Comparative Genome Analysis and Assessment of the Functional Properties of Streptococcus thermophilus Strains

Full Text

Streptococcus thermophilus — грамположительная молочнокислая бактерия, широко используемая в качестве заквасочной культуры в молочной промышленности для изготовления йогуртов и ряженки, а также многих традиционных ферментированных продуктов. Этот вид молочнокислых бактерий в последние десятилетия привлекает широкий интерес исследователей из-за его широкого промышленного использования. Помимо своей технологической важности, в последние годы термофильный стрептококк вызывает интерес и как пробиотическая культура благодаря своим функциональным свойствам, способствующим укреплению здоровья человека. Показано, что некоторые штаммы S. thermophilus обладают различными пробиотическими свойствами (Vitetta et al., 2019), включая антиоксидантную (Roux et al., 2022), антимикробную (Evivie et al., 2017; Uriot et al., 2017), гипотензивную (Sebastián-Nicolas et al., 2021) активности. Тем не менее, многие из описанных сегодня в литературе свойств являются штамм специфичными характеристиками.

Целью данного исследования было инвентаризировать безопасность и пробиотические свойства двух штаммов S. thermophilus и изучить их внутривидовые различия на геномном уровне.

В работе использовали 2 штамма термофильного стрептококка Streptococcus salivarius ssp. thermophilus 16t (MN994627) и 159 (MN994626) из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности (ВНИМИ). Для культивирования использовали стерильное восстановленное обезжиренное молоко, микробиологические среды M17-бульон и M17-агар (“HiMedia”, Индия). Штаммы культивировали в аэробных условиях при температуре 37°C.

Для выделения ДНК штаммы S. thermophilus статически культивировали в 20 мл жидкой среды М17 при температуре (37 ± 1)°C до появления видимой опалесценции. Тотальную ДНК выделяли с использованием набора DNeasy mericon Food Kit (“Qiagen”, Валенсия, Калифорния, США), согласно протоколу производителя. Качество и количество выделенной ДНК проверяли с помощью Agilent Bioanalyzer 2100 (“Agilent Technologies”, Фостер-Сити, Калифорния, США) и флуориметра Qubit (“Thermo Fisher Scientific”, Уолтем, Массачусетс, США).

Библиотеки ДНК получали с использованием набора Ion AmpliSeq 2.0 (“Thermo Fisher Scientific”, Массачусетс, США) и индексировали с помощью набора адаптеров (штрих-кодов) Ion Xpress 1–16 (“Thermo Fisher Scientific”, Массачусетс, США). Качество и количество полученных ДНК-библиотек проверяли с помощью Agilent Bioanalyzer 2100. Секвенирование геномов (эквимолярно смешанных ДНК-библиотек) проводили с использованием персональной геномной машины Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) (“Thermo Fisher Scientific”, Массачусетс, США).

Сборку геномов de novo осуществляли с помощью CLC Genomics Workbench 11.0 (“Qiagen”, Валенсия, Калифорния, США). После сборки аннотации геномов были выполнены с помощью NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP), а также с использованием eggNOG, SignalP и SecretomeP онлайн интернет-сервисов. Геномы были депонированы в базу данных GenBank: S. thermophilus 16t (BioProject: PRJNA824719; JAMWGM01; ASM2389367v1) и S. thermophilus 159 (BioProject: PRJNA736961; JAHLXJ01; ASM1896690v1). Сравнительный геномный анализ проводили с использованием программного пакета Anvi’o.

Поиск мобильных генетических элементов осуществлялся с помощью программы ISfinder, поиск профагов — с помощью программы PHASTER, поиск плазмид — с помощью программы PlasmidFinder. Анализ наличия переносимых генов антибиотикорезистентности в полученных геномах проводился с помощью программ Resistance Gene Identifier и ResFinder 4.1. Анализ наличия генов факторов вирулентности проводился с помощью программ VirulenceFinder и PathogenFinder. Анализ наличия бактериоцин-кодирующих генов в полученных геномах проводился с помощью программы BAGEL4. Аннотацию метаболических путей проводили с помощью базы данных KEGG Pathway.

