Single-Stage Bioconversion of Phytosterol into Testosterone by Recombinant Strains of Mycolicibacterium neoaurum

D. N. Tekucheva; Текучева Д. Н.; M. V. Karpov; Карпов М. В.; V. V. Fokina; Фокина В. В.; T. I. Timakova; Тимакова Т. И.; A. A. Shutov; Шутов А. А.; M. V. Donova; Донова М. В.

doi:10.31857/S0026365624020033

Single-Stage Bioconversion of Phytosterol into Testosterone by Recombinant Strains of Mycolicibacterium neoaurum

Authors: Tekucheva D.N.¹, Karpov M.V.¹, Fokina V.V.¹, Timakova T.I.¹, Shutov A.A.¹, Donova M.V.¹
Affiliations:
1. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 93, No 2 (2024)
Pages: 115-121
Section: SHORT COMMUNICATIONS
URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/262482
DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624020033
ID: 262482

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

A plasmid containing the genes of a fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, which catalyzes the reduction of the steroid core at the C17 position, and mycobacterial glucose-6-phosphate dehydrogenase, which promotes the recycling of the essential coenzyme NAD(P)H, was constructed. Its constitutive expression in well-studied Mycolicibacterium neoaurum strains made it possible to increase significantly the yield of C-17 hydroxysteroids. In particular, recombinant strains created on the basis of M. neoaurum VKM Ac-1815D and M. neoaurum NRRL B-3805 ΔkstD exhibited predominant accumulation of testosterone, while the strain based on M. neoaurum VKM Ac-1816D accumulated dehydrotestosterone and testosterone simultaneously.

Keywords

transformation of steroids, testosterone, phytosterol, Mycolicibacterium, heterologous expression, whole-cell catalysis

Full Text

Потребности мирового фармацевтического рынка в стероидных препаратах уступают первенство только антибиотикам (Fernandez-Cabezon et al., 2017). Тестостерон (Т, андрост-4-ен-17β-ол-3-он) и его производные применяются при эндокринных нарушениях и заболеваниях обмена веществ, таких как ожирение, недостаточность обмена белков, липидов, микро- и макроэлементов, возрастные изменения и другие.

Использование фитостеринов в биотехнологическом производстве стероидных синтонов и конечных субстанций обеспечивает снижение их себестоимости (Donova, 2017). Биотрансформацией фитостеринов получают ценные ключевые C₁₉-cинтоны: андростендион (АД), андростадиендинон (АДД), 9α-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион (9α-OH-АД). Далее из АД и АДД возможно получать путем химического синтеза практически все фармацевтически ценные стероидные соединения, например, половые гормоны, включая тестостерон, а также гидрокортизон, минералокортикоиды и другие (Garcia et al., 2012; Donova, 2023).

Быстрорастущие непатогенные актинобактерии рода Mycolicibacterium (M. smegmatis, M. fortuitum и M. neoaurum) способны окислять боковую цепь стеринов и трансформировать стероидное ядро. Наличие в клеточной стенке миколовых кислот (Daffe et al., 1993) является крайне важным для обеспечения активного транспорта и биодоступности стеринов для ферментных систем клеток миколицибактерий. Для повышения выхода АД и АДД при биоконверсии фитостерина активно применяются мутантные и рекомбинантные штаммы рода Mycolicibacterium (Shao et al., 2019; Zhou et al., 2020).

3-кетостероид-Δ¹-дегидрогеназы (КстД) представляют собой флавоферменты, которые катализируют депротонирование C1(α) и C2(β) в стероидном кольце А, и являются ключевыми в превращении АД в АДД (van der Geize et al., 2000). Искусственным генетическим нокаутом ключевого гена kstD был создан штамм M. neoaurum NRRL B-3805 ΔkstD (Loraine, Smith, 2017). Делеция в гене kstD должна приводить к преимущественному накоплению АД в ходе каскадной реакции окисления алифатической цепи фито- и холестерина. Однонуклеотидная замена в гене kstD (Bragin et al., 2013) определяет преимущественное накопление АД штаммом Ас-1815D и, напротив, АДД штаммом Ас-1816D (Egorova et al., 2009; Tekucheva et al., 2022).

Биотехнологический способ получения Т в одну стадию в одном биореакторе является экологически и экономически более привлекательным по сравнению с многостадийными технологиями, включающими химический синтез. Создание среды культивирования, способствующей активному росту штамма M. neoaurum и дисперсному распределению слабо растворимого фитостерина, а также подбор оптимальных условий аэрации и режима внесения глюкозы, позволили существенно повысить выход Т (Tekucheva et al., 2022). Интенсивная аэрация способствует росту культуры и окислению боковой цепи фитостерина (Szentirmai, 1990), напротив, слабая аэрация способствует НАДН-зависимому процессу восстановления АД до Т (Tekucheva et al., 2022).

