Biotechnological Potential of the Soil Microbiome

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Molecular biological techniques and bioinformatic analysis were used to investigate the phylogenetic and functional diversity of the prokaryotic complex of soil microcosms. The dominant organisms of the hydrolytic community were different in the samples from different climatic zones. In the soils subject to anthropogenic or abiogenic load, apart from decreased diversity and abundance of prokaryotes, the number of the genes marking the ability to degrade xenobiotics, as well as those encoding nitrogen conversion and metabolism of vitamins and cofactors, was found to increase. Under heavy oil contamination, the bacterial community was capable of nitrification; its role increased in the lower horizons of the soil profile. The patterns revealed in the work indicate high metabolic potential of the prokaryotic component of the studied soils.

Full Text

Почва представляет собой главный природный банк культур микроорганизмов с полезными для человека свойствами. Выяснение свойств почв, способствующих формированию и сохранению биоразнообразия, получение консорциумов микроорганизмов, обладающих биотехнологическим потенциалом (способность к азотфиксации, гидролизу природных полимеров и ксенобиотиков, синтезу вторичных метаболитов) — важнейшая научная задача современной микробиологии. На основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований (Sutton et al., 2013; Samarghandi et al., 2018; Manucharova et al., 2021) нами была высказана гипотеза, что в почвах, подверженных антропогенным или абиогенным нагрузкам, происходит увеличение количества генов, маркирующих устойчивость сообщества к стрессам, например, способность к биодеградации ксенобиотиков, а также ключевых генов метаболизма, например, превращения азота.

Целью исследований являлось выявление специфики устойчивости и развития гидролитических (хитинолитических, углеводородокисляющих) микробных комплексов, обладающих биотехнологическим потенциалом (гидролиз природных полимеров и ксенобиотиков, способность к азотфиксации, синтез вторичных метаболитов) в почвенных экосистемах, установление закономерностей их распространения и зависимости функциональной активности от основных экологических факторов.

Для проверки гипотезы нами были проведены исследования филогенетического и функционального разнообразия микробных сообществ широкого набора почвенных объектов с различной степенью нарушенности. В качестве основного стрессового фактора было выбрано воздействие углеводородов нефти, полиароматических углеводородов (ПАУ) и биополимера хитина в условиях in situ и лабораторных экспериментов. Для наиболее полной оценки функций почвенного микробиома в работе использовали комплекс методов анализа генетической информации микробиома, ПЦР-определения генов-биомаркеров, оценки физиологически активной части микробиома и измерения функциональной активности.

Объектами исследования являлись прокариотные сообщества современных почв: дерново-подзолистой (Московская область, почва на территории завода, загрязненная ПАУ, 55.728016 с. ш., 38.217825 в. д.), торфяной олиготрофной (Сибирь, Ханты-Мансийский район (почва под нефтяной скважиной) 61.3124ʹ71ʺ с. ш., 70.2676ʹ10ʺ в. д.), чернозема (Волгоградская область (модельный эксперимент, загрязнение нефтью в течение 7 лет) 511ʹ41ʺ с. ш., 4043ʹ31ʺ в. д.), серой лесной (Тульская область, модельный эксперимент, 5358ʹ23ʺ с. ш., 3710ʹ34ʺ в. д.), каштановой (Волгоградская область 49.39936 с. ш., 46.81083 в. д.), бурой пустынно-степной (пустыня Гоби 4345ʹ00ʺ с. ш., 11150ʹ00ʺ в. д.) и реликтовых местообитаний: подкурганные каштановые почвы (Волгоградская область, юг Приволжской возвышенности Камышинского района), погребенные вулканические слоисто-пепловые почвы Камчатки (Северная часть Центральной Камчатки, почвенно-пирокластический чехол северо-западного подножия вулкана Шивелуч 5649ʹ42ʺ с. ш., 16119ʹ28ʺ в. д.), многолетнемерзлых грунтов Антарктиды (о. Кинг-Джордж, станция Беллинсгаузен 6210ʹ04ʺ с. ш., 5912ʹ11ʺ в. д.).

Исследовали воздействие антропогенного фактора на прокариотные сообщества почв как в природных экосистемах (например, на месте разлива нефти (чернозем, торфяная олиготрофная, дерново-подзолистая) или поступления и накопления ПАУ (дерново-подзолистая), так и в модельных опытах с искусственным добавлением углеводородов или биополимеров (чернозем, серая лесная, дерново-подзолистая, каштановая, бурая пустынно-степная, подкурганные каштановые почвы, погребенные вулканические слоисто-пепловые почвы Камчатки, грунты Антарктиды). При проведении модельных экспериментов применяли метод инициации микробной сукцессии увлажнением почвенных образцов водой (до 60% от массы почвы) и добавлением в опытные образцы ресурсов: биополимеров (хитина или пектина) в количестве 0.6% от массы почвы или углеводородов в количестве, превышающем показатели сильнозагрязненных почв (20% от массы почвы). Методика была описана нами ранее (Манучарова и соавт., 2021).

