Email this article Bioinformatic and functional analysis of the pSID siderophore biosynthesis plasmid of Rhodococcus pyridinivorans 5Ap
- Authors: Mandryk М.I.1, Vysotskaya А.А.1, Yahorava Y.V.1, Surzhyk D.U.1, Larchenka А.Y.1, Vasylenko S.L.1
-
Affiliations:
- Belarusian State University
- Issue: Vol 93, No 4 (2024)
- Pages: 414-424
- Section: EXPERIMENTAL ARTICLES
- URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/272092
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624040034
- ID: 272092
Cite item
Full Text
Abstract
Complete genome sequencing of R. pyridinivorans strain 5Ар revealed the pSID plasmid (CP063453.1) 250428 bp in size. The gene responsible for replication of this plasmid is, most probably, dnaB. The genes which may be involved in the replication (dnaB, ssb) and plasmid separation after replication (parA) showed the highest similarity to the determinants located on large (224‒343 kb) plasmids of rhodococci: unnamed1 of R. pyridinivorans YF3, unnamed1 of R. rhodochrous LH-B3, pRJH1 of R. pyridinivorans YC-JH2, pRDE01 of Rhodococcus sp. RDE2, and pRho-VOC14-C342 of R. opacus VOC-14. The pSID plasmid was found to contain two loci responsible for the synthesis of secondary metabolites, one of them determining the synthesis of a polyketide compound (similar sequences have been revealed on plasmids of other rhodococci) and the other one probably determines the synthesis of a siderophore: the genes for biosynthesis of this compound (sid1–5) exhibited the highest similarity (not exceeding 75%) with the sequences from Streptomyces vilmorinianum YP1 (CP040244.1), S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1), Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1), and some other streptomycetes, while showing no similarity to the known siderophore biosynthesis genes of rhodococci. The locus of the pSID plasmid responsible for the siderophore synthesis had a unique organization, since transcription of the sid5 (iucC) gene occurs in the opposite direction, while in other bacteria it belongs to an operon and is located at one of its termini. Inactivation of the sid1 gene was found to result in decreased antagonistic activity of R. pyridinivorans 5Ар against plant-pathogenic bacteria P. carotovorum 2.18, lower resistance to iron and cadmium ions and arsenate, as well as in emergence of phytotoxic properties against radish, while wild-type bacteria exhibit plant growth-promoting activity.
Full Text
Бактерии рода Rhodococcus широко известны как деструкторы органических соединений различной природы и в основном применяются в составе биопрепаратов для биоремедиации сред, загрязненных углеводородами. Такие среды характеризуются изменением физико-химических свойств почвы, нарушением состава микробиоценоза, а также растительного покрова. Результатом же биоремедиации должно стать не только разложение загрязнителя, но и восстановление всех характеристик почвы. Соответственно, наиболее перспективными будут те бактерии-деструкторы, которые не только разрушают загрязнители, но и способствуют росту растений, т.е. обладающие рост-стимулирующими и защитными свойствами. В этом плане родококки являются привлекательными объектами природоохранных биотехнологий, т.к. помимо углеводородов, способны разлагать токсины, в том числе микотоксины, продуцируемые фитопатогенными грибами (Kriszt et al. 2012; Cserháti et al., 2013; Ji et al., 2016), а также продуцируют ряд соединений с рост-стимулирующей активностью по отношению к растениям и антагонистической активностью по отношению к разным группам микроорганизмов, в том числе фитопатогенным (Kundu et al., 2016; Stevens et al., 2017; Kuhl et al., 2019; Iminova et al., 2022).
Одной из важных групп соединений с антагонистической и стимулирующей рост растений активностью являются сидерофоры (Глик, Пастернак, 2002). Родококки, как и другие бактерии, продуцируют в среду различные виды сидерофоров для эффективной добычи ионов железа, входящих в состав активных центров многочисленных оксигеназ ‒ ферментов, обеспечивающих окисление широкого спектра углеводородов. На этом участие сидерофоров в биодеградативной активности не заканчивается. Показано, что они способны индуцировать возникновение в средах активных форм кислорода, которые, в свою очередь, обеспечивают окисление органических загрязнителей (Roskovа et al., 2022). Сидерофоры, наряду с биосурфактантами, обеспечивают бактериям устойчивость к тяжелым металлам и металлоидам за счет неспецифического связывания с некоторыми из них (Presentato et al., 2020). Такое неспецифическое связывание играет важную роль при фитобиоремедиации загрязненных тяжелыми металлами сред, поскольку делает ионы тяжелых металлов более доступными для поглощения растениями (Saha et al., 2013). Кроме того, сидерофоры являются факторами антагонизма, обеспечивая своим продуцентам селективное преимущество в средах с дефицитом железа (Глик, Пастернак, 2002; Saha et al., 2013).