Основными стратегиями метаболической инженерии для повышения продуктивности и селективности трансформации стеринов штаммами Mycolicibacterium являются: 1) блокировка метаболических путей деградации стероидного ядра и синтеза побочных продуктов (Пошехонцева и соавт., 2023); 2) введение новых или более эффективных ферментов целевых реакций (данная работа); 3) улучшение транспорта стероидов в клетку (He et al., 2018; Xiong et al., 2020); 4) оптимизация путей, не связанных с модификацией стероидов, но влияющих на регенерацию их коферментов (Su et al., 2018; данная работа), синтез АТФ (Zhou et al., 2020), уровень активных форм кислорода (Shao et al., 2019).

Известно 14 подтипов 17β-ГСД суперсемейства короткоцепочечных дегидрогеназ-редуктаз (SDR), катализирующих обратимое окисление/восстановление заместителя в положении C-17 различных стероидов (Marchais-Oberwinkler et al., 2011). В геномах близкородственных штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-1815D и Ас-1816D выявлен ген hsd4A (Bragin et al., 2013), являющийся ортологом гена из штамма M. neoaurum ATCC25795, кодирующего 17β-гидроксистероиддегидрогеназу (17β-ГСД). Миколицибактериальная 17β-ГСД окисляет Т до АД и дТ до АДД (Xu et al., 2016). 17β-оксостероид-редуктазная активность штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-1815D и Ас-1816D является НАД(Н)-зависимой (Tekucheva et al., 2022).

Количественная оценка активности соответствующих ферментов позволила заключить, что гетерологичная коэспрессия генов, кодирующих грибную 17β-ГСД из штамма Cochliobolus lunatus и бактериальную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФД) из штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv в клетках миколицибактерий является лучшей стратегией для получения штамма с повышенной 17-оксостероид-редуктазной-активностью (Karpov et al., 2019).

Целью настоящей работы являлось создание рекомбинантных штаммов M. neaourum, трансформирующих фитостерин в высоких (5‒20 г/л) концентрациях в тестостерон, на основе гетерологической экспрессии генов, кодирующих эукариотическую 17β-ГСД C. lunatus и бактериальную Г6ФД M. tuberculosis H37Rv, под конститутивным промотором Phsp60 в составе бицистронной конструкции.

Реактивы. В работе использованы реактивы: фитостерин с общим содержанием стеринов 95.47% (“Jiangsu Spring Fruit Biological Products Co.”, Китай); дрожжевой экстракт (“Difco”, США); кукурузный экстракт (“Sigma”, Франция); соевый пептон (“Hi Media”, Индия); метилированный β-цикодекстрин W7 M1.8 (“Wacker Chemie”, Германия); Tween-80 (“Panreac”, Испания), полножирная соевая мука (ООО “Протеин-плюс”, Россия); агароза (“Invitrogen”, Великобритания); ДНК-модифицирующие ферменты и наборы для экстракции ДНК (“Thermo Fisher”, США); реагенты и колонки для препаративного выделения и очистки плазмидной ДНК (“QIAGEN”, США) и другие реактивы квалификации х. ч. или ч. д. а.

Микроорганизмы, штаммы и условия культивирования. Штаммы M. neoaurum ВКМ Ас-1815D и Ас-1816D получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ВКМ), M. neoaurum NRRL B-3805 ΔkstD (B-3805 D) ‒ от доктора М. Смит (Университет Йорка, Великобритания) (Loraine, Smith, 2017). Escherichia coli DH5α (“Thermo Fisher Scientific”, США) использовали для клонирования плазмидных конструкций. Для селекции в среды вносили 20 и 50 мкг/мл канамицина для трансформированных плазмидами штаммов E. coli и M. neoaurum, соответственно.

Создание рекомбинантных штаммов. Химически синтезированная ДНК-последовательность генов, кодирующих грибную 17β-ГСД из C. lunatus и бактериальную Г6ФД второго типа из M. tuberculosis H37Rv (Strizhov et al., 2016), была клонирована в составе одного оперона по сайтам рестрикции NdeI и HindIII в экспрессионном векторе pMV261N (Fufaeva et al., 2023) под контролем конститутивного промотора Phsp60 из Mycobacterium bovis. Полученная рекомбинантная плазмида pMVN25 и вектор pMV261N были перенесены электропорацией в клетки миколицибактерий, как описано в работе Loraine, Smith (2017), с использованием прибора MicroPulser (“Bio-Rad”, США).