Выделение ДНК проводили с помощью PowerSoil DNA IsolationKit компании “MOBio” (Германия) в соответствии с рекомендациями производителя в трехкратной повторности.

Оценивали количество копий генов, кодирующих синтез ферментов, направленных на деструкцию углеводородов: алкан-монооксигеназы (alkB и alkM)(субстрат: н-алканы) (Wang et al., 2007), катехол-2,3-диоксигеназа (xylE) (субстрат: катехолы и протокатехоевые кислоты), 1,2-гидроксинафталиндиоксигеназа (nahC) (субстрат: нафталин) (Hendrickx et al., 2006). Параллельно проводили оценку функциональной деятельности прокариотного сообщества посредством выявления наличия в системе генов, участвующих в процессах азотного цикла: nifH — нитрогеназная активность (Burgmann et al., 2003), amoA (AOB) — монооксигеназная активность аммоний окисляющих бактерий (Hallin et al., 2009; Gogmachadze et al., 2023), amoA (AOA) — монооксигеназная активность аммоний окисляющих архей, nirK — нитратредуктазная активность (Henry et al., 2004), а также chitA — хитинолитическая активность (Wang et al., 2017). Определения проводили на детектирующем амплификаторе DТLite4 (“ДНК-Технология”, Россия) с измерением интенсивности флуоресценции реакционной смеси на каждом цикле в соответствии с рекомендациями производителя. Общую численность прокариот в почвах определяли с помощью красителя акридина оранжевого; численность метаболически активных клеток прокариот и клеток, содержащих функциональный ген алкан-монооксигеназы, оценивали методом in situ-гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH). Подсчет проводили с использованием люминесцентного микроскопа ZEISS Microscope Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтром Filterset 09 (λ 450‒490 нм) и Filter set 15 (λ 546 нм) для Cy3-меченых зондов (Манучарова и соавт., 2021). Очищенный препарат ДНК использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР с использованием пары универсальных праймеров к вариабельному участку V4 гена 16S рРНК. Подготовку проб и секвенирование выполняли на секвенаторе Illumina Miseq (“Евроген”). Полученные данные обрабатывались в программе SYLVA и ezbiocloud. Функциональное разнообразие генов в микробных сообществах было предсказано при помощи программы PICRUSt (Langille et al., 2013). Для сопоставления 16sрРНК с уже секвенированными полными геномами была использована база бактериальных и архейных геномов IMG database (Markowitz et al., 2012).

Авторами было установлено снижение биомассы и альфа-разнообразия, а так же смена метаболически активных доминантов — представителей доменов Bacteria и Archaea за счет выхода в доминанты определенных родов — автохтонной микрофлоры, специфичной для определенных условий в микрокосмах, загрязненных нефтью по сравнению с контрольными образцами в процессе микробной сукцессии (Manucharova et al., 2021). Для образцов нефтезагрязненных почв южных широт доминирующая роль принадлежала представителям актинобактерий, для почв центральной и северной широт — протеобактериям. Для образцов чернозема падение разнообразия бактерий в результате загрязнения углеводородами составляет 44% (индекс Шеннона снижается с 7.09 до 4.84).

Анализ бета-разнообразия методом главных компонент с применением метрики Брея‒Кертиса на уровне сходства 97% достоверно разделил доминанты гидролитического сообщества между исследуемыми образцами на четыре кластера: современные почвы южных широт (каштановая, чернозем), современные почвы северной и центральной части России (дерново-подзолистая, торфяная), погребенные почвы и многолетнемерзлые грунты (рис. 1).

 

Рис. 1. Анализ методом главных компонент с применением метрики Брея–Кертиса структуры прокариотных сообществ исследуемых образцов с добавлением субстратов (биополимера хитина или углеводородов).

