Hydrocarbon-Oxidizing Bacteria of the Bottom Ecotopes of the Barents and Pechora Seas

V. O. Pyrkin; Пыркин В. О.; L. A. Gavirova; Гавирова Л. А.; A. R. Stroeva; Строева А. Р.; A. Yu. Merkel; Меркель А. Ю.; O. N. Vidishcheva; Видищева О. Н.; A. G. Kalmykov; Калмыков А. Г.; E. A. Bonch-Osmolovskaya; Бонч-Осмоловская Е. А.

doi:10.31857/S0026365624030081

Hydrocarbon-Oxidizing Bacteria of the Bottom Ecotopes of the Barents and Pechora Seas

Authors: Pyrkin V.O.¹, Gavirova L.A.¹, Stroeva A.R.¹, Merkel A.Y.², Vidishcheva O.N.¹, Kalmykov A.G.¹, Bonch-Osmolovskaya E.A.¹^,2
Affiliations:
1. Lomonosov Moscow State University
2. Winogradsky Institute of Microbiology, Federal Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 93, No 3 (2024)
Pages: 330-335
Section: SHORT COMMUNICATIONS
URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/265063
DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624030081
ID: 265063

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Microorganisms capable of degrading hydrocarbons are regular components of natural microbial communities and play an important role in self-purification of marine environments from oil contamination. High-throughput sequencing of the 16S rRNA gene V4 variable region was used to analyze microbial communities of the Barents and Pechora seas and of the microcosms with a spectrum of hydrocarbon substrates: oil, n-nonane, n-undecane, and phenanthrene. The Barents Sea communities of hydrocarbon-oxidizing microorganisms were characterized by predominance of the genera Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Porticoccus, and Oleispira, while those of the Pechora Sea contained members of the genera Rhodococcus, Dietzia, Sphingorhabdus, and Hyphomonas. Pure cultures of these microorganisms were shown to utilize the major oil hydrocarbons: n-alkanes, cycloalkanes, and aromatic compounds.

Keywords

Barents Sea, Pechora Sea, microbial diversity, 16S rRNA gene, hydrocarbon-oxidizing microorganisms

Full Text

Арктические моря являются важным ресурсом с точки зрения имеющихся в них запасов углеводородов: по данным геологоразведки в них находится большая часть мировых запасов нефти и газа (Патин, 2017). Акватории Баренцева, Печорского и Карского морей считаются самыми ресурсоемкими; в их пределах сосредоточено около 62.7% суммарных геологических ресурсов акватории РФ (Еремин и соавт., 2010). Перспектива разработки нефтяных месторождений в Баренцевом и Печорском морях делает актуальным исследование микробного разнообразия в этих местообитаниях, так как важно понимать, насколько природные микробные сообщества арктических морей способны справиться с нефтяными загрязнениями, неизбежно сопутствующими разработке месторождений углеводородов. Баренцево море является самым западным морем Арктики и находится под значительным влиянием Атлантического океана, в результате чего более соленая и теплая вода Атлантики смешивается с холодной и более пресной водой Арктики. Печорское море является заливом Баренцева моря, образуемым впадением в него реки Печоры, и характеризуется пониженной, по сравнению с Баренцевым морем, соленостью (Rogozhin et al., 2023).

Целью настоящей работы было изучение углеводородокисляющих микроорганизмов Баренцева и Печорского морей и их потенциала к биоремедиации путем анализа микробных сообществ придонных экотопов и микрокосмов, полученных в присутствии различных углеводородных субстратов.

В работе анализировались образцы придонной воды и грунта из северной части Баренцева моря и центральной части Печорского моря. Пробоотбор в Баренцевом море осуществлялся в августе 2020 года и в сентябре‒октябре 2021 года в ходе рейсов TTR-19 и TTR-20 НИС “Академик Николай Страхов”. Пробоотбор в Печорском море осуществлялся в августе 2020 года на ИС “Картеш”. Образцы придонной морской воды отбирали батометром Нискина (ИС “Картеш”), или из верхней части гравитационной трубы (НИС “Академик Николай Страхов”). Для концентрации клеток микроорганизмов и их последующего анализа морскую воду в объеме 2 л после доставки на борт судна фильтровали через систему стекловолоконного предфильтра (Glass Fiber Filter Membrane Filters, “GVS”) и мембранного фильтра с диаметром пор 0.22 мкм (“Merck”). Образцы грунта отбирали из верхних слоев донных отложений глубиной 0‒5 см, с помощью дночерпателя (ИС “Картеш”) или гравитационной трубы (НИС “Академик Николай Страхов”).