Культивирование штаммов, проведение и анализ продуктов трансформации фитостерина. Выращивание инокулята, проведение трансформации фитостерина целыми клетками (с ежедневным добавлением 5 г/л глюкозы), приготовление среды для процесса (вариант B с заменой пальмитат-стеарата натрия на Tween-80), а также методы анализа стероидов приведены в работе Tekucheva et al. (2022).

Математическая обработка данных. Молярный выход продуктов трансформации (% (мол.) оценивали как процентное отношение молярных концентраций продукта к субстрату. Эксперименты повторялись 2‒4 раза. Стандартное отклонение составляло не более 4‒9% и не приведено на рисунке 1, в таблице 1 и приложении для более ясного представления данных.

Рис. 1. Трансформация 5 г/л фитостерина родительскими штаммами M. neoaurum ВКМ Ас-1816D (1б), ВКМ Ас-1815D (2б), NRRL B-3805 ΔkstD (3б) и рекомбинантными штаммами, несущими бицистронную генетическую конструкцию под регуляцией конститутивного промотора, созданными на их основе (1а, 2а, 3а, соответственно). Вертикальной пунктирной чертой обозначен момент перехода из окислительного в восстановительный режим. 1 — Т; 2 — АД; 3 — АДД; 4 — дТ.

Таблица 1. Выход С-17 гидроксистероидов в процессе трансформации 5 и 20 г/л фитостерина родительскими и рекомбинантными штаммами миколицибактерий (н/о — не обнаружено (ниже порога чувствительности метода); н/п — неприменимо)

№ п/п	Штамм	Нагрузка фито-стерина, г/л	Выход Т, % (мол.)	Выход дТ, % (мол.)	Суммарный выход С-17 гидроксистероидов, % (мол.)	Титр Т, г/л
1	Ас-1816D	5	31.9	7.2	39.1	1.1
2	1816 N25	5	34.8	33.1	67.9	1.2
3	Ас-1816D	20	10.9	3.7	14.6	1.5
4	1816 N25	20	26.8	9.2	36.0	3.7
5	Ас-1815D	5	22.8	н/о	н/п	0.8
6	1815 N25	5	47.4	н/о	н/п	1.6
7	Ас-1815D	20	13.8	н/о	н/п	0.5
8	1815 N25	20	32.2	н/о	н/п	4.4
9	B-3805D	5	20.7	н/о	н/п	0.7
10	B-3805D N25	5	49.5	н/о	н/п	1.7
11	B-3805D	20	9.5	н/о	н/п	1.4
12	B-3805D N25	20	27.1	н/о	н/п	4.1

В качестве платформ для создания рекомбинантных продуцентов были использованы штаммы M. neoaurum ВКМ Ас-1816D, ВКМ Ас-1815D, NRRL B-3805 ΔkstD. Сконструированная плазмида pMVN25 (доп. материалы, рис. S1) позволила осуществить в клетках миколицибактерий совместную конститутивную экспрессию синтетических генов, кодирующих 17β-ГСД и Г6ФД. Созданные рекомбинанты M. neoaurum ВКМ Ас-1816D (pMV261N) (сокращенно 1816 N25), ВКМ Ас-1815D (pMV261N) (1815 N25), NRRL B-3805 ΔkstD (pMV261N) (B-3805D N25) не отличались от родительских штаммов по культурально-морфологическим свойствам при росте на плотной среде, а также по скорости роста в жидкой среде (доп. материалы, рис. S2).

Трансформация фитостерина длилась 120 ч и проходила в два этапа: 1) в окислительном этапе (интенсивная аэрация, 0‒72 ч) происходило преимущественное накопление С-17-оксостероидов (АД и/или АДД), 2) в восстановительном этапе (сниженная аэрация, 72‒120 ч) накапливались С-17-гидроксистероиды (Т и/или дТ).

Доминантным продуктом на окислительном этапе для штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-1816D и 1816 N25 был АДД, его концентрация достигала 65.2 и 58.4% (мол.), соответственно. Более низкое накопление АДД при использовании рекомбинанта 1816 N25 связано с восстановлением АДД до дТ (рис. 1а); в отличие от родительского штамма, 17-ГСД активность в штамме 1816 N25 проявлялась в окислительном режиме при активной аэрации (рис. 1а, 1б).

В восстановительном этапе наблюдалось активное накопление Т как у родительского (Ас-1816D), так и у рекомбинантного (1816 N25) штаммов. Однако у рекомбинанта 1816 N25 образующиеся Т и дТ являются доминантных продуктами, формирование которых возможно по двум путям: 1) АДД → дТ → Т; 2) АДД → АД → Т. Изучение последовательности ферментативных реакций, осуществляемых 17β-ГСД и КстД, приводящих к превалированию пути (1) или (2) в рекомбинантном штамме 1816 N25, является предметом дальнейших исследований. У родительского штамма Ас-1816D биоконверсия идет по пути (2), о чем свидетельствует параллельное накопление АД и Т при снижении содержания АДД в среде. У некоторых штаммов миколицибактерий двойное восстановление АДД (АДД → АД → Т) было более эффективным для синтеза Т, чем одиночное восстановление 17-оксогруппы АД (АД → Т) (Hung et al., 1994; Egorova et al., 2009).

