Email this article 
Rhodococcus qingshengii GlMm1 as the Basis of a Biosensor for Determination of the Fungicide Carbendazim
- Authors: Kuvichkina T.N.1, Kaparullina E.N.1, Doronina N.V.1, Reshetilov A.N.1
-
Affiliations:
- G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
- Issue: Vol 93, No 2 (2024)
- Pages: 145-148
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/262499
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624020086
- ID: 262499
Cite item
Full Text
Abstract
The possible application of Rhоdococcus qingshengii strain GlMm1, isolated from a Dead Sea clay sample, as the basis of a biosensor for determining the benzimidazole fungicide carbendazim was investigated. High sensitivity of the biosensor under neutral pH and up to 500 mM NaCl at 2 to 160 μM carbendazim was maintained for up to 30 days.
Full Text
Низкомолекулярные органические соединения (2,4-динитрофенол, ортофталат натрия, карбендазим) характеризуются высокой степенью токсичности. Для определения этих соединений могут быть использованы амперометрические биосенсоры, в которых в качестве чувствительного элемента применяются микроорганизмы. Разработаны биосенсоры для определения 2,4-динитрофенола и ортофталата натрия с использованием штаммов Rhodococcus erythropolis HL PM-1 и Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ас-2782, соответственно (Китова и соавт., 2004, Кувичкина и соавт., 2015, Патент, 2015).
Известно, что бензимидазольный фунгицид карбендазим широко используется в сельском хозяйстве для борьбы с различными грибными заболеваниями. Карбендазим химически стабилен и может сохраняться в почве в течение года (Singh et al., 2016). Показано его негативное влияние на печень, эндокринную и репродуктивные системы человека. Деградация этого соединения может происходить в окружающей среде под действием ряда микроорганизмов (Zhang et al., 2022). Известно ограниченное количество деструкторов карбендазима, среди которых преобладают грамположительные актинобактерии, принадлежащие к роду Rhodococcus. Несмотря на широкое использование этого фунгицида, пути его деградации изучены недостаточно. Однако охарактеризованы первые ферменты разложения карбендазима (Pandey et al., 2010; Zhang et al., 2022).
Цель данной работы ‒ исследование возможности использования иммобилизованных клеток (ИмК) Rhоdococcus qingshengii GlMm1 как основы биосенсора для определения бензимидазольного фунгицида карбендазима.
Штамм GlMm1 изолирован из образца глины Мертвого моря в рамках этого исследования. Чистую культуру выделяли на агаризованной среде ГКА (глюкозо-картофельный агар), содержащей 10 г глюкозы, 18 г агара, 300 мл картофельного настоя, 700 мл дистиллированной воды. Культуру выращивали на среде ГКА в течение 2‒3 сут при температуре 28C. Чистоту выделенной культуры контролировали световой микроскопией и по однородности колоний на агаризованной среде.
ДНК выделяли с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit (“Zymo Research”, США), согласно инструкции производителя. Ген 16S рРНК амплифицировали методом ПЦР с использованием универсальных праймеров для прокариот 27f и 1492r (Lane, 1991), секвенирование ПЦР-фрагментов проводили, как описано ранее (Belova et al., 2023). Поиск последовательности гена 16S рРНК проводили в базах данных NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и JGI (https://img.jgi.doe.gov/), филогенетический анализ осуществляли с помощью пакетов программ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). На основании секвенирования гена 16S рРНК штамм GlMm1 принадлежал к известному виду, поскольку имел 100% сходства с представителем рода Rh. qingshengii djl-6T (Xu et al., 2007).