Углеводный и ферментативный профили исследовали с использованием тест-систем API 50CHL и API ZYM соответственно (“Bio-Merieux”, Франция).

Антибиотическую резистентность штаммов лактобактерий анализировали дискодиффузным методом с помощью набора дисков (“DI-PLS-50-01, NICF”, Санкт-Петербург, Россия), пропитанных различными видами антибиотиков. Диски накладывались на плотную питательную среду, засеянную культурой исследуемого штамма, после чего осуществляли культивирование в течение 24‒48 ч при температуре 37°C и последующее измерение диаметра зоны задержки роста вокруг дисков.

Секвенирование и аннотирование геномов. С помощью технологии Ion Torrent были получены черновые геномные последовательности (ЧГП, англ. draft genome sequences) S. thermophilus 16t и S. thermophilus 159 (табл. 1).

 

Таблица 1. Данные по секвенированию и аннотированию геномов Streptococcus thermophilus 16t (Str16t) и 159 (Str159)

Параметр	Str16t GCA_023893675.1	Str159 GCA_018966905.1
Секвенирование
Число прочтений	4 247 270	2 851 726
Среднее прочтение	208 п. о.	209 п. о.
Сборка
Размер сборки, п. о.	1 810 221	1 805 641
Среднее покрытие	100×	100×
Число контигов	76	75
Самый длинный контиг, п. о.	219 248	217 358
N50, п. о.	91 841	100 972
Средний размер контига, п. о.	23 519	27 766
Структурная аннотация
Гены (всего):	1909	1914
Кодирующие белки	1619	1607
Кодирующие РНК	63	61
Псевдогены	227	246
CRISPR-регион	2	2

 

Для обеих ЧГП покрытие составляло более 100×, а конечное число контигов 76 и 75 соответственно. Несмотря на отличающиеся почти в два раза число полученных прочтений, в целом характеристики обеих ЧГП были сходны — N50 контигов составляли около 100 к. п. о., а самые длинные контиги были в районе 220 к. п. о. В целом, полученные ЧГП имели сопоставимое качество с ранее опубликованными ЧГП других штаммов S. thermophilus.

Стабильность геномов. Стабильность генома заквасочных и пробиотических культур лактобактерий является крайне важным параметром для их успешного промышленного применения. Чем стабильней геном микроорганизма, тем меньше вероятность вырождения его культуры, проявляющаяся в утере ряда пробиотических свойств и технически полезных качеств. В связи с вышесказанным, в полученных геномах S. thermophilus был проведен поиск таких основных маркеров стабильности генома, как мобильные генетические элементы, профаги и плазмиды. Результаты проведенного поиска основных маркеров стабильности генома суммированы в табл. 2. В целом оба штамма показали сходную стабильность геномов.

 

Таблица 2. Маркеры геномной стабильности в геномах S. thermophilus 16t и 159

Штамм	Число мобильных элементов IS, шт.	Число профагов, шт.			Плазмиды, шт.
		Полные	Под вопросом	Неполные
16t	41	0	0	1	0
159	41	0	0	2	0

 

Сравнение геномов. Для выявления специфических геномных особенностей изучаемых штаммов S. thermophilus, был проведен сравнительный геномный анализ (рис. 1). Было обнаружено 3083 генных кластера, общих для обоих геномов. Для штамма S. thermophilus 16t было выявлено 18 штаммоспецифических генных кластеров, а для штамма S. thermophilus 159–19.

 

Рис. 1. Диаграмма Anvi’o, представляющая сравнительный геномный анализ штаммов S. thermophilus 16t (Str16t) и S. thermophilus 159 (Str159). Кластеры генов (два внутренних кольца) были упорядочены (внутренняя дендрограмма) в зависимости от их присутствия (сплошной цвет) или отсутствия (серый цвет) в геномах каждого штамма. Наличие у каждого кластера генов функциональных аннотаций указано зеленым цветом на кольце, подписанном в соответствии с типом аннотации

 

Гены факторов вирулентности. Анализ факторов вирулентности показал, что вероятность анализируемых штаммов S. thermophilus стимулировать развитие патогенных процессов в организме человека, как непосредственно, так и опосредовано, через обмен генами с другими микроорганизмами оценивается ниже 0.1%.