Для штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-1815D и NRRL B-3805 ΔkstD основным промежуточным продуктом окисления фитостерина являлся АД (рис. 1б, 2б). Как и для штамма Ас-1816D, у родительских штаммов Ас-1815D и B-3805 ΔkstD выход основного интермедиата в конце окислительного этапа оказался повышенным по сравнению с рекомбинантами. Также в окислительной фазе наблюдали существенное накопление Т — продукта восстановления АД, что свидетельствует о повышенной 17-оксостероид-редуктазной активности у рекомбинантных штаммов (рис. 2а, 3а). Достигнутый с помощью рекомбинантных штаммов 1815 N25 и B-3805D N25 выход и титр Т составил 47.7 и 49.5% (мол.) и 1.6‒1.7 г/л, соответственно, (табл. 1).

Фитостерин (5 г/л) утилизировался практически полностью (94.5‒99.3%) к началу восстановительной стадии биоконверсии. При увеличении начальной концентрации фитостерина до 20 г/л эффективность его трансформации в Т понизилась у всех изучаемых штаммов. Это связано со снижением эффективности утилизации до 75‒82%, и, как следствие, с меньшим накоплением АД/АДД на конец окислительного этапа. Полученные при биоконверсии 20 г/л фитостерина титры Т, составившие 3.7, 4.1 и 4.4 г/л (табл. 1, пп. 4, 8, 12), тем не менее значительно превышают значения, полученные при биоконверсии 5 г/л фитостерина.

Выбор в качестве организма-хозяина штаммов вида M. neoaurum обусловлен, с одной стороны, изученностью их путей и ферментов стероидного катаболизма (Donova, 2023), с другой стороны, показанной ранее возможностью одностадийного получения Т из фитостерина (Tekucheva et al., 2022).

Для смещения реакции в сторону 17-оксостероид-редуктазной активности, осуществляемой эукариотической НАД(Ф)Н-зависимой 17β-ГСД, с образованием дТ и Т из АДД и АД, соответственно, необходимо достаточное количество восстановленных коферментов НАД(Ф)Н (Tekucheva et al., 2022). Поэтому целевыми генами бицистронной конструкции были: ген грибной 17b-ГСД из C. lunatus и ген бактериальной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) из M. tuberculosis H37Rv (Karpov et al., 2019).

Самый высокий выход С-17 гидроксистероидов: Т и дТ был показан для всех полученных рекомбинантных штаммов по сравнению с родительскими. Судя по выходу Т, у рекомбинантов 17-оксостероид-редуктазная активность увеличилась в 2‒3 раза по сравнению с родительскими штаммами. Для штамма 1816 N25 был получен практически равный выход Т и дТ при биоконверсии 5 г/л фитостерина; однако при учете суммарной 17-оксостероид-редуктазной активности в отношении АД и АДД преимущество рекомбинанта над родительским штаммом становится очевидным (табл. 1, пп. 1, 2).

К настоящему времени молярный выход получаемого биотехнологическими способами Т не превышает 52% даже при низких нагрузках фитостерина ‒ до 5 г/л (Borrego et al. 2000; Kumar et al. 2001; Lo et al., 2002; Egorova et al. 2009; Fernandez-Cabezon et al. 2017). Таким образом, полученные результаты значительно превосходят известные данные и свидетельствуют о перспективности выбранного подхода.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование выполнено по гос. заданию Министерства науки и высшего образования РФ (тема № 122040500054-3).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Рис. S1. Структура рекомбинантной плазмиды pMVN 2٥. Синтетические гены, кодирующие ١٧β-ГСД из Cochliobolus lunatus (17beta-HSDCl) и бактериальную Г6ФДГ 2 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (G6PDMt2), были клонированы в векторе pMV261N под контролем конститутивного промотора Phsp60. Плазмида содержит кассету устойчивости к канамицину (KanR) и точки начала репликации в клетках E.coli (oriE) и микобактериях (oriM).

Рис. S 2. Динамика роста родительских штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-١٨١٥D (١), Ас-١٨١٦D ( 2), NRRL B-٣٨٠٥ ΔkstD (3) и рекомбинантных штаммов, созданных на их основе путем трансформации плазмидой pMVN25 (N25)