Штамм Rh. qingshengii GlMm1 поддерживали на скошенном ГКА при температуре 28C. Для культивирования штамма GlMm1 использовали минеральную среду “К” состава (г/л): KH2PO4–2.0; (NH4)2SO4–2.0; MgSO4.7H2O — 0.125; NaCl — 0.5; FeSO4. 7H2O — 0.002; pH — 7.5; доводили 5М NaOH. В качестве источника углерода использовали 0.04% карбендазима. В стерильную среду делали смыв клеток штамма с поверхности агаризованной среды ГКА (1 пробирка), а затем культивировали на качалке (200 об./мин) при температуре 28C в течение 2 сут. Для приготовления носителя (биорецептора) биомассу клеток штамма GlMm1, выращенную на жидкой минеральной среде с карбендазимом в качестве единственного источника углерода и энергии, отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 3 мин, дважды отмывали 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7.1) и ресуспендировали. Иммобилизацию клеток (ИмК) проводили методом физической адсорбции на хроматографической бумаге Whathman GF/A (Великобритания). Клеточную суспензию наносили на бумагу, формируя пятно диаметром 3 мм, и подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Масса ИмК на биорецепторе составляла 2 мг сырого веса. Полученный биорецептор помещали на рабочую поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали его с помощью нейлоновой сетки. Измерения проводили с помощью гальваностата-потенциостата IPC–Micro (ООО “Кронас”, Россия), интегрированного с персональным компьютером. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt в пикоамперах в секунду (пА/с) (ответ биосенсора), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребляемого кислорода.
В условиях эксперимента использовали нерастущую культуру, для которой следовало ожидать стабильные стехиометрические соотношения между количеством потребленного кислорода и концентрацией карбендазима. Кинетические константы скорости потребления кислорода и деградации карбендазима идентичны. Максимальные скорости обоих процессов взаимно пропорциональны. Сравнение значений скорости потребления кислорода является обоснованным для подобного параметра деградации карбендазима.
Для изучения влияния концентраций карбендазима на потребление кислорода ИмК концентрации субстрата варьировали в диапазоне от 2 до 160 мкМ. На рис. 1 представлена градуировочная кривая зависимости ответа биосенсора от концентрации карбендазима.
Рис. 1. Градуировочная зависимость биосенсора на основе ИмК Rhodococcus qingshengii GlMm1 от концентрации карбендазима. Ответ биосенсора в пикоамперах в секунду (пА/с).
Показано, что скорость деградации карбендазима возрастала по мере повышения его концентрации. Полученная зависимость величины ответа сенсора от концентрации карбендазима имеет классический сигмоидальный вид (рис. 1), ее аппроксимация проводилась с помощью уравнения Хилла с четырьмя параметрами, коэффициент смешанной корреляции R2 = 0.99 в программе Sigma Plot 12.5. Для биосенсора на основе ИмК Rh. qingshengii GlMm1 были рассчитаны параметры уравнения Хилла: максимальная скорость потребления кислорода (Vмакс) 62.11 пА/с и константа сродства к субстрату 145.53 мкМ.
В ходе эксперимента определяли оптимальное значение рН буферного раствора в диапазоне значений рН 5‒11. Наиболее эффективным оказался 50 мМ калий-фосфатный буфер со значениями pH, близкими к нейтральным.
Исследовали зависимость ответов биорецептора от ионной силы в диапазоне от 25 до 500 мМ NaCl. Биорецептор регистрировал значительные ответы даже при высоких концентрациях хлористого натрия (до 500 мМ), в отличие от других биосенсоров на низкомолекулярные органические соединения (Китова и соавт., 2002; Кувичкина и соавт., 2015a). Возможно, это связано с источником выделения (Мертвое море), в котором концентрация соли достигает 34%.
Для оценки субстратной специфичности биорецептора на основе ИмК штамма Rh. qingshengii GlMm1 использовали ряд органических соединений в концентрации 0.1 мМ (рис. 2). Показано, что при введении раствора катехола в кювету биорецептор регистрировал ответ более 80 пА/с. Предположили, что одним из интермедиатов разложения карбендазима является катехол, также как у Pseudomonas sp. CBW (Fang et al., 2010).
Рис. 2. Субстратная специфичность ИмК штамма Rh. qingshengii GlMm1. Обозначения: 1 — катехол; 2 — фруктоза; 3 — L(‒) ‒ арабит; 4 — D-глюкоза; 5 — D-сорбит; 6 ‒ D(+)-целлобиоза; 7 — метиламин; 8 — диметиламин; 9 ‒ карбендазим (концентрация субстратов 0.1 мМ). Ответ биосенсора в пикоамперах в секунду (пА/с).
Кроме того, типовой штамм Rh. qingshengii djl-6T способен расти на катехоле, глюкозе, фруктозе и карбендазиме (Xu et al., 2007).
