Effect of Substituting of Amino Acids Residues Ser-911 and Thr-912 in the Plasma Membrane H+-ATPase of Yeast Saccharomyces cerevisiae on Its Activity and Distribution of Polyphosphates

Full Text

В дополнение к главному источнику энергии ‒ АТФ, клетки дрожжей (и многих других микро- и макроорганизмов) содержат неорганические полифосфаты (полиР), макроэргические соединения, которые когда-то считали просто хранилищем фосфата (Kulaev et al., 2004; Кулаев и соавт., 2005). Сейчас ясно, что функции этих ортофосфатных полимеров гораздо более сложны и разнообразны. Как написано в одной из работ ‒ “Inorganic polyphosphate is a ubiquitous polymer with myriad roles in cell and organismal physiology” (Sanchez et al., 2023). Не отвлекаясь на “мириад ролей”, заметим, что полиР являются одним из субстратов энергетического и фосфорного метаболизма (Kulaev et al., 2004) и, в частности, могут участвовать в фосфорилировании белков в бактериях (Кулаев и соавт., 2005) и дрожжах (Azevedo et al., 2015). Вместе с тем, АТФ остается главным компонентом энергетического метаболизма и донором фосфата при фосфорилировании; предполагается, что АТФ может использоваться для синтеза полиР (Hothorn et al., 2009) и наоборот (Beauvoit et al., 1989). Стоит отметить, однако, что взаимосвязь метаболизма АТФ и полиР и, в частности, влияние функционирования фермента, гидролизующего АТФ, на полифосфатный обмен остается малоизученным.

Таким жизненно важным ферментом дрожжевой клетки является H⁺-АТФаза плазматической мембраны (РМА1, Plasma Membrane ATPase), кодируемая геном РМА1, нокаут которого для клетки летален. Этот фермент является протонным насосом, который, гидролизуя АТФ, выбрасывает протоны из клетки, создавая электрохимический градиент ионов водорода (∆μ_H+), энергия которого используется для поддержания работы систем вторичного транспорта веществ. Фермент является мономером (могущим образовывать олигомеры, см. Heit et al., 2021) с молекулярной массой около 100 кД, распределенной между пятью каталитическими доменами, один из которых является регуляторным, расположенным в цитозольной С-концевой части фермента.

Функционирование АТФазы и ее регуляция тесно связаны с метаболизмом глюкозы и других ферментируемых сахаров: при их сбраживании фермент многократно активируется (Serrano, 1983; Syhrova, Kotyk, 1985; Окороков, Петров, 1986). При этом происходит множественное регуляторное фосфорилирование молекулы РМА1 АТФазы по остаткам Ser (в основном) и Thr (Chang, Slayman, 1991). Предполагается, что в процессе созревания фермента и его внутриклеточного трафика фосфорилируются около 10 таких аминокислотных остатков, роль которых установлена только для трех (Lecchi et al., 2005, 2007; Mazon et al., 2015). Показано, что глюкозо-зависимая регуляция активности H⁺-АТФазы дрожжей в основном связана с фосфорилированием тандемно расположенных в С-концевом регуляторном домене остатков Ser-911 и Thr-912 (Lecchi et al., 2005, 2007); вовлеченность остальных потенциальных фосфосайтов в этот процесс до конца не установлена. Таким образом, представлялось важным выяснить, влияют ли замены этих фосфорилируемых остатков на активность фермента и распределение полиР ‒ иными словами, есть ли связь между функционированием АТФазы и метаболизмом полиР.

Целью работы являлось изучение влияния точечных замен аминокислотных остатков Ser-911 и Thr-912 в С-концевом участке H⁺-АТФазы плазматической мембраны на ее активность и фосфорный метаболизм на примере полифосфатов.

Представленная работа является частью систематического исследования структурно-функциональной организации РМА1 АТФазы и энергетического обмена у дрожжей. Были использованы мутанты (табл. 1), несущие точечные замены полярных остатков Ser-911 и Thr-912 на нейтральный и нефосфорилируемый Ala (S911A и T912A) или на несущий заряд и потенциально фосфорилируемый Asp (S911D и T912D).

