupyrena (Sacc.) Valenz.-Lopez, Crous, Stchigel, Guarro & Cano* (1/1), Paradendryphiella arenariae (Nicot) Woudenb. & Crous (11/1), P. salina (G. K. Sutherl.) Woudenb. & Crous (2/0), Paraphoma fimeti (Brunaud) Gruyter, Aveskamp & Verkley* (0/1), Paraphoma i. s.* (1/0), Phoma i. s.* (0/1)
Eurotiomycetes	Penicillium aurantiogriseum Dierckx (22/0), P. brevicompactum Dierckx (16/16), P. chrysogenum Thom (73/34), P. citrinum Thom (6/1), P. glabrum (Wehmer) Westling (8/3), P. lanosum Westling (6/2), P. simplicissimum (Oudem.) Thom (0/2), P. thomii Maire (1/0), Phialophora verrucosa Medlar (0/1)
Leotiomycetes	Helotiales i. s.* (1/0), Asteromyces cruciatus C. Moreau & Moreau ex Hennebert (2/1), Cadophora fastigiata Lagerb. & Melin (21/2), C. malorum (Kidd & Beaumont) W. Gams (9/4), C. luteo-olivacea (J.F.H. Beyma) T. C. Harr. & McNew* (6/3), Pseudeurotium hygrophilum (Sogonov, W. Gams, Summerb. & Schroers) Minnis & D. L. Lindner (2/0), Pseudoeurotium i. s.* (0/1), Pseudogymnoascus pannorum (Link) Minnis & D. L. Lindner (88/1), Thelebolus i. s.* (1/1)
Saccharomycetes	Dipodascus geotrichum (E. E. Butler & L. J. Petersen) Arx (2/1)
Sordariomycetes	Sordariomycetes i. s.* (1/0), Hypocreales i. s.* (1/0), Hypocreomycetidae i. s.* (1/0), Sordariomycetidae i. s.* (1/0) Acaulium acremonium (Delacr.) Sand.-Den., Guarro & Gené (3/0), Acremonium alternatum Link* (0/1), A. byssoides W. Gams & T. M. Lim (1/0), A. fuci Summerb., Zuccaro & W. Gams (61/5), A. masseei (Sacc.) W. Gams* (3/0), A. murorum (Corda) W. Gams (10/3), A. rutilum W. Gams (11/0), A. sclerotigenum (Moreau & R. Moreau ex Valenta) W. Gams* (1/0), Acremonium i. s. 1* (2/0), Acremonium i. s. 2 (0/1), Acremonium i. s. 3 (1/0), Acrostalagmus luteoalbus (Link) Zare, W. Gams & Schroers (21/1), Akanthomyces lecanii (Zimm.) Spatafora, Kepler & B. Shrestha (2/0), Cephalotrichum microsporum (Sacc.) P. M. Kirk (1/0), C. nanum (Ehrenb.) S. Hughes (9/0), C. stemonitis (Pers.) Nees (1/0), Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams (1/0), Cordyceps farinosa (Holmsk.) Kepler, B. Shrestha & Spatafora (1/1), Cylindrocarpon i. s.* (1/0), Dialonectria ullevolea Seifert & Gräfenhan* (1/0), Emericellopsis maritima Beliakova* (0/1), Fusarium oxysporum Schltdl. (3/0), F. acuminatum Ellis & Everh.* (1/1), Fusarium i. s. (1/2), Gibellulopsis nigrescens (Pethybr.) Zare, W. Gams & Summerb. (0/1), Ilyonectria cf. destructans (Zinssm.) Rossman, L. Lombard & Crous (1/0), Lasionectriopsis cf. pteridii (W. Gams & J. C. Frankland) Lechat & P.-A. Moreau (0/1), Lecanicillium psalliotae (Treschew) Zare & W. Gams (0/3), Microdochium lycopodinum (Jaklitsch, Siepe & Voglmayr) Hern.-Restr. & Crous* (1/0), Nectria ramulariae (Wollenw.) E. Müll. (4/1), Neonectria candida (Ehrenb.) Rossman, L. Lombard & Crous* (0/1), N. lugdunensis (Sacc. & Therry) L. Lombard & Crous* (2/0), Papulaspora immersa Hotson (6/0), Plectosphaerella cucumerina (Lindf.) W. Gams* (1/0), Sarocladium kiliense (Grütz) Summerb. (0/1), S. strictum (W. Gams) Summerb. (4/1), Thelonectria olida (Wollenw.) P. Chaverri & Salgado* (0/2), Tolypocladium cylindrosporum W. Gams (7/1), T. inflatum W. Gams (8/8), T. tundrense Bissett (0/1), Trichoderma harzianum Rifai (1/0), Wardomyces ovalis W. Gams (23/0)

Примечание. Звездочкой (*) отмечены таксоны, верифицированные с помощью молекулярных методов; подчеркнуты таксоны, впервые обнаруженные в арктических морях; в скобках за каждым видом — число колоний, суммарно выделенных на разные среды (MEA/DOA).