Положительное действие бактерий – продуцентов сидерофоров на растения обеспечивается за счет нескольких механизмов. Во-первых, бактериальные сидерофоры более активны по сравнению с грибными, поэтому бактерии выигрывают в конкурентной борьбе с фитопатогенными грибами в ризосфере растения (Глик, Пастернак, 2002). Во-вторых, показано, что сидерофоры способствуют выработке бактериальных ауксинов в ризосфере растения в условиях загрязнения тяжелыми металлами (Dimkpa et al., 2008). В-третьих, установлено, что сидерофоры обладают элиситорным воздействием и стимулируют иммунный ответ растения (Aznar et al., 2014).
Таким образом, бактерии рода Rhodococcus можно рассматривать не только как деструкторов опасных поллютантов, перспективных для использования при биоремедиации и фитобиоремедиации загрязненных сред, но и как перспективных агентов для защиты растений и продуцентов ценных биологически активных метаболитов.
Способность продуцировать биологически активные соединения, так же как и способность утилизировать различные трудно разлагаемые соединения, часто определяется мобильными генетическими элементами, в частности, плазмидами.
Целью данного исследования был анализ вклада плазмиды pSID в устойчивость, антагонистическую и стимулирующую рост растений активность бактерий Rhodococcus pyridinivorans 5Ap – деструкторов углеводородов нефти.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В работе использовали бактерии R. pyridinivorans 5Ap (депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов под номером БИМ В-939 Г). Для клонирования фрагмента гена биосинтеза сидерофоров использовали суицидальный вектор pK18mob (Kmr, LacZ') (Schäfer et al., 1994). Для отбора рекомбинантных молекул ДНК и последующего их введения в клетки родококков использовали штаммы E. coli XL1-Blue (Bullock et al., 1987) и BW19851 (Metcaff et al., 1994). В качестве тест-культуры для проверки антагонистической активности использовали бактерии Pectobacterium carotovorum 2.18 (депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов под номером БИМ В-1640). Для определения стимулирующих рост растений свойств использовали семена редиса красного Raphanus sativus L. var. sativus сорта Гранат. Анализируемая нуклеотидная последовательность плазмиды pSID бактерий R. pyridinivorans 5Ap депонирована в GenBank NCBI под номером CP063453.1.
Среды и растворы. Для культивирования бактерий использовали пептонно-дрожжевую среду (жидкую – ПДБ: пептон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, NaCl – 8 г/л, рН 7.0–7.2; плотную ‒ ПДА – добавляли агар бактериологический – 7 или 15 г/л); среду Мейнелла с 2% мелаcсой (Мейнелл, Мейнелл, 1967), плотную минеральную среду М9 (Миллер, 1976) с добавлением глюкозы (0.2%), сукцината (0.2%) или нафталина (пары) в качестве единственного источника углерода. Для проращивания семян растений использовали 1% водный агар (агар бактериологический – 10 г/л).
Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) тяжелых металлов и металлоидов. Исследуемые бактерии культивировали в среде ПДБ с аэрацией (140 об./мин) в течение 24 ч при 28°С. Полученной культурой (20 мкл) инокулировали среду ПДБ (3 мл) с различными концентрациями тяжелых металлов и металлоидов, вносимых в виде солей: NiCl2 (0.1; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 2; 3; 4; 5 ммоль/л), ZnSO4 (0.5; 0.6; 0.75; 0.9; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 ммоль/л), CoCl2 (0.5; 0.75; 1; 1.25; 1.5 ммоль/л), CuCl2 (0.1; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 1.6; 1.7; 1.8; 1.9; 2; 4; 6; 8; 10 ммоль/л), CdCl2 (0.1; 0.2; 0.5; 0.75; 1; 1.5 ммоль/л), Hg(NO3)2 (0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.5; 1 ммоль/л), Pb(NO3)2 (0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 ммоль/л), FeCl3 (0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 4; 5 ммоль/л), Na3AsO3 (0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 ммоль/л). Инкубировали с аэрацией (140 об./мин) в течение 48 ч при 28°С. Визуально оценивали рост культур и производили измерение ОП600 (положительный результат регистрировали при достижении значения ОП600 0.2). За МИК принимали концентрацию, следующую за той, при которой наблюдался рост.
Антагонистическую активность оценивали с помощью метода отсроченного антагонизма. На поверхность агаризованной среды (ПДА, М9 с глюкозой (0.2%), М9 с сукцинатом (0.2%) или М9 с нафталином (пары)) в чашке Петри медальонами засевали штаммы исследуемых бактерий, культивировали при температуре 28°С в течение 48 ч. Ночную культуру фитопатогенных бактерий Pectobacterium carotovorum 2.18 выращивали с аэрацией при 28°С. В 5 мл 0.7% ПДА добавляли 100 мкл культуры фитопатогенных бактерий. Далее наслаивали 0.7% ПДА на чашку Петри с медальонами и инкубировали при температуре 28°С. Размер зоны задержки роста тест-штамма вокруг медальонов замеряли через 24 ч культивирования от края медальона до начала роста тест-культуры.