 

Таблица 1. Штаммы S. cerevisiae, использованные в работе

Штамм	Остаток в положении
	911	912
Дикий	Ser	Thr
S911A	Ala	Thr
S911D	Asp	Thr
S911D/T912A	Asp	Ala
T912D	Ser	Asp

 

В первом случае фосфосайты, имеющие фосфоэфирную связь, удаляли. В последнем случае замены позволяли частично имитировать свойства фосфорилируемых Ser-911 и Thr-912 ‒ при создании новых потенциальных фосфосайтов Asp-911 и Asp-912 происходила замена фосфоэфирной связи на ацилфосфатную. Мутант Т912А не обладал достаточной активностью, поэтому вместо него изучали двойной мутант S911D/T912A. Предметом исследования были ростовые характеристики мутантов, содержание АТФ, активность АТФазы и распределение полиР по фракциям.

У использованных в работе штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae NY13 (MATa ura3–52) ген PMA1 контролировался нативным промотором P_PMA1 (P_PMA1-PMA1) и был связан с селективным маркером URA3 (Guerra et al., 2007; Петров, 2010). Производные от него штаммы несли мутации в гене PMA1, кодирующие точечные замены аминокислотных остатков Ser-911 и Thr-912, как описано ранее (Lecchi et al., 2005). Штаммы были любезно предоставлены проф. К. И. Слейман (Йельский университет, США). Культуры дрожжей поддерживали на агаризованной среде, содержащей 2%-ную глюкозу, 6.7 г/л YNB (“Difco”, США), 20 мг/л гистидина. Штаммы дрожжей выращивали на качалке при 30°C на жидкой среде того же состава до середины логарифмической фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием, промывали водой и инкубировали с 2%-ной глюкозой. Затем клетки вновь осаждали и разрушали с использованием аппарата French Press и выделяли плазматические мембраны с использованием дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Препарат, обогащенный плазматическими мембранами, промывали 1 мМ буфером EGTA-Tris, pH 7.5, содержавшим ингибиторы протеаз (2 мкг/мл хемостатина и лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина и апротинина) и ресуспендировали в том же буфере. Выделенные плазматические мембраны использовали для определения уровня активности. Все препаративные процедуры выполняли при 0‒4°C.

Измерение активности АТФазы проводили в препаратах плазматичеких мембран при 30°C в 0.5 мл инкубационной смеси, содержащей 10 мМ MgSO₄, 5 мM Na₂ATФ, 50 мM MES-Tris pH 6.25, 5 мM KN₃, 5 мM фосфоенолпирувата и 50 мкг/мл пируват киназы в присутствии и в отсутствие 100 мкМ специфического ингибитора Na₃VO₄. Активность РМА1 АТФазы рассчитывали по ванадат-чувствительной части ортофосфата, образующегося при гидролизе АТФ.

Содержание АТФ определяли с помощью люциферин-люциферазного набора для определения АТФ (“Sigma-Aldrich”, США) согласно протоколу производителя на люминометре 1250 (“LKB”, Швеция).

Фракции полиР последовательно экстрагировали из клеток, выращенных до середины логарифмической фазы роста, как описано ранее (Вагабов и соавт., 2000). Были получены короткоцепочечная кислоторастворимая фракция полиР1 (≤25 остатков) и среднецепочечные солерастворимая полиР2 (45‒70 остатков) и щелочерастворимая полиР3 (90‒115 остатков); содержание полиР этих фракций определяли по лабильному фосфору (Вагабов и соавт., 2000).

Для определения ростовых параметров штаммы выращивали на жидкой среде YNB (см. выше) при 30°C с постоянным перемешиванием на качалке. Для определения скорости роста каждый час отбирали пробы и измеряли оптическую плотность при 600 нм (OD₆₀₀). Все мутации, кроме S911A, заметно, в 2‒3 раза, снижали скорость роста (рис. 1).

 

Рис. 1. Скорость роста, активности H⁺-АТФазы плазматической мембраны и содержание АТФ у штаммов S. cerevisiae S911A, S911D, S911D/T912A и T912D в% от данных родительского штамма. Представлены средние данные из 3‒6 экспериментов. 100% соответствовали: 0.17 ч^–1 (скорость роста), 7.65 мкмоль Р_i/мин/мг белка (АТФазная активность), 0.95 мкмоль АТФ/г сырого веса (содержание АТФ). Обозначения: 1 ‒ скорость роста, 2 ‒ АТФазная активность, 3 ‒ содержание АТФ

 

Напротив, в случае S911A скорость роста была даже немного выше, чем у дикого типа. Вместе с тем изменения OD₆₀₀ в стационарной фазе были не так значительны (не иллюстрируется). Эти данные позволяют предположить, что внесенные мутации могут заметно влиять на энергетический/фосфорный обмен и на клеточный метаболизм в целом, однако клетка имеет механизмы, позволяющие уменьшить или даже нейтрализовать негативное влияние этих замен, что косвенно подтверждает отсутствие снижения АТФазной активности у изучаемых мутантов (см. ниже).