Антибиотикорезистентность. Анализ антибиотикорезистентности штаммов S. thermophilus, при тестировании диско-диффузионным методом (ДДМ), показал наличие резистентности к фосфомицину у штамма 16t и к амоксициллину с канамицином у штамма 159, к остальным группам антибиотиков была показана либо чувствительность, либо промежуточная чувствительность (рис. 2).

 

Рис. 2. Устойчивость штаммов S. thermophilus к различным группам антибиотиков: β-лактамы (Amp – ампициллин, Amx – амоксициллин, Oxa – оксациллин, PenG – пенициллин G); Fos – фосфомицин; Аминогликозиды (Gen – гентамицин, KanA – канамицин А, Neo – неомицин); Тетрациклины (Dox – доксициклин, Tet – тетрациклин); Макролиды (Azm – азитромицин); Линкозамиды (Lcm – линкомицин); Амфениколы (Chl – хлорамфеникол); Фторхинолоны (Lev – левофлоксацин, Pef – пефлоксацин)

 

В результате in silico анализа драфта геномов S. thermophilus не выявлено наличия известных трансмиссивных генов антибиотикорезистентности (AR), способных передаваться путем горизонтального генетического транспорта, таких как AR-гены устойчивости к: аминогликозидам (aac(6')-aph(2″) и aad(E)); тетрациклинам (tet(M), tet(W), tet(T), tet(K) и tet(L)); амфениколам (cat); макролидам и линкозамидам (erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(T) и mef(А)). В обоих геномах обнаружены детерминанты антибиотикорезистентности к β-лактамам. Они распознаны как β-лактамазы классов А (PenP) и C (AmpC), являющихся сериновыми β-лактамазами, а также различные металло-β-лактамазы класса B. В тоже время устойчивость к фосфомицину у штамма Str16t и к канамицину А у Str159, показанная методом ДДМ, обусловлена, вероятно, наличием молекулярных эффлюксных помп семейства MacB, а также эффлюксных помп семейств MATE (1 ген только в геноме 16t), SMR (по 1 гену в обоих геномах) и MFS (9 и 10 генов в геномах Str16t и Str159 соответственно), которые могут обуславливать устойчивость бактерий к различным антимикробным препаратам.

Кластеры бактериоцинов. Антимикробная активность является одним из наиболее хорошо известных свойств потенциально пробиотических штаммов. Бактериоцины представляют собой рибосомально-синтезируемые пептиды, обладающие антимикробной активностью. Известно, что штаммы S. thermophilus могут продуцировать бактериоцины с ингибирующей активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, включая такие, как Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, E. faecium, Clostridium butyricum, C. botulinum, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Bacillus cereus, Gardnerella vaginalis и Escherichia coli (Evivie et al., 2017, Uriot et al., 2017, Roux et al., 2022).

In silico анализ показал наличие четырех одинаковых генных кластеров бактериоцинов в геномах S. thermophilus (табл. 3).

 

Таблица 3. Кластеры бактериоцинов, предсказанные в геномах S. thermophilus 16t и 159

Кластер	Бактериоцин	Класс*
Blp	ComC/Бактериоцин	IIc
	ComC/Бактериоцин BlpD	IIc
	ComC/Бактериоцин	IIc
	ComC/Бактериоцин BlpU	IIc
	ComC/Бактериоцин BlpK	IIc
Str (Streptide LMD-9)	Стрептид	I (RiPPs)
Sactipeptide	Сактипептид	I (RiPPs)
Lab	Лантипептид	I (RiPPs)

*Классификация бактериоцинов в соответствии с (Soltani et al., 2021).

