Genetic Identification of Microsymbionts of the Legume  Hedysarum arcticum  B. Fedtsch, Growing on Samoylovsky Island in the Lena River Delta (Arctic Zone of Yakutia)

D. S. Karlov; Карлов Д. C.; P. V. Guro; Гуро П. В.; I. G. Kuznetsova; Кузнецова И. Г.; А. L. Sazanova; Сазанова А. Л.; I. A. Alekhina; Алехина И. А.; N. Yu. Tikhomirova; Тихомирова Н. Ю.; N. N. Lashchinsky; Лащинский Н. Н.; А. А. Belimov; Белимов А. А.; V. I. Safronova; Сафронова В. И.

doi:10.31857/S0026365624030155

Genetic Identification of Microsymbionts of the Legume Hedysarum arcticum B. Fedtsch, Growing on Samoylovsky Island in the Lena River Delta (Arctic Zone of Yakutia)

Authors: Karlov D.S.¹, Guro P.V.¹, Kuznetsova I.G.¹, Sazanova А.L.¹, Alekhina I.A.², Tikhomirova N.Y.¹, Lashchinsky N.N.³, Belimov А.А.¹, Safronova V.I.¹
Affiliations:
1. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology
2. Arctic and Antarctic Research Institute
3. Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 93, No 3 (2024)
Pages: 368-373
Section: SHORT COMMUNICATIONS
URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/265076
DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624030155
ID: 265076

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Bacterial strains isolated from root nodules of the legume plant Hedysarum arcticum B. Fedtsch growing on Samoylovsky Island in the Lena River delta (Arctic zone of Yakutia) were assigned to the genera Rhizobium (family Rhizobiaceae) and Mesorhizobium (Phyllobacteriaceae) of the order Hyphomicrobiales (class Alphaproteobacteria) according to the rrs gene sequencing data. According to phylogenetic analysis of concatemers of the atpD, dnaK, gyrB, and rpoB genes, the strains belonged to the species Rhizobium giardinii and Mesorhizobium norvegicum. The strains were shown to be facultative psychrotrophs growing at 5 and 28ºC. These microsymbionts are promising for further study of their symbiotic efficiency regarding other forage legume species, with an aim to establish highly productive agrophytocenoses in the Far North.

Keywords

Arctic Yakutia, rhizobial bacteria, northern agrophytocenoses, Hedysarum arcticum B. Fedtsch

Full Text

Формирование новых высокопродуктивных пастбищных и сенокосных агроценозов как кормовой базы для сельскохозяйственных животных является одной из важнейших стратегических задач освоения и устойчивого развития арктических территорий России (Стратегия развития …, 2020). Клубеньковые бактерии (ризобии), вступая в симбиотические взаимоотношения с бобовыми растениями, способствуют фиксации атмосферного азота и обеспечивают растения доступными азотистыми соединениями, тем самым увеличивая продуктивность фито- и агроценозов (Andrews, Andrews, 2017). Создание многолетних агроценозов в экстремальных условиях Крайнего Севера эффективно только при использовании местных генотипов растений и бактериальных штаммов (Котелина и соавт., 1998). Многолетнее бобовое растение Копеечник арктический (Hedysarum arcticum B. Fedtsch.) является перспективным для внедрения в качестве компонента устойчивого бобово-злакового агрофитоценоза в арктических регионах России, благодаря хорошим адаптационным способностям к суровым почвенно-климатическим условиям. В частности, показано, что естественные фитоценозы с доминированием H. arcticum обеспечивают высокую биологическую продуктивность в условиях Воркутинской тундры по сравнению с фитоценозами, основу которых составляют другие местные виды бобовых (Экологические основы …, 1991). В то же время информация о микросимбионтах H. arcticum, судя по литературным данным, отсутствует.

Цель работы – выделение микросимбионтов из корневых клубеньков дикорастущего бобового растения H. arcticum, произрастающего на о. Самойловский в дельте реки Лена (Арктическая зона Якутии), изучение их генетического разнообразия и определение видовой принадлежности.