Чтобы оценить энергетическое состояние клетки, в тех же штаммах измеряли содержание АТФ in situ. Как видно из рис. 1, в двух случаях содержание АТФ не изменялось (S911A и T912D), зато в двух других случаях содержание АТФ уменьшалось в 2‒2.5 раза (S911D и S911D/T912A). Сама активность РМА1 АТФазы при этом не влияла на уровень АТФ.

Различие в действии мутаций на содержание АТФ может свидетельствовать о необратимом фосфорилировании остатка Asp-911 в мутантах S911D и S911D/T912A. В случае Asp-912 в мутанте Т912D замена не влияет на содержание АТФ, а сам замененный остаток, видимо, фосфорилируется обратимо ‒ так же, как и присутствующий в ферменте остаток Ser-911. Можно также предположить, что аспартильная замена Asp-911 при этом нарушает сопряжение гидролиза АТФ и транспорта ионов Н⁺, вызывая изменение стехиометрии этого процесса и нарушая формирование ∆μ_H+, как это наблюдалось при замене аминокислотного остатка Glu-803 в трансмембранном сегменте М8 (Petrov et al., 2000; Guerra et al., 2007). Так, замены этого остатка, являющегося частью сайта транспорта ионов Н⁺, вызывали разнообразные и масштабные изменения в структурно-функциональной организации фермента: от блокирования биогенеза (E803S, E803L) или значительного подавления экспрессирования (E803D, E803C) до потери АТФ-гидролазной активности экспрессированного на уровне дикого типа фермента (E803R), и от сверхсопряжения (E803Q) до почти полного рассопряжения (E803N, E803A) этого протонного насоса (Petrov et al., 2000; Guerra et al., 2007).

Для того чтобы оценить, как функционирует РМА1 АТФаза, имеющая замены изучаемых остатков, in vitro была измерена ферментативная активность препаратов плазматических мембран, выделенных из различных штаммов после инкубации с глюкозой. Это предполагает, что фермент должен находиться в активированном состоянии. Удивительно, что, несмотря на разницу в содержании АТФ и/или скорости роста, активность АТФазы мутантных штаммов S911D, T912D и S911D/T912A незначительно отличалась от отмеченной у дикого типа; в случае S911A наблюдалось даже увеличение на 42% (рис. 1). Предполагается, что АТФаза штамма S911D является конститутивно активированной, в то время как S911A обладает повышенной активностью, но сохраняет способность дальнейшей активации (Lecchi et al., 2005, 2007). Вероятно, замена Ser-911→Asp приводит к неспособности остатков Thr-912 и/или Asp-911 фосфорилироваться обратимо, в то время как замена Ser-911→Ala лишь сдвигает равновесие в процессе фосфорилирования Thr-912 и/или других потенциально фосфорилируемых остатков, в том числе пока неизвестных.

Более глубокое понимание происходящих процессов пришло из экспериментов по определению различных фракций полиР (табл. 2, рис. 2).

 

Таблица 2. Содержание полиР в различных штаммах S. cerevisiae (мкмоль Р_i/г сырого веса)

Штамм	ПолиР1	ПолиР2	ПолиР3
Дикий	15.8	9.8	7.4
S911A	21.6	6.9	11.5
S911D	7.6	13.7	10.3
S911D/T912A	9.6	13.2	12.2
T912D	8.7	11.1	9.5

Примечание. Представлены средние данные из 3‒8 экспериментов.

 

Рис. 2. Влияние мутаций S911A, S911D, S911D/T912A и T912D на распределение фракций полифосфатов в % от данных родительского штамма. Представлены средние данные из 3‒8 экспериментов. 100% соответствовали: 15.8 (полиР1), 9.8 (полиР2), 7.4 (полиР3) мкмоль Р_i/г сырого веса. Обозначения: 1 ‒ полиР1; 2 ‒ полиР2; 3 ‒ полиР3

 

