The MAMP Peptide Patterns of Bacterial Flagellins and Their Interaction with Plant Receptors: Bioinformatic and Coevolutionary Aspects

Full Text

Ассоциированные с микробами молекулярные паттерны MAMP (PAMP для фитопатогенов) представляют собой высоко консервативные пептидные мотивы во флагеллинах бактерий, распознаваемые поверхностными рецепторами растительных клеток (Felix et al., 1999). В случае патогенов это приводит к запуску систем фитоиммунитета (Fliegmann, Felix, 2016) с участием обогащенного лейцином киназного рецептора FLS2, вовлеченного в восприятие пептида из N-концевой части бактериального флагеллина, состоящего из 22 аминокислотных остатков (ао) (flg22) (Gómez-Gómez, Boller, 2000), и FLS3, взаимодействующего с другим пептидом длиной 28 ао (flgII-28) из той же части флагеллина (Hind et al., 2016). В работе (Cai et al., 2011) отмечается, что появление во флагеллине фитопатогенов характерного паттерна flgII-28 может быть обусловлено реакцией растений на ослабление FLS2+flg22-зависимого иммунитета при коэволюционных изменениях в геномах организмов.

Взаимодействие MAMP с растительными рецепторами является одной из основ механизма ассоциативных/симбиотических растительно-микробных отношений (Проворов и соавт., 2018). Однако для широкого круга стимулирующих рост растений ризобактерий (PGPR) наличие указанных выше паттернов и их взаимодействия с растительными рецепторами практически мало изучены.

В данной работе нами была проведена сравнительная идентификация MAMP во флагеллинах различных типов — белке полярного (FliC) и латерального (Laf1) жгутиков, соединительном белке крюка с филаментом (FlgL), весьма сходном в 3D-структуре с флагеллином (Hu, Reevesa, 2020) — у представителей фитопатогенной, ассоциативной и клубеньковой микрофлоры. При этом мы принимали во внимание отличия в размерах молекул среди флагеллинов одного и того же типа. В статье Thomson et al. (2018) дано много примеров бактериальных жгутиковых систем с флагеллинами, размеры которых варьируют в широких пределах и нередко значительно превышают общеизвестные, достигая порядка 1000 ао и выше. В таких случаях для обозначения размера белка мы использовали нижний индекс, к примеру, FliC₂₇₄, FliC₆₂₁ и т. д.

Нашей целью было выяснение мотивов в последовательностях флагеллинов, определяющих наличие или отсутствие у них элиситорных (связанных с иммунитетом растений) свойств, и оценка взаимодействий MAMP с растительными рецепторами методом молекулярного докинга.

В качестве канонических образцов MAMP использованы аминокислотные последовательности пептидов flg22 и flgII-28, являющихся фрагментами флагеллинов FliC, соответственно, из животного патогена Pseudomonas aeruginosa ATCC700888 и фитопатогена P. syringae pv. tomato T1. Аминокислотная последовательность пептида flg22 идентична соответствующему участку флагеллинов многих штаммов рода Pseudomonas, включая указанный выше штамм, выделенный из промышленных вод. Учитывая его принадлежность к виду синегнойной палочки, данный штамм был условно отнесен нами к животным патогенам, при том, что известно его выраженное элиситорное действие на ряд растений (Felix et al., 1999; Gomez-Gomez, Boller, 2000), дабы отличить его от признанных фитопатогенов и PGPR. Примеры взаимодействий энтеробактерий с растениями приведены также в работе (Garcia et al., 2014). Со стороны растений использованы последовательности рецепторов FLS2 и FLS3, соответственно, из Arabidopsis thaliana L. и Solanum lycopersicum L.

Были задействованы наборы из базы данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) десятков гомологичных последовательностей FliC, Laf1 и FlgL представителей патогенной микрофлоры, использованных в работе (Garcia et al., 2014), и PGPR семейств Azospirillaceae, Brucellaceae и Rhizobiaceae. При необходимости для указания длины аминокислотной последовательности белка в его обозначении использовали нижний индекс (см. выше).