Бактериальные штаммы были выделены из клубеньков H. arcticum в условиях стерильного микровегетационного опыта. Для получения клубеньков были использованы семена H. arcticum и надмерзлотный почвенный образец сезонно-талого слоя (СТС), отобранный из глубины 57 см в районе произрастания бобового растения. Поверхность семян стерилизовали концентрированной H₂SO₄ в течение 5 мин, промывали стерильной водой и проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 4°C в темноте в течение 3 сут. Проростки помещали в стерильные стеклянные сосуды объемом 50 мл (по два на сосуд) с 3 г стерильного вермикулита в каждом. В сосуды добавляли по 6 мл питательного раствора (г/л): K₂HPO₄ – 1.0, KH₂PO₄ – 0.25, MgSO₄ – 1.0, Ca₃(PO₄)₂ – 0.2, FeSO₄ – 0.02, H₃BO₃ – 0.005, (NH₄)₂MoO₄ – 0.005, ZnSO₄ · 7 H₂O – 0.005, MnSO₄ – 0.002 (Novikova, Safronova, 1992). Проростки инокулировали почвенной вытяжкой из образца СТС. Неинокулированные растения были использованы в качестве отрицательного контроля. Микровегетационный опыт проводился в двукратной повторности. Растения выращивали в фитотроне при 18–22°C в течение 30 дней при относительной влажности 50% и 4-х уровневом режиме освещения/температуры: ночь (18°C, 8 ч), утро (200 мкмоль квантов·м^–2·с^–1, 20°C, 2 ч), день (400 мкмоль квантов м^–2 с^–1, 23°C, 12 ч), вечер (200 мкмоль квантов м^–2 с^–1, 20°C, 2 ч). Освещение осуществляли лампами L36W/77 FLUORA (“Osram”, Германия). Ризобиальные штаммы выделяли из гомогенезированных клубеньков по стандартной методике с использованием агаризованной маннито-дрожжевой питательной среды YMA при 28°C (Novikova, Safronova, 1992) после стерилизации клубеньков в течение 1 мин в 96%-ном этаноле.

Для получения чистых бактериальных культур видимые колонии отбирали и последовательно клонировали 2 раза на чашках Петри с плотной средой YMA методом истощающего штриха. Выделение гДНК из чистых культур осуществляли с помощью наборов DNeasy Blood&Tissue kit (“QIAGEN”, Германия). Первичная идентификация штаммов была проведена методом ПЦР с последующим секвенированием последовательностей маркерного гена 16S рРНК. Для амплификации была использована пара праймеров fD1 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и rD1 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'. Уточнение видовой принадлежности полученных штаммов было проведено с помощью амплификации и секвенирования последовательностей генов atpD, dnaK, gyrB и rpoB с использованием праймеров и ПЦР-протоколов, описанных ранее (Weir et al., 2004; Martens et al., 2007; Safronova et al., 2017). Поиски близкородственных типовых штаммов и филогенетический анализ конкатемеров генов rpoB, gyrB, atpD и dnaK проводили с использованием программы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Конструирование филогенетических деревьев осуществляли в программе MEGA X v. 10.2 (Kumar et al., 2018) с помощью метода наибольшего правдоподобия (Maximum Likelihood), в качестве показателя устойчивости использовали метод Bootstrap для 500 репликаций. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в GenBank под номерами OR673297, OR673298, OR689846-OR689848, OR777658-OR777661.

Всего из клубеньков H. arcticum было выделено два штамма, сформировавших колонии на 3 сут. Помимо роста при оптимальной температуре 28°С, штаммы показали способность к росту при 5°C с образованием колоний на 7–9 сут, что позволило рассматривать их как факультативных психротрофов. По результатам анализа rrs-гена штаммы 20/1–1 и 20/1–4 были отнесены, соответственно, к родам Rhizobium (сем. Rhizobiaceae) и Mesorhizobium (сем. Phyllobacteriaceae) порядка Hyphomicrobiales класса Alphaproteobacteria. Известно, что многие представители родов Rhizobium и Mesorhizobium способны вступать в симбиотические взаимоотношения с широким спектром видов дикорастущих пастбищных бобовых растений родов Вика (Vicia), Чина (Lathyrus), Астрагал (Astragalus), Остролодка (Oxytropis) и Копеечник (Hedysarum) (Andrews, Andrews, 2017; Helene et. al., 2019).

Штамм 20/1–1 показал близкое сходство rrs-гена (99.0, 99.22 и 99.62%) с тремя типовыми штаммами – Rhizobium giardinii H152^T, Pararhizobium polonicum F5.1^T и R. herbae CCBAU83011^T соответственно.

Штамм R. giardinii H152^T был выделен из клубенька Фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris), произрастающей во Франции (Amarger et al., 1997). Была показана способность штамма R. giardinii H152^T формировать неэффективные клубеньки на корнях растения-хозяина, а также на культурных бобовых Макроптилиуме темно-пурпурном (Macroptilium atropurpureum (Moc. & Sessé ex DC.) Urb.) и Лейцене белоголовой (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit). Штамм P. polonicum F5.1^T был выделен из корончатого галла Вишни птичьей (Prunus avium (L.) L.), произрастающей в Польше, тогда как штамм R. herbae CCBAU83011^T – из клубенька Астрагала перепончатого (Astragalus membranaceus (Fisch. ex Link) Bunge), произрастающего в умеренных регионах Китая (Zhao et al., 2008).