 

Такое разделение указывало на то, что при внесении ресурса доминанты гидролитического сообщества различались между образцами разных климатических зон. На фоне сокращения биоразнообразия в загрязненных образцах по сравнению с контролем определено увеличение содержания функциональных генов (в 2‒4 раза), отвечающих за синтез катехол-диоксигеназы (xylE), алкан-монооксигеназы (alkB) и 1,2-гидроксинафталиндиоксигеназа (nahC), маркирующих начальный этап деградации углеводородов. При анализе функционального генетического разнообразия сообщества методом восстановления полного метагенома по данным высокопроизводительного секвенирования гена 16 s рРНК было выявлено, что количество генов, маркирующих способность сообщества к биодеградации ксенобиотиков, выше в многолетнемерзлых грунтах по сравнению с современными почвами. Внесение субстрата увеличивает долю генов, ответственных за деградацию ксенобиотиков (рис. 2).

 

Рис. 2. Биодеградация ксенобиотиков: A — аминобензоат; B — бензоат; C — капролактамы; D — хлороалканы/хлороалкены; E — хлороциклогексан/хлоробензен; F — нафталин; G — ПАУ. Исследуемые образцы: 1 ‒ чернозем; 2 ‒ чернозем, инкубируемый с ресурсом; 3 — каштановая почва с ресурсом; 4 — каштановая почва; 5 — дерново-подзолистая почва, инкубируемая с ресурсом; 6 ‒ дерново-подзолистая почва; 7 ‒ многолетнемерзлый грунт; 8 ‒ многолетнемерзлый грунт, инкубированный с ресурсом.

 

На длительных сроках загрязнения наблюдается последействие поллютанта и дальнейшее увеличение численности функциональных генов в сравнении со свежим разливом. По прошествии 7 лет после нефтеразлива бактериальное разнообразие продолжает сокращаться. Выявлены устойчивые и чувствительные к нефтезагрязнению представители. К устойчивым среди представителей филлума Actinomycetota относятся рода Gaiella и Streptomyces.

Показано наличие ряда ключевых генов цикла азота (nifH, amoA, nirK, chitA) как в современных, так и погребенных горизонтах исследуемых почв. Наличие копий гена nifH бактерий азотфиксаторов, способных обеспечить систему азотом, можно рассматривать как один из этапов самовосстановления почв. В современных почвах наличие генов, отвечающих за возможность фиксации молекулярного азота из воздуха, было выше по сравнению с погребенными и достигало 4.54 × 106 копий гена/г.п., для погребенного горизонта 2.5 × 104 копий гена/г.п. Важно отметить присутствие, хотя и незначительное, гена nifH в более глубоких слоях почвы, что указывает на возможный потенциал обитающих там микробных сообществ. Для вулканических почв (как современных, так и погребенных) удалось выявить наличие генов аммоний окисляющих бактерий и архей. Динамика присутствия гена amoA в современном горизонте вулканической перегнойно-охристой почвы демонстрирует увеличение его концентрации в бактериальном комплексе в вариантах с нефтью (2.3 × 107 копий ДНК/г.п.) к 10 сут сукцессии. Бактериальный комплекс способен к нитрификации при высоком загрязнении почвы нефтью, а также его роль возрастает в нижних слоях почвенного профиля.

Таким образом, влияние антропогенной нагрузки изменяет “метаболический профиль” почвенных сообществ, что выражается как в увеличении количества микроорганизмов, обладающих биотехнологически ценными свойствами (количество функциональных генов), так и в изменении состава этих микроорганизмов, что и открывает возможность для поиска новых биотехнологически ценных штаммов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Состав микробного сообщества почв был определен при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 24-14-00108).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

About the authors

N. A. Manucharova

Moscow State University

Author for correspondence.
Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. P. Vlasova