 

Особенности комплексов грибов, выделявшихся на разные среды. Как уже было отмечено, численность грибов, выделяемых на среду DOA ниже выделяемых на среду MEA. Различия в видовом составе и структуре сообществ также существенны. В общей сложности на DOA выделились представители 44 морфотипов, из которых только 19 были уникальными для этого типа среды; на MEA выделились представители 69 морфотипов грибов, из которых 44 были уникальными; 25 морфотипов выделялись на оба варианта среды (табл. 1 и 2). Заметим, что все виды, уникальные для среды DOA и большинство видов, уникальных для MEA, выделялись единичными колониями, составляя минорный компонент сообщества. Наиболее представленными видами, с суммарным обилием выше 10%, в сообществах, выделявшихся на DOA, были P. chrysogenum и P. brevicompactum; в сообществах, выделявшихся на MEA — Pseudogymnoascus pannorum, Penicillium chrysogenum и Acremonium fuci. Индексы разнообразия Шеннона (табл. 1) для сообществ, выделявшихся на DOA, варьировали от 0 до 3.1 (среднее — 1.2); для MEA — от 0.7 до 2.6 (среднее — 1.9). За исключением одной точки в Белом море, во всех остальных локациях индекс Шеннона был выше для сообществ, выделявшихся на MEA, по сравнению с сообществами, выделяемыми на DOA. В целом мы можем констатировать, что сообщество грибов, выделяемое на среду с дизелем, можно рассматривать как обеднённое и реструктурированное сообщество грибов, выделяемых на среду MEA. Анализ с помощью nMDS и проверка уровня значимости фактора использованной для выделения среды по ANOSIM, показали, что он чрезвычайно высоко значим (0.1%).

Связь структуры микобиоты с параметрами среды. Итак, исходно мы предполагали наличие 7 возможных группировок сообществ грибов в соответствии с влиянием семи различных факторов среды (локация, тип грунта, уровень солёности, содержание АУВ, ПАУ, С_орг и доля УВ от С_орг). Проведенные анализы показали, что для сообществ грибов, выделявшихся на DOA, единственным значимым фактором была доля УВ от С_орг, а для сообществ грибов, выделявшихся на MEA — локация; все остальные предполагаемые группировки были недостоверны (табл. 3).

 

Таблица 3. Уровень значимости объединения по ANOSIM для сообществ грибов, выделенных на разных средах

Фактор среды	Уровень значимости по ANOSIM, %
	DOA*	MEA
Локация	34	2.5**
Тип грунта	12.5	6.6
Соленость, psu	91.5	16
АУВ, мкг/г	33.8	87.3
ПАУ, нг/г	46.5	56.4
Сорг, %	39.2	32.1
Доля УВ от Сорг, %	0.3**	34.9
“Антропоген”	2.3**	0.1**

* DOA — для сообществ, выделенных на среде с дизелем; MEA — для сообществ, выделенных на сусло-агаре.

** Ячейки с уровнем значимости ниже 5%.

 

Интересно, что, кроме доли УВ от С_орг в случае DOA, другие факторы, связанные с нефтяным загрязнением (содержание АУВ и ПАУ), имеют очень слабое влияние на структуру микобиоты. Мы предполагаем, что это может быть обусловлено тем, что имеющиеся в наших образцах концентрации этих веществ не настолько высоки, чтобы оказывать существенное ингибирующее действие на рост грибов, а с другой стороны, — их пищевая доступность для грибов также может не быть связана с их концентрацией в имеющихся пределах. Можно предположить, что они являются фоном, на котором сообщества грибов литорали исследованных локаций существуют постоянно. Возможно, более высокие концентрации, например, при катастрофических разливах смогут заметно повлиять на структуру микобиоты (Sadaba, Sarinas, 2010; Bik et al., 2012) за счет подавления роста одних грибов и селективного стимулирования развития других, способных к утилизации этих соединений.