На rrs-дереве штамм 20/1–1 формировал со штаммами R. giardinii H152^T, P. polonicum F5.1^T и R. herbae CCBAU83011^T кластер со 100%-ным уровнем поддержки, тогда как на дереве конкатемеров генов atpD, dnaK и rpoB он группировался только со штаммом R. giardinii H152^T с высоким (84%-ным) уровнем поддержки (рис. 1 и 2). Таким образом, штамм 20/1–1 был отнесен к виду R. giardinii.

Рис. 1. Филогенетическое дерево представителей рода Rhizobium, построенное c использованием последовательностей гена 16S рРНК. Цифры (%) в узлах ветвления – достоверность по bootstrap-анализу 500 альтернативных деревьев

Рис. 2. Филогенетическое дерево представителей рода Rhizobium, построенное на основе конкатемеров генов rpoB, atpD и dnaK. Цифры (%) в узлах ветвления – достоверность по bootstrap-анализу 500 альтернативных деревьев

Штамм 20/1–4 имел 100%-е сходство гена rrs со штаммами Mesorhizobium norvegicum 10.2.2^T и M. loti NZP2213^T, выделенными из корневых клубеньков кормового бобового растения Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus L.), соответственно, в Норвегии (Kabdullayeva et al., 2020) и Новой Зеландии (Jarvis et al., 1982). Показано, что M. loti NZP2213^Tспособен формировать эффективный симбиоз c разными видами рода Lotus. На rrs-дереве штамм 20/1–4 формировал кластер со штаммами M. qingshengii CCBAU33460^T, M. norvegicum 10.2.2^T и M. loti NZP2213^T с 76% уровнем поддержки, тогда как на дереве, построенном на основе конкатемеров генов atpD, dnaK, rpoB и gyrB, он группировался на уровне 99%-ной поддержки со штаммами M. norvegicum 10.2.2^T и M. loti NZP2213^T (рис. 3 и 4).

Рис. 3. Филогенетическое дерево представителей рода Mesorhizobium, построенное с использованием последовательностей гена 16S рРНК. Цифры (%) в узлах ветвления – достоверность по bootstrap-анализу 500 альтернативных деревьев

Рис. 4. Филогенетическое дерево представителей рода Mesorhizobium, построенное на основе конкатемеров генов rpoB, gyrB, atpD и dnaK. Цифры (%) в узлах ветвления – достоверность по bootstrap-анализу 500 альтернативных деревьев

Для определения его видовой принадлежности было дополнительно проведено сравнение сходства конкатемеров генов atpD, dnaK, rpoB и gyrB между изолятом 20/1–4 и штаммами M. loti NZP2213^T и M. norvegicum 10.2.2^T. Показано, что штамм 20/1–4 наиболее близок (99.93%-е сходство) к штамму M. norvegicum 10.2.2^T, тогда как сходство с M. loti NZP2213 составило 98.15% (табл. 1). На основании полученных результатов штамм 20/1–4 был отнесен к виду M. norvegicum.

Таблица 1. Сходство (%) штаммов 20/1–4, Mesorhizobium loti LMG 6125^T и M. norvegicum 10.2.2^T, оцененное путем сравнения конкатемеров генов atpD, dnaK, rpoB и gyrB

Штаммы	20/1–4	M. loti LMG 6125^T	M. norvegicum 10.2.2^T
20/1–4	100	98.15	99.93
M. loti LMG 6125^T	98.15	100	97.78
M. norvegicum 10.2.2^T	99.93	97.78	100

Ранее авторами в условиях стерильного микровегетационного опыта была показана способность штамма 20/1–4 формировать азотфиксирующий и неэффективный симбиоз с дикорастущими арктическими бобовыми Oxytropis adamsiana (Trautv.) Jurtzev и Astragalus frigidus (L.) A. Gray соответственно, тогда как способность штамма 20/1–1 образовывать клубеньки на корнях этих же видов бобовых выявлена не была (неопубликованные данные).

Таким образом, из клубеньков бобового растения H. arcticum, произрастающего на о. Самойловский в Арктической зоне Якутии, выделены два факультативно психротрофных штамма, отнесенные к родам Rhizobium и Mesorhizobium пор. Hyphomicrobiales (класс Alphaproteobacteria). При помощи анализа конкатемеров генов atpD, dnaK, rpoB и gyrB, а также построения на их основе филогенетических деревьев, штаммы 20/1–1 и 20/1–4 идентифицированы как R. giardinii и M. norvegicum соответственно. Они перспективны для дальнейшего изучения симбиотических взаимоотношений с разными видами кормовых бобовых растений в условиях микровегетационных опытов, а также для поисков целевых хозяйственно-ценных генов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследования проведены при финансовой поддержке РНФ, проект № 20-76-10042-П.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Искренне благодарим О. Д. Большиянову, инженера отдела географии полярных стран Арктического и Антарктического научно-исследовательского института (С.- Петербург), за любезно предоставленные семена H. arcticum и почвенные образцы. Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология” ФГБНУ ВНИИСХМ.