Сообщества углеводородокисляющих микроорганизмов были получены методом микрокосмов в два этапа. На первом этапе образцы придонной морской воды и грунта в количестве 5% от объема минеральной среды ONR7a (Dyksterhouse et al., 1995) культивировали в присутствии нефти 0.2% (Oil) и без внесения углеводородного субстрата (Control_oil) в течение 7 сут. На втором этапе полученную культуру пересевали на индивидуальные углеводороды – н-нонан (Nonane), н-ундекан (Undecane), фенантрен (Phenantrene) и отдельно вели контрольную линию (Control_HC) (рис. 1). Культивирование проводили в орбитальном шейкере (“New Brunswick”, Германия) в пластиковых пробирках объемом 50 мл с закручивающимися крышками при 15°C и 180 об./мин. Выделение чистых культур проводили при температуре 15°C на твердых агаризованных средах: ONR7a с внесением углеводородов и Plate Count Agar (PCA) (г/л): K₂HPO₄ – 1.5; КH₂PO₄ – 0.75; MgSO₄∙ 7H₂O – 1.0; (NH₄)₂SO₄ – 4.0; NaCl – 30; гидролизат казеина – 5.0; дрожжевой экстракт – 2.5; D(+)-глюкоза – 1.0; дистиллированная вода, рН 7.0. Концентрацию клеток микроорганизмов в образцах придонной воды оценивали методом люминесцентной микроскопии с окрашиванием акридином оранжевым. В грунте абсолютную численность бактерий оценивали методом ПЦР в реальном времени с использованием универсальных праймеров на V4 участок гена 16S рРНК: Pro515F и Pro-mod-805R (Hugerth et al., 2014, Меркель и соавт., 2019). Реакцию проводили с использованием готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”, Россия) на приборе StepOnePlus (“Thermo Fisher Scientific”, США). Для выделения образцов тотальной ДНК из природных образцов и микрокосмов использовали коммерческий набор FastDNA SPIN Kit for Soil (“MP Biomedicals”, США). Библиотеки участка V4 генов 16S рРНК для высокопроизводительного секвенирования на системе Illumina MiSeq готовили по двухэтапной схеме ПЦР, описанной Gohl et al. (2016). Профили микробных сообществ придонной морской воды, донных отложений и микрокосмов по гену 16S рРНК были получены с помощью ПЦР и высокопроизводительного секвенирования нового поколения (Illumina MiSeq). Для обработки нуклеотидных последовательностей был использован метод ASV (Caruso et al., 2019). ASV-таблица была создана с помощью ПО Dada2 (Callahan et al., 2016) и базы данных SILVA 138 (Quast et al., 2013). Последовательности фрагментов гена 16S рРНК были депонированы в базе данных SRA (NCBI) под номером биопроекта PRJNA980746, PRJNA1005790. Для амплификации последовательности гена 16S pРНК выделенных чистых культур использовали праймеры 27F и 1492R. Анализ хроматограмм проводили в программе BioEdit. Для анализа полученных последовательностей использовали базу данных BLASTn. Степень деструкции углеводородов определяли с помощью газо-жидкостной хроматографии на газовом хроматографе Agilent 8890 (США), соединенном c масс-селективным детектором 5977В с высокоэффективным источником ионизации Inert plus.

Рис. 1. Усредненный филогенетический состав сообществ микрокосмов из придонной воды и грунта Баренцева (а) и Печорского (б) морей, полученный путем NGS профилирования по гену 16S рРНК

Из 20 образцов придонной морской воды, 7 образцов донных отложений из Баренцева моря, 6 образцов придонной морской воды и 6 образцов донных отложений из Печорского моря была определена абсолютная численность клеток микроорганизмов, выделена ДНК и, методом NGS, по гену 16S рРНК проанализирован состав микробных сообществ.