Ясно выраженное влияние мутаций в молекуле РМА1 АТФазы на фосфорный/энергетический метаболизм наблюдалось при распределении полиР по фракциям у различных штаммов. Фракции полифосфатов различаются по способу экстракции и длине цепи этих ортофосфорных полимеров (Kulaev et al., 2004). Существует также приблизительная внутриклеточная локализация этих фракций. Так, полиР1 ассоциируется с цитозолем и в меньшей степени с вакуолями (30%); считается, что эту фракцию можно найти повсеместно. Предполагается, что полиР2 частично связана с ядром, и это кажется вероятным в связи с регуляцией полифосфатами транскрипции генов (Sanchez et al., 2023). ПолиР3, как и полиР1, ассоциируется с цитозолем и вакуолями, но это уже более высокомолекулярное соединение по сравнению с полиР1. Заметное перераспределение полиР по фракциям происходило у всех штаммов. В случае полиР1 наблюдалось увеличение этой фракции на 40% у S911A, лишенного фосфосайта Ser-911, и ее уменьшение на 40‒50% в остальных случаях, где присутствовали Ser-911 или замещающий его Asp-911. В случае полиР2 происходило уменьшение доли этой фракции на треть при замене Ser-911 на остаток Ala и увеличение на 15‒40% в остальных случаях, где присутствовала замена на Asp.

Если сравнивать содержание полиР1 у штамма с заменой S911A со штаммами, где присутствовала аспартильная замена (S911D или T912D), картина была более драматичной: содержание полиР1 в клетках штамма S911A превышало обнаруженное у штаммов с заменами на Asp в 2.2‒2.9 раза, в то время как содержание фракции полиР2 у тех же штаммов уменьшалось в 1.6‒2.0 раза (табл. 2, рис. 2). Только в случае полиР3 происходило единообразное увеличение этой фракции на 30‒65% у всех штаммов. Как кажется, чем выше молекулярная масса, тем менее метаболически лабильными должны быть фракции полиР. В действительности, однако, установлено, что наиболее меняющейся фракцией является полиР3 (Kulakovskaya et al., 2004). В случае же, рассматриваемом нами, наиболее выраженные (и имеющие противоположную направленность) изменения по фракциям вследствие мутаций происходят у фракций полиР1 и полиР2 (табл. 2, рис. 2). В целом, перераспределение фракций полиР у различных штаммов может указывать на рассогласованность процесса последовательного фосфорилирования сайтов Ser-911 и Thr-912 из-за их удаления или замены в мутантах, что приводило к нарушению связи между гидролизом АТФ и синтезом полиР. Таким образом, можно думать, что полиР являются своеобразным маркером энергетического состояния дрожжевой клетки. О подобной связи между метаболизмом АТФ и полиР сообщалось ранее (Hothorn et al., 2009). Кроме этого, полиР могут регулировать транскрипцию генов (Sanchez et al., 2023), что может сказываться на функционировании АТФазы и других ферментов.

Различие в действии замен S911А, S911D, T912A (S911D/T912A) и T912D между собой и с диким типом подтверждает, что находящиеся в этих позициях остатки Ser и Thr или замещающий эти остатки Asp могут фосфорилироваться. Вероятно, фосфорилирование молекулы АТФазы происходит за счет пула АТФ, который, в свою очередь, связан с пулом фосфатов и полифосфатов; в случае S911D и S911D/T912A фосфорилирование может являться необратимым для остатка Asp-911, на что указывает двукратное уменьшение содержания АТФ в этих штаммах (рис. 1). При этом очевидно, что хотя фосфорилироваться могут и другие остатки Ser и Thr, в частности, находящиеся в N-концевом участке фермента (Lecchi et al., 2007) или в экстрацитозольной части С-концевого участка (Петров, 2023), главными фосфосайтами являются именно Ser-911 и Thr-912, замены которых вызывают каскад последующих реакций как в функционировании РМА1 АТФазы, так и в метаболизме полиР. При удалении этих фосфосайтов или при их замене на ацилфосфатный тип происходит рассогласованность функционирования РМА1 АТФазы и нарушение распределения полиР. Следует еще раз подчеркнуть, что распределение полиР в случаях удаления фосфосайта или его замены на ацилфосфатный тип противоположно для полиР1 и полиР2. Дальнейшие исследования влияния замен фосфорилируемых остатков помогут прояснить феноменологию происходящих процессов и выявить детали механизма регуляции энергетического/фосфорного метаболизма дрожжей и функционирования РМА1 Н⁺-АТФазы.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались бы люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. A. Tomashevsky

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: vpetrov07@gmail.com
Russian Federation, Pushchino

V. V. Petrov

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: vpetrov07@gmail.com
Russian Federation, Pushchino

References

Supplementary files