В ходе проведения первичного анализа соответствия мы предположили существование еще одной группировки, отличной от исходных. Это предположение было основано на формировании на различных вариантах ординационных диаграмм двух групп точек: 1) почти все беломорские точки за пределами города Кандалакша (WS-01 и WS-02 — в окрестностях города и все точки около ББС) и одна точка в Териберке (BS-03); 2) все точки в пределах городов Мурманск (BS-01 и BS-02) и Кандалакша (точки WS-03, WS-04 и WS-06), а также одна точка за пределами Кандалакши (WS-05). При этом две точки, расположенные в Териберке на пляже (BS-04 и BS-05), везде располагаются отдельно, в разных случаях формируя или не формируя общую группу (рис. 1).

 

Рис. 1. Диаграмма многомерного шкалирования (nMDS) для объединенных сообществ грибов по признаку общего антропогенного воздействия (фактор “Антропоген”). WS — образцы с побережья Белого, BS — с побережья Баренцева моря

 

Последнее, видимо, связано с тем, что грунт в этом случае песчаный, с заметно отличающейся от остальных локаций существенно обедненной микобиотой. Мы проверили также и данную группировку с помощью nMDS и ANOSIM, предположив существование групп “антропогенные локации”, “неантропогенные локации”, “Териберка пляж”, а фактор, отвечающий за существование данных групп, мы назвали “Антропоген” (рис. 1, табл. 3). Этот фактор оказался значимым для обеих использованных сред. На наш взгляд, объяснить существование этих двух групп и отделение двух последних локаций можно с точки зрений существования комплекса условий, состоящего из общего антропогенного воздействия крупного населенного пункта (города) и преобладающего влияния типа грунта в последнем случае. Мы не можем количественно оценить данный фактор, но его наличие свидетельствует о том, что на формирование микобиоты в исследованных нами условиях влияет не только уровень УВ загрязнения, но и какие-то неучтенные факторы. Эти факторы, скорее всего, связаны с антропогенным воздействием, загрязнением не только нефтепродуктами, а также, например, тяжелыми металлами, бытовыми и промышленными стоками. Тем не менее уровень нефтяного загрязнения, очевидно, также влияет на формирование сообществ углеводородокисляющих грибов в исследованных условиях. Последнее подтверждается тем фактом, что средние значения индекса разнообразия для сообществ, выделяемых на среде MEA, выше для неантропогенных локаций, а на среде DOA — для антропогенных (табл. 1). Т.е., в исследованных нами антропогенных локациях возрастает разнообразие сообщества УВ-окисляющих грибов, а в неантропогенных локациях — сообществ сахароразрушающих грибов. Интересно, что ранее сообщалось о несколько другом эффекте: увеличении общего разнообразия сообществ сахаролитических и углеводородокисляющих грибов в урбанизированных и антропогенно загрязненных районах Кольского полуострова (Исакова и соавт., 2023).

После проведенных анализов, выявления важности комплексного антропогенного воздействия и обнаружения группировки образцов по этому признаку, мы провели сравнительный анализ структуры микобиоты этих групп. С помощью процедуры SIMPER были выявлены виды грибов, определяющие объединение образцов в эти группы: “антропогенные локации” — A. fuci, P. chrysogenum, P. arenaria, C. fastigiata, P. pannorum, C. malorum и N. ramularia; “неантропогенные локации” — P. chrysogenum, P. aurantiogriseum, T. inflatum, P. pannorum, A. fuci, P. brevicompactum, P. lanosum, A. luteoalbus, W. ovalis и A. rutilum; “Териберка пляж” — P. chrysogenum и P. brevicompactum. Интересно, что в комплекс определяющих видов антропогенных локаций входят морские виды A. fuci и P. arеnaria, а также виды рода Cadophora. В то время как в комплекс определяющих видов для неантропогенных локаций — T. inflatum и P. pannorum и представители рода Penicillium — все обильно спороносящие грибы, обычные в морях, но широко распространенные в самых разных экосистемах. Интересный и пока необъяснимый факт тяготения морских видов к антропогенным локациям. По данным для наземных почв (Марфенина, 2005), можно было ожидать обратной картины, но в данном случае, видимо, мы имеем дело с относительно невысоким уровнем загрязнения, которое оказывает скорее стимулирующее воздействие на микобиоту, чем угнетающее.

Углеводородокисляющая способность выделенных грибов. При культивировании всех 11 изолятов, принимавших участие в данном эксперименте, была отмечена убыль УВ, хотя и выраженная в разной степени. Наиболее заметную убыль остаточных углеводородов показали изоляты Penicillium chrysogenum, Cadophora fastigiata и Tolypocladium inflatum, у которых она составила в среднем 77.4, 72 и 67.2% УВ соответственно (рис. 2).