 

Они были аннотированы как: (1) Lab — кластер, кодирующий бактериоцин лантипептид из класса лантибиотиков; (2) Blp — кодирующий 5 циклических бактериоциноподобных пептидов II класса, включая blpD, blpU и blpK; (3) кластер генов, участвующих в биосинтезе сактипептида, характеризующегося наличием связей между атомом серы цистеинового остатка и α-углеродным атомом другой аминокислоты из группы RiPPs (рибосомно синтезируемые посттрансляционно модифицированные пептиды); (4) кластер генов, кодирующих биосинтез стрептида также из группы RiPPs, который представляет собой макроциклический пептид, образующийся в результате внутримолекулярной сшивки Lys-Trp с участием фермента (KxxxW cyclic peptide radical SAM maturase, kwcM) из семейства rSAM (radical SAM enzymes), катализирующих радикальные реакции с участием S-аденозилметионина (SAM). Наличие в геномах ST16t и ST159 кластеров бактериоцинов свидетельствует о потенциальных противомикробных свойствах штаммов, но в дальнейшем необходимы эксперименты in vitro для демонстрации подобной активности.

Углеводный профиль и гены углеводного метаболизма. Углеводный обмен способствует колонизации лактобактерий в пищеварительном тракте организма хозяина, что является важным пробиотическим фактором. Предполагается, что утилизация глюкозы и лактозы является общей характеристикой изученных на сегодняшний день штаммов S. thermophilus, в то время как утилизация галактозы, рибозы, маннозы, мальтозы, мелибиозы, раффинозы и сахарозы имеет вариабельный профиль (Zhao et al., 2023). В нашем исследовании оба штамма S. thermophilus сбраживали глюкозу, лактозу, сахарозу и рибозу, и были не способны утилизировать остальные сахара, за исключением маннозы, которую Str16t утилизировал, в отличие от Str159 (рис. 3а).

 

Рис. 3. Биохимическая характеристика S. thermophilus 16t и 159: а – оценка способности к ферментации углеводов (зеленый цвет – реакция положительная, красный – отрицательная); б – ферментативный профиль

 

Детальный анализ кластеров геномов, отвечающих за утилизацию лактозы/галактозы, позволил выявить некоторые структурные особенности: (1) наличие генов, кодирующих ферменты Лелуар-пути — β-галактозидазу lacZ, оперон GalKTEM (галактокиназа galK, галактозо-1-фосфат уридилилитрансфераза galT, УДФ-глюкозо-4-эпимераза galE и галактозмутаротаза GalM), фосфоглюкомутазу PgmA; (2) отсутствие генов тагатоза-6-фосфатного пути (Т6Р). При этом в геномах Str16t и Str159 обнаружена специфичная для лактозы пермеаза LacS и отсутствуют специфичные транспортные системы для лактозы/галактозы, такие как фосфоенолпируватная транспортная система (PTS) LacEF и пермеаза GalP. Также обнаружены гены PTS для сахарозы (ScrA), маннозы (ManXYZ) и фруктозы (FruA/B). Интересно, что при наличии генов транспортных систем и ферментов для утилизации маннозы и фруктозы, фенотип обоих штаммов Str16t и Str159 Mal–, а у штамма Str159 также фенотип Man– (рис. 3а). Слабовыраженная сахаролитическая активность исследуемых штаммов S. thermophilus коррелирует с отсутствием активности соответствующих гликозид гидролаз (рис. 3б). Также не было установлено наличие в геномах S. thermophilus 16t и 159 известных специфичных для моно- и олигосахаридов ABC-транспортеров.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант РНФ 22-16-00108.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, где в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

K. V. Moiseenko

Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: fedorova_tv@mail.ru
Russian Federation, Moscow

O. A. Glazunova

Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: fedorova_tv@mail.ru
Russian Federation, Moscow

O. S. Savinova

Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: fedorova_tv@mail.ru
Russian Federation, Moscow

T. V. Fedorova

Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: fedorova_tv@mail.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files