Множественные выравнивания последовательностей (МВП) белков проводили с использованием программы Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). Логотип, соответствующий МВП с гомологичными последовательностями, получали с помощью программы Blast2logo (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? Blast2logo-1.1). Предсказания 3D-структур белковых комплексов (молекулярный докинг) выполняли с применением программы AlphaFold2 в варианте AlphaFold-Multimer (https://github.com/deepmind/alphafold#running-alphafold-multimer), инсталлированной в вычислительном центре Саратовского госуниверситета (СГУ) (Щеголев и соавт., 2022). Достоверность предсказаний оценивали по параметру pDockQ с помощью программы FoldDock (https://githab.com/ElofssonLab/FoldDock). Физико-химические свойства границ раздела между взаимодействующими белковыми структурами анализировали с программой PDBePISA (https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html). Визуализацию 3D-структур белков и их комплексов осуществляли с применением программы Jmol (http://www.jmol.org).

Расположение пептидов в высококонсервативных N-концевых доменах флагеллинов в пределах 30‒51 ао (flg22) и 84‒111 ао (flgII-28) характеризует логотип МВП на рис. S1 в дополнительных материалах, полученный нами с последовательностью FliC P. aeruginosa ATCC700888 и пятьюстами гомологичными последовательностями. Он иллюстрирует весьма существенное отличие в уровне консервативности N- и C-концевых участков белков от их высоковариабельной промежуточной части.

Результаты биохимических исследований и рентгеноструктурного анализа в работах (Garcia et al., 2014; Sun et al., 2013) продемонстрировали ключевую роль глицина G18 в 18-й позиции последовательности пептида flg22 в образовании тройного комплекса FLS2+flg22 с корецептором BAK1, необходимого для запуска реакций фитоиммунитета. Мутационная замена G18 на иной остаток в аналогах flg22 делает невозможным проявление элиситорных свойств носителями такого пептида.

На дополнительном рис. S2 представлен фрагмент полученного нами МВП для флагеллинов из патогенов и PGPR семейства Azospirillaceae, иллюстрирующий такую замену во флагеллинах представителей PGPR. Это исключает образование отмеченного выше тримера, но не препятствует взаимодействиям между FLS2 и аналогами flg22 (Sun et al., 2013), что может служить сигналом для растения к установлению ассоциативных взаимоотношений с представителями PGPR (Проворов и соавт., 2018).

Полученные нами МВП с десятками белковых последовательностей показали, что пара специфических пептидов типа flg22 и flgII-28 неизменно присутствует во флагеллинах патогенной микрофлоры, в то время как у представителей семейств Azospirillaceae, Brucellaceae и Rhizobiaceae в подавляющем большинстве случаев регистрируется только flg22. Неожиданным исключением оказался лишь “короткий” флагеллин FliC₂₇₄ представителей семейства Azospirillaceae размером 274 ао (в отличие от “длинного” FliC₆₂₁ размером около 600 ао), в составе которого были выявлены аналоги обоих пептидов flg22 и flgII-28 (рис. 1; A, B). Более того, в составе его аналогов flg22 в 18-й позиции оказался глицин G18 (рис. 1; A), что характерно для фитопатогенов. Эти факты переводят “короткий” флагеллин представителей Azospirillaceae в категорию элиситоров, в то время как сами эти бактерии проявляют себя в качестве несомненных PGPR.

 

Рис. 1. Фрагменты МВП с пептидами flg22 (A, C), flgII-28 (B) и последовательностями FliC274 из представителей Azospirillaceae (A, B); фрагмент МВП с пептидом flg22 и последовательностями FliC из представителей PGPR (C). A. — Azospirillum, B. — Brucella, S. — Sinorhizobium.

 

Из литературы известны примеры образования гетерогенных филаментов флагеллинов бактерий и архей из белков с разными размерами и структурой. Среди вероятных причин для формирования жгутиков сложного состава отмечается расширение набора средств для взаимодействий бактерий с другими организмами. Например, с бактериофагами для уклонения от фаговой инфекции и др. Результаты молекулярного моделирования (дополнительный рис. S3) для двух штаммов Azospirillum, целью которого была оценка принципиальной возможности образования комплексов FliC₆₂₁+FliC₂₇₄, дают основания предположить использование подобного механизма азоспириллами. Однако, в целом, роль “короткого” флагеллина у представителей Azospirillaceae, проявившего признаки элиситора, и возможность его вклада в формирование жгутика на сегодняшний день не выяснены и требуют дополнительных исследований.