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

M. A. Kovalenko

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

E. A. Ovchinnikova

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. D. Babenko

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

G. A. Teregulova

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

G. V. Uvarov

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. L. Stepanov

Moscow State University

Email: manucharova@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

  1. Bürgmann H., Widmer F., Sigler W.V., Zeyer J. mRNA extraction and reverse transcription-PCR protocol for detection of nifH gene expression by Azotobacter vinelandii in soil // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1928‒1935. https://doi.org/10.1128/AEM.69.4.1928-1935.2003
  2. Hallin S., Jones C.M., Schloter M., Philippot L. Relationship between n-cycling communities and ecosystem functioning in a 50-year-old fertilization experiment // ISME J. 2009. V. 53. P. 597‒605.
  3. https://doi.org/10.1038/ismej.2008.128
  4. Hendrickx B., Junca H., Vosahlova J., Lindner A., Ruegg I., Bucheli-Witschel M., Faber F., Egli T., Mau M., Pieper, D.H., Top E.M., Dejonghe W., Bastiaens L., Springael D. Alternative primer sets for PCR detection of genotypes involved in bacterial aerobic BTEX degradation: distribution of the genes in BTEX degrading isolates and in subsurface soils of a BTEX contaminated industrial site // J. Microbiol. Meth. 2006. V. 64. P. 250–265. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2005.04.018
  5. Henry S., Baudouin E., López-Gutiérrez J.C., Martin-Laurent F., Brauman A., Philippot L. Quantification of denitrifying bacteria in soils by nirK gene targeted real-time PCR // J. Microbiol. Meth. 2004. V. 59. P. 327‒335.
  6. https://doi.org/10.1016/J.MIMET.2004.07.002
  7. Gogmachadze L.G., Khusnetdinova K.A., Stepanov A.L., Kravchenko I.K. Microcosm study of ammonium and drying impact on methane oxidation in agricultural soil // J. Agric. Environ. 2023. V. 36. P. 10‒22. https://doi.org/10.23649/JAE.2023.36.7
  8. Langille M., Zaneveld J., Caporaso J.G., McDonald D., Knights D., Reyes J., Clemente J., Burkepile D., Vega Thurber R., Knight R., Beiko R., Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. P. 814–821.
  9. https://doi.org/10.1038/nbt.2676
  10. Manucharova N.A., Pozdnyakov L.A., Vlasova A.P., Yanovich A.S., Ksenofontova N.A., Kovalenko M.A., Stepanov P.Y., Gennadiev A.N., Golovchenko A.V., Stepanov A.L. Metabolically active prokaryotic complex in grassland and forests’ sod-podzol under polycyclic aromatic hydrocarbon influence // Forests. 2021. V. 12. P С. 1103‒1117.
  11. https://doi.org/10.3390/f12081103
  12. Manucharova N.A., Ksenofontova N.A., Belov A.A., Kamenskiy N.N., Arzamazova A.V., Zenova G.M., Kinzhaev R.R., Trofimov S.Y., Stepanov A.L. Prokaryotic component of oil-contaminated oligotrophic peat soil under different levels of mineral nutrition: biomass, diversity, and activity // Euras. Soil Sci. 2021. V. 54. P. 89–97.
  13. https://doi.org/10.31857/s0032180x2101010x
  14. Markowitz V.M., Chen I.-M.A., Palaniappan K., Chu K., Szeto E., Grechkin Y., Ratner A., Jacob B., Huang J., Williams P., Huntemann M., Anderson I., Mavromatis K., Ivanova N.N., Kyrpides N.C. IMG: the Integrated Microbial Genomes database and comparative analysis system // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. Database iss. P. D115‒D122.
  15. https://doi.org/10.1093/nar/gkr1044
  16. Samarghandi M.R., Arabestani M.R., Zafari D., Rahmani A.R., Afkhami A., Godini K. Bioremediation of actual soil samples with high levels of crude oil using a bacterial consortium isolated from two polluted sites: investigation of the survival of the bacteria // Global NEST J. 2018. V. 20. P. 432–438.
  17. Sutton N.B., Maphosa F., Morillo J.A., Al-Soud W.A., Langenhoff A.A.M., Grotenhuis T., Rijnaarts H.H.M., Smidt H. Impact of long-term diesel contamination on soil microbial community structure // Appl. Environ. Microbiol. 2013. V. 79. P. 619–630.
  18. Wang Q., Garrity G.M., Tiedje J.M., Cole J.R. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 5261–5267.
  19. https://doi.org/10.1128/AEM.00062-07
  20. Wang Q., Duan B., Yang R., Zhao Y., Zhang L. Screening and identification of chitinolytic actinomycetes and study on the inhibitory activity against turfgrass root rot disease fungi // J. Biosci. Medic. 2015 V. 3. P. 56065. https://doi.org/10.4236/jbm.2015.33009

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Principal component analysis using the Bray–Curtis metric of the structure of prokaryotic communities of the studied samples with the addition of substrates (chitin biopolymer or hydrocarbons).

Download (109KB)
Indexing metadata
3. 2. Biodegradation of xenobiotics: A — aminobenzoate; B — benzoate; C — caprolactams; D — chloroalkanes/chloroalkenes; E — chlorocyclohexane/chlorobenzene; F — naphthalene; G — PAHs. The studied samples: 1 ‒ chernozem; 2 ‒ chernozem incubated with a resource; 3 — chestnut soil with a resource; 4 — chestnut soil; 5 — sod-podzolic soil incubated with a resource; 6 ‒ sod-podzolic soil; 7 ‒ permafrost; 8 ‒ permafrost incubated with a resource.

Download (116KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».