 

Рис. 2. Убыль остаточных углеводородов при росте исследованных изолятов грибов

 

Согласно стандартам РФ, использованное нами дизельное топливо зимнее, представляет собой депарафинированное (то есть с уменьшенным содержанием алканов длинной C >18) топливо, в котором ароматические углеводороды составляют не более 11% (ГОСТ Р 55475-2013). Исходя из этого, можно предположить, что протестированные нами изоляты обеспечивают убыль в первую очередь короткоцепочечных алифатических УВ. Для представителей рода Penicillium во многих работах ранее была показана высокая УВ-окисляющая активность, в том числе и преимущественно по отношению к короткоцепочечным алканам (Davies, Westlake, 1979; Barnes et al., 2018). В литературе есть сведения и о P. chrysogenum (Elshafie et al., 2007), и P. brevicompactum (Chaineau et al., 1999). В отношении T. inflatum, показавшем высокую активность в нашем эксперименте, ранее было отмечено полное разложение алканов при достаточно низком общем разложении сырой нефти (Davies, Westlake, 1979). Что касается представителей рода Cadophora, сведений об их УВ-окисляющей способности нет, так же как и для морских грибов в нашем эксперименте — Acremonium fuci, Paradenryphiella arenariae и Asteromyces cruciatus. В целом, можно отметить, что более высокую убыль углеводородов показали изоляты видов, более обильно представленные в посевах на DOA, чем на MEA.

Итак, мы предприняли попытку исследования влияния углеводородного загрязнения на состав и структуру сообществ углеводородокисляющих и сахароразлагающих грибов литорали Белого и Баренцева морей. Для обеспечения последующего сравнительного анализа мы отбирали образцы в предполагаемо загрязненных локациях (портовые зоны крупных городов на Белом — Кандалакша, и Баренцевом — Мурманск, морях), и в предполагаемо чистых локациях (природный заказник ББС на Белом и окрестности поселка Териберка — на Баренцевом море). Но проведенные анализы содержания УВ показали, что абсолютно чистых локаций среди исследованных нами нет: во всех грунтах в той или иной степени содержатся углеводороды выше фоновых значений. Разница между предполагаемо чистыми и загрязненными локациями заключается только в их концентрации и составляет в большинстве случаев всего 2‒4 раза. Таким образом, в исследованных районах Белого и Баренцева морей микобиота находится под влиянием относительно невысокого, но постоянного загрязнения нефтепродуктами. Более высокое содержание УВ в грунтах более загрязненных локаций, видимо, не служит заметным стрессом для грибов и не стимулирует массовое развитие УВ-разрушающей микобиоты в грунтах литорали, о чем также свидетельствует пересекающийся видовой состав грибов, при выделении на среды с дизелем и без него. Из всех рассмотренных нами параметров углеводородного загрязнения единственным значимым оказалась доля УВ в общем органическом углероде. Из других факторов наиболее значимым был территориальный. Но на микобиоту исследованных грунтов влияют и изначально неучтенные нами параметры, которые удалось выявить статистическими методами, но не удалось идентифицировать. Исходя из полученных нами результатов, стало очевидно, что для определения пределов стрессового воздействия нефтяного загрязнения на микобиоту исследование стабильных природных и антропогенных экосистем Белого и Баренцева моря не подходит. Эти пределы можно будет определить или при катастрофических событиях (например, при авариях и разливах, как было в Онежском заливе Белого моря в 2003 году и в Мексиканском заливе 2010 году, а также при крупной утечке, которая случилась в порте Витино в Кандалакшском заливе в 2010 году), или же в экспериментальных условиях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают признательность сотрудникам аналитической лаборатории отдела современных и древних осадков и взвеси Мирового океана Института океанологии им. П. П. Ширшова РАН и руководителю лаборатории д. г.- м. н. И. А. Немировской за проведение анализов содержания углеводородов в образцах и обсуждение их результатов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 20-04-00882а).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. Yu. Fadeev

Moscow State University

Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow

L. A. Gavirova

Moscow State University

Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow

M. L. Georgieva

Moscow State University; Gause Institute for New Antibiotics

Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

V. V. Kozlovsky

Marine Research Center, Moscow State University

Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow

U. V. Simakova

Shirshov Institute of Oceanology, Russian Academy of Sciences

Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow

A. I. Shestakov

Moscow State University

Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow

E. N. Bubnova

Moscow State University

Author for correspondence.
Email: katya.bubnova@wsbs-msu.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files