На рис. 1 (ряд С) приведен пример МВП с флагеллинами PGPR, иллюстрирующий замену G18 на тирозин Y18 в аналогах flg22 у представителей бруцелл и ризобий. В дополнительных материалах (рис. S4‒S6) приведены результаты выявления паттернов flg22 и flgII-28 в более широком круге объектов из ассоциативной и клубеньковой микрофлоры: флагеллинах латеральных жгутиков Azospirillum и флагеллинах представителей Brucellaceae и Rhizobiaceae. В них продемонстрирована универсальность замены G18 на Y18 в аналогах flg22 и отсутствие аналогов пептида flgII-28 во флагеллинах PGPR. В соединительных белках FlgL во всех рассмотренных нами таксонах аналоги специфических пептидов flg22 и flgII-28 не обнаружены. Для иллюстрации этого на дополнительных рис. S7, S8 приведены примеры для азоспирилл. C учетом специфической роли FlgL и его исчезающе малого количества в жгутике по сравнению с десятками тысяч основных белков филамента, данный результат можно рассматривать в качестве свидетельства эффективности (отрицательного контроля) использованной нами методики выявления flg22 и flgII-28.

На рис. 2 показаны результаты молекулярного докинга, нацеленные на выяснение принципиальной возможности и особенностей взаимодействий выявленных нами аналогов специфических пептидов flg22 и flgII-28 из фитопатогена (Pectobacterium atrosepticum SCRI1043) и ассоциативной бактерии (Azospirillum baldaniorum Sp245) с растительными рецепторами FLS2 и FLS3.

В случае димера FLS2+flg22 (рис. 2; A‒D) все представленные здесь пары по критерию pDockQ ≥ 0.23 (Bryant et al., 2022) относятся к категории истинно взаимодействующих протеинов. Однако для FLS3+flgII-28 эффективными по этому критерию (рис. 2; E, F) следует признать взаимодействия специфических пептидов с растительными рецепторами только для патогенов. В то время как для аналога flgII-28 из “короткого” флагеллина азоспириллы (рис. 2; G) предсказанная модель не может считаться достоверной (pDockQ < 0.23, выделено овалом на рис. 2; G).

 

Рис. 2. Молекулярный докинг растительных рецепторов FLS2 (Ar. thaliana) (A‒D), FLS3 (S. lycopersicum) (E‒G) с бактериальными пептидами flg22 (A‒D), flgII-28 (E‒G) и их аналогами из фитопатогена и PGPR: P. aeruginosa ATCC700888 (A); Pc. atrosepticum SCRI1043 (B, F); A. baldaniorum Sp245, “длинный” флагеллин (C); A. baldaniorum Sp245, “короткий” флагеллин (D, G); P. syringae pv. tomato T1 (E). Овалом на рис. 2; G, выделены значения параметров, свидетельствующие о неэффективности взаимодействия для данной пары — рецептор + пептид.

 

Эти выводы согласуются с результатами независимых оценок интерфейсов взаимодействий, полученных с помощью программы PDBePISA. Изменения свободной энергии сольватации ∆ⁱG (ккал/моль), представленные на рис. 2, свидетельствуют об эффективности взаимодействий в шести из семи рассмотренных вариантов (рис. 2; A‒F). В отличие от них, самопроизвольное образование комплекса специфического пептида из “короткого” флагеллина азоспириллы с растительным рецептором FLS3 (рис. 2; G) по механизму гидрофобных взаимодействий оказывается невозможным (∆ⁱG > 0, выделено овалом на рис. 2; G).

Полученные результаты представляются достаточно обоснованными с коэволюционной точки зрения. В случае фитопатогена специфическое связывание рецептора с дополнительным паттерном flgII-28 нацелено на обнаружение патогена с усилением фитоиммунитета. Однако в случае PGPR у растения нет причин для столь строгого контроля за возможной “мимикрией” микропартнера с целью избежать действия фитоиммунитета, чем, вероятно, можно объяснить отсутствие аналогов flgII-28 в “длинном” флагеллине у представителей семейства Azospirillaceae. Несмотря на наличие в “коротком” флагеллине азоспирилл обоих паттернов flg22 и flgII-28, азоспириллы не проявляют себя как фитопатогены. Так что коэволюционные с растениями изменения в геномах данных представителей почвенной микрофлоры не должны достигать того состояния, при котором возможное взаимодействие дополнительного пептида flgII-28 с рецептором FLS3 могло бы послужить сигналом к проявлению фитоиммунитета.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность К.С. Тихонову и Д.К. Андрейченко за установку в вычислительном центре СГУ и помощь в использовании AlphaFold-Multimer и сопутствующего программного обеспечения.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

 

Рис. S1. Фрагменты логотипа профиля последовательности FliC из P. aeruginosa ATCC 700888 с 500 гомологичными последовательностями демонстрируют весьма существенное отличие уровня консервативности N- и C-концевых участков белков от их высоковариабельной промежуточной части, отмеченной стрелками, в которой сигнал логотипа исчезающе мал по сравнению с остальными частями логотипа.