Численность прокариот в 1 мл придонной морской воды составила от 1.36 × 10⁵ до 4.5 × 10⁷ кл./мл. В образцах грунта концентрация микроорганизмов варьировала 1.5 × 10⁷ до 6 × 10⁹ кл./см³. В микробных сообществах придонной воды Баренцева моря доминировали представители Neptunomonas от 6.4 до 50%, SUP05 (Pseudomonadota) от 1.8 до 15.5%, Nitrosopumilus от 1.6 до 13.9%, неидентифицированные представители семейства Nitrincolaceae от 2 до 13.3%, морские органогетеротрофы Polaribacter от 1.2 до 12.6%, Luteolibacter от 1.2 до 11%, Clade Ia (Pseudomonadota) от 1.7 до 10.6%, некультивируемые сульфатредукторы Sva0081_sediment_group (Desulfobacterota) от 1.1 до 9.8%. Микробные сообщества донных отложений Баренцева моря характеризовались преобладанием неидентифицированных бактерий из семейств Hyphomicrobiaceae от 7.4 до 22.3%, Desulfocapsaceae от 4.2 до 8.1%, Desulfobulbaceae от 1.4 до 5.9%, а также некультивируемых бактерий рода Sva0081_sediment_group (Desulfobacterota) от 2.3 до 10%.

Микробные сообщества придонной воды Печорского моря были представлены некультивируемыми бактериями OM60(NOR5)_clade (Pseudomonadota) от 3 до 23.8% во всех исследованных образцах, неидентифицированными представителями семейства Nitrincolaceae от 14 до 21.8% и Amylibacter от 12.8 до 16.6%. В грунтах Печорского моря доминировали миксобактерии из семейства Sandaracinaceae от 7.5 до 26.7%, органогетеротрофные бактерии рода Woeseia от 2.4 до 24% и неклассифицированные Actinomarinales от 4.5 до 10%.

Из 38 микрокосмов с нефтью и 32 с индивидуальными углеводородами (н-нонан, н-ундекан и фенантрен), добавленными в качестве источника углерода и энергии, была выделена и проанализирована ДНК (рис. 1).

Также были проанализированы 22 микрокосма, культивируемых без внесения углеводородного субстрата. При культивировании придонной воды Баренцева моря в присутствии сырой нефти (рис. 1а, Oil) наблюдается увеличение, по сравнению с контролем (рис. 1а, Control_oil), относительного содержания бактерий родов Pseudoalteromonas с 5.4 до 33.16%, Pseudomonas с 0.48 до 15.57%, Oleispira с 0.94 до 10.04%. Добавление н-алканов привело к увеличению содержания неидентифицированных членов семейства Pseudomonadaceae с 8.1 до 41.14% в случае н-нонана (рис. 1а, Nonane) и до 37.63% (рис. 1а, Undecane). Использование фенантрена также стимулировало изменение состава микробного сообщества: было отмечено увеличение содержание бактерий родов Porticoccus с 0.32 до 46.01% и Pseudomonas с 5.02 до 21.09% (рис. 1а, Phenantrene).

Использование нефти в микрокосмах, полученных путем инкубирования смеси придонной воды и грунтов Печорского моря, приводило к доминированию, по сравнению с контролем, представителей рода Dietzia c 0.02 до 10.24%, Hyphomonas с 0.002 до 4.33%, Sphingorhabdus с 0.32 до 4.32% (рис. 1б, Oil). При посеве микробного сообщества на н-нонан и н-ундекан (рис. 1б, Nonane, Undecane) доминирующими таксонами были роды Sphingorhabdus (23.61 и 22.08%), Rhodococcus (13.76 и 20.97%), Dietzia (15.94 и 12.26%) и Hyphomonas (13.45 и 10.32%). В случае использования фенантрена микробными сообществами Печорского моря возрастало относительное количество бактерий родов Dietzia c 0.04 до 10.24% и Hyphomonas c 0.05 до 10.24% (рис. 1б, Phenantrene).

Таким образом, установлено, что при инкубировании придонной воды и грунта Баренцева и Печорского морей в присутствии углеводородных субстратов в микробных сообществах наблюдается существенное увеличение доли бактерий ряда таксонов. Не все перечисленные таксоны были представлены хотя бы в одной группе природных образцов, что могло быть связано с их предельно низким количеством в исследуемой пробе. В то же время в экспериментах с микрокосмами в присутствии углеводородных субстратов они оказались способными занимать доминирующее положение. Таксоны, доминирующие в микрокосмах, полученных из образцов Баренцева моря, помимо своей способности к утилизации углеводородов, ассоциированы с цветением фитопланктона. Фитопланктон, в свою очередь, может являться источником углеводородов в мировом океане, в результате чего создается так называемый краткосрочный цикл углеводородов (Lea-Smith et al., 2015). В микрокосмах из Печорского моря доминировали бактерии, которые исследователи обычно ассоциируют с территориями, хронически загрязненными нефтью (Carvalho et al., 2014; Wang et al., 2016; Nõlvak et al., 2021).