Операционная стабильность является одной из важнейших характеристик биосенсора. Величина ответа биосенсора на карбендазим остается стабильной в течение 6 измерений.
Время отклика — это время, требующееся для того, чтобы аналитическая система пришла в состояние равновесия с определяемым веществом. В данном случае при введении карбендазима в кювету время отклика составляло 1.5 мин, время восстановления составляло 23.5 мин. Таким образом, длительность одного измерения, включающая время отклика и время регенерации, составило 25 мин.
Долговременная стабильность, характеризующая устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени, показала, что ответ был стабильным в течение 30 сут.
Данное исследование позволило создать макет амперометрического биосенсора на основе ИмК штамма актинобактерий Rhodococcus qingshengii GlMm1 для определения фунгицида карбендазима. Таким образом, Rhodococcus qingshengii GlMm1 перспективен для деградации и биоконтроля остаточных концентраций этого фунгицида в экологически чистом земледелии.
ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант № 075-15-2021-1051).
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют, что у них отсутствует конфликт интересов.
ВКЛАД АВТОРОВ
Все авторы анализировали и обсуждали данные, и участвовали в подготовке статьи.
About the authors
T. N. Kuvichkina
G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Email: lenokap80@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290
E. N. Kaparullina
G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Author for correspondence.
Email: lenokap80@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290
N. V. Doronina
G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Email: lenokap80@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290
A. N. Reshetilov
G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Email: lenokap80@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290
References
- Китова А.Е., Кувичкина Т.Н., Аринбасарова А.Ю., Решетилов А.Н. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL PM-1 // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т. 40. С. 307‒311.
- Kitova A.E., Kuvichkina T.N., Arinbasarova A.Y., Reshetilov A.N. Degradation of 2,4-dinitrophenol by free and immobilized cells of Rhodococcus erythropolis HL PM-1 // Appl. Biochem. Microbiol. 2004. V. 40. P. 258–261.
- Кувичкина Т.Н., Будина Д.В., Олькова А.С., Решетилов А.Н. Оценка присутствия ди-(2-этилгексил)фталата в поливинилхлоридных пластикатах масс-спектрометрическим и биосенсорным методами // Теоретическая и прикладная экология. 2015. № 4. С. 11‒15.
- Патент на полезную модель 2015. № 156 546.
- Belova A.A., Kaparullina E.N., Agafonova N.V., Grouzdev D.S., Kopitsyn D.S., Machulin A.V., Doronina N.V. Ancylobacter crimeensis sp. nov., a new species of aerobic methylotrophic bacteria isolated from Oak phyllosphere // Microbiology (Moscow). 2023. V. 92.P. 598–608.
- Fang H., Wang Y., Gao C., Yan H., Dong B., Yu Y. Isolation and characterization of Pseudomonas sp. CBW capable of degrading carbendazim // Biodegradation. 2010. V. 21. P. 939–946.
- Pande G. Domian S.J., Russell R.J., Brearley C., Kotsonis S., Cakeshott J.G. Cloning and biochemical characterization of a novel carbendazim (metyl-1H-benzimidazol-2-ylcarbamate)-hydrolyzing esterase from newly isolated Nocardiodes sp. strain SG-4G fnd its potential for use ln enzymatic bioremediation // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 75. P. 2040‒2945.
- Singh S., Singh N., Kumar V., Datta S., Wani B., Singh D., Singh K., Singh J. Toxicity, monitoring and biodegradation of the fungicide carbendazim // Environ. Chem. Lett. 2016. V. 14. Р. 317‒329.
- Xu J.L., He J., Wang Z.C., Wang K., Li W.J., Tang S.K., Li S.P. Rhodococcus qingshengii sp. nov., a carbendazim-degrading bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. Р.2754‒2757.
- Zhang M., Bai X., Li Q., Zhang L., Zhu Q., Gao S., Ke Zh., Jiang M., Hu J., Qiu J., Hong Q. Functional analysis, diversity and distribution of carbendazim hydrolases Mhel and CbmA, responsible for the initial step in carbendazim degradation // Environ. Microbiol. 2022. V. 24. P. 4803‒4817.
Supplementary files