 

Рис. S2. Фрагмент множественного выравнивания последовательностей (МВП) с flg22 для FliC бактерий — патогенных (А) и PGPR семейства Azospirillaceae (B) — демонстрирует присутствие у патогенов остатка G18 — ключевого для наличия у них элиситорных свойств — но замену его иными остатками у Azospirillaceae.

 

Рис. S3. 3D-модели AlphaFold-Multimer димерных комплексов FliC621(А, C)+FliC274 (B, D) для A. brasilense Sp7 (А, B) и A. baldaniorum Sp245 (C, D). Значения pDpckQ ≥ 0.23 свидетельствуют о достаточно высоком качестве моделирования и о принципиальной принадлежности димера FliC621+FliC274 к категории истинно взаимодействующих белков (Bryant et al., 2022).

 

Рис. S4. Фрагмент МВП с flg22 для флагеллина FliC414=Laf1 латерального жгутика представителей рода Azospirillum демонстрирует замену глицина G18 на тирозин Y18, что исключает наличие у Laf1 элиситорных свойств. Показанные строки отражают видовое разнообразие использованных объектов. МВП с тем же набором последовательностей Laf1 показало отсутствие в них аналогов flgII-28.

 

Рис. S5. Фрагмент МВП с flg22 для FliC300 представителей семейства Brucellaceae демонстрирует замену глицина G18 на тирозин Y18, что исключает наличие у FliC300 элиситорных свойств. Показанные строки отражают видовое разнообразие использованных объектов. МВП с тем же набором последовательностей FliC300 показало отсутствие в них аналогов flgII-28.

 

Рис. S6. Фрагмент МВП с flg22 для FliC320 представителей семейства Rhizobiaceae демонстрирует замену глицина G18 на тирозин Y18, что исключает наличие у FliC320 элиситорных свойств. Аналогичный результат был получен с более многочисленными наборами гомологичных флагеллинов ризобий FliC320 и FliC395 количеством по несколько десятков. МВП с тем же набором последовательностей FliC320 показало отсутствие в них аналогов flgII-28.

 

Рис. S7. Фрагменты МВП с flg22 для FlgL представителей рода Azospirillum демонстрируют отсутствие в данных белках структур, гомологичных пептиду flg22, поскольку выровненными являются лишь отдельные, разделенные брешами части flg 2 2 в областях МВП за пределами высококонсервативного участка, соответствующего flg22 во флагеллине FliC бактерий (см. рис. S1), весьма сходного в ٣D-структуре с FlgL (Hu, Reevesa, 2020).

 

Рис. S8. Фрагменты МВП с flgII-28 для FlgL представителей рода Azospirillum демонстрируют отсутствие в данных белках структур, гомологичных пептиду flgII-28, поскольку выровненными являются лишь отдельные, разделенные брешами части flgII-28 в областях МВП за пределами высококонсервативного участка, соответствующего flgII-28 во флагеллине FliC бактерий (см. рис. S1), весьма сходного в 3D-структуре с FlgL (Hu, Reevesa, 2020).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Bryant P., Pozzati G., Elofsson A. Improved prediction of protein-protein interactions using AlphaFold2 // Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1265. P. 1–11.

Hu D., Reevesa P.R. The remarkable dual-level diversity of prokaryotic flagellins // mSystems. 2020. V. 5. № 5. e00705-19.

About the authors

S. Yu. Shchyogolev

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: shegolev_s@ibppm.ru
Russian Federation, Saratov, 410049

G. L. Burygin

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: shegolev_s@ibppm.ru
Russian Federation, Saratov, 410049

Yu. V. Krasova

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: shegolev_s@ibppm.ru
Russian Federation, Saratov, 410049

L. Yu. Matora

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: shegolev_s@ibppm.ru
Russian Federation, Saratov, 410049

References

Supplementary files