Из полученных микрокосмов были выделены чистые культуры представителей родов Pseudoalteromonas, Janibacter, Rhodoglobus, Rhodococcus, Psyhrobacter, для которых была изучена способность к утилизации углеводородов нефти. Для оценки утилизации линейных алканов использовались соотношения пристана (Pr) к н-гептадекану (н-С₁₇) и фитана (Ph) к н-октадекану (н-С₁₈). Пристан и фитан слабо подвержены процессам биологического окисления, в то время как исчезновение н-С₁₇ и н-С₁₈ в нефтях является первым признаком биодеградации (Гордадзе и соавт., 2015). Значения соотношений Pr/н-C₁₇ и Ph/н-C₁₈ в контроле (без внесения культуры бактерий) составляли 0.6 и 0.5. Соотношение пристана к фитану Pr/Ph, которое должно оставаться постоянным для исходной и подверженной микробному окислению нефти, как в контроле, так и в опытных образцах, составило 1.3‒1.4. Установлено, что наиболее активно разлагали н-алканы бактерии родов Rhodoglobus (Pr/н-C₁₇ = 10 и Ph/н-C₁₈ =10), Dietzia (4.2 и 4.2), Rhodococcus (2.3 и 2.7), Pseudoalteromonas (2.5 и 2.3); с меньшей интенсивностью – Psychrobacter (0.6 и 0.5) и Janibacter (0.7 и 0.5) (рис. 2а).

Рис. 2. Гистограмма значений соотношений маркеров биодеградации н-алканов (а) и ароматических соединений (б) исследованными чистыми культурами микроорганизмов

Биодеструкция ароматических соединений отслеживалась с помощью соотношения суммы метилнафталенов (MN) к диметилнафталенам (DMN) и триметилнафталенов (TMN): MN/(DMN + TMN); в контроле исследуемое соотношение составило 0.33. В процессе биодеградации значение данного индекса снижается за счет увеличения доли триметилнафталенов (Fisher et al., 1998). В деструкции алкильных нафталенов, входящих в состав нефти, активно участвовали бактерии родов Janibacter, соотношение MN/(DMN + TMN) = 0.04, Rhodoglobus – 0.06, Dietzia – 0.18, Psyhrobacter – 0.21, в то время как Rhodococcus – 0.36 и Pseudoalteromonas – 0.36 не показали активность утилизации ароматических соединений (рис. 2б).

Таким образом, таксоны, преобладавшие в составе микробных сообществ исследуемых донных экотопов Баренцева и Печорского морей, в целом являлись характерными для морских местообитаний, однако различались в случае образцов из двух исследованных морей. Отмеченные различия в составе микробных сообществ могут быть связаны как с флуктуационным характером солености, так и с большей близостью к берегу и возможной загрязненностью в местах отбора образцов в Печорском море. Последнее предположение подтверждается и составом микробных сообществ микрокосмов, использующих углеводородные субстраты. Микробные сообщества микрокосмов из образцов Баренцева моря характеризовались доминированием бактерий, ассоциированных с фитопланктоном, в то время как в микрокосмах из образцов Печорского моря преобладали представители родов с широким спектром потребления углеводородных субстратов. Выделенные в чистую культуру бактерии из сообществ микрокосмов способны окислять достаточно широкий спектр углеводородных субстратов, включающий н-алканы и ароматические соединения. Таким образом, установлено, что придонная вода Баренцева и Печорского морей обладает способностью к самоочищению от углеводородов нефти за счет утилизации компонентов нефти участниками микробных сообществ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Коллектив авторов выражает благодарности Центру морских исследований МГУ имени М. В. Ломоносова за предоставление образцов грунта и воды Баренцева и Печорского морей, а также командам экспедиций TTR19 и TTR20 и экипажу НИС “Академик Николай Страхов” за помощь в пробоотборе донных отложений и морской воды Баренцева моря.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнено при поддержке проекта РФФИ № 20-54-20001 Норв_т.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.