Стимулирующую рост растений активность оценивали на растениях редиса красного сорта Гранат. Ночную культуру исследуемых штаммов выращивали в среде Мейнелла при температуре 28°C в течение 24 или 48 ч. Семена редиса предварительно замачивали в течение 30 мин в культуральной жидкости каждого штамма, среде Мейнелла и воде (контроли). Помещали семена на поверхность 1% водного агара, инкубировали при комнатной температуре. Через 7 сут определяли морфометрические показатели (длина гипокотиля, длина корня).
Трансформацию E. coli осуществляли по методике, описанной в руководстве (Маниатис и соавт., 1984).
Тотальную ДНК бактерий выделяли саркозиловым методом (te Riele et al., 1986).
Выделение плазмидной ДНК. Для выделения плазмидной ДНК использовали набор реактивов Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit (“Jena Bioscience”, Германия).
ПЦР проводили с использованием набора реактивов производства Thermoscientific (EC), ОДО “Праймтех” (РБ) и праймеров производства ОДО “Праймтех” (РБ). Реакцию проводили в объеме 25–50 мкл. Реакционная смесь содержала 1× буфер с ионами Mg2+ для соответствующей ДНК-полимеразы, смесь дНТФ (0.2 ммоль/л каждого нуклеотида), 0.5 мкмоль/л каждого праймера, 1.25–2.5 ед. ДНК-полимеразы (Taq или Pfu).
Амплификацию фрагмента плазмидного гена sid проводили при режимах: 95°С – 3 мин (1 цикл); 95°С – 1 мин, 57°С – 1 мин, 72°С – 1 мин (30 циклов); 72°С – 5 мин (1 цикл). Использовали праймеры Sid-fw (AGGAGCAGGCCACCACTTAC) и Sid-rev (AGGAGGTTAGAGAGCGATCC), размер получаемого фрагмента составил 562 п.н.
ПЦР-анализ результатов инсерционного мутагенеза осуществляли с использованием пары праймеров M13 Forward (CACGACGTTGTAAAACGAC) или M13 Reverse (GGATAACAATTTCACACAGG) и Sid-fw и режимов: 94°С – 5 мин; 94°С – 30 с, 48°С – 1 мин, 72°С – 1 мин (5 циклов); 94°С – 30 с, 50°С – 1 мин, 72°С – 1 мин (25 циклов); 72°С – 10 мин.
Инактивация гена sid1 в опероне биосинтеза сидерофоров была осуществлена с помощью направленного инсерционного мутагенеза (Чернявская, 2016). Полученные на среде ПДА с рифампицином (100 мкг/мл) и канамицином (25 мкг/мкл) клоны рассевали на среде М9 с канамицином (25 мкг/мкл) и нафталином (пары) в качестве единственного источника углерода.
Инструменты биоинформационного анализа. Для анализа нуклеотидных последовательностей и построения генетической карты использовали программу SnapGene Viewer 5.0.8 и онлайн ресурс https://proksee.ca/ (Grant et al., 2023). Поиск фрагментов, которые были приобретены в результате горизонтального переноса, производили с помощью инструмента Alien Hunter (Vernikos, Parkhill, 2006). Для идентификации кластеров генов биосинтеза вторичных метаболитов использовали онлайн ресурс antiSMASH, версии 7.0.1 (https://antismash.secondarymetabolites. org) (Blin et al., 2023). Уровень синтении генов биосинтеза сидерофора оценивали с помощью ресурса SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/synttax/) (Oberto, 2013).
Статистический анализ проводили с использованием пакета статистики MS Excel 2010.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Плазмида pSID размером 250428 п.н. (рис. 1) была выявлена в клетках бактерий R. pyridinivorans 5Ар в результате секвенирования полной последовательности генома (Мандрик и соавт., 2024).
Рис. 1. Генетическая карта плазмиды Psid. INP – обозначение белок-кодирующих последовательностей, HGT Region – участок, который, предположительно, был привнесен в результате горизонтального переноса.
При аннотации плазмиды pSID не было выявлено генов rep, кодирующих специфические белки инициации репликации. В целом, далеко не все плазмиды обладают данными генами (в частности, плазмиды тета-типа репликации групп В и Е грамотрицательных и грамположительных бактерий) (Титок, 2004). В составе репликона выявлены гены dnaB (INP59_27530) и ssb (INP59_27510), располагающиеся в пределах области размером 5265 п.н. и разделенные 3 генами, кодирующими неизвестные белки; а также единственный ген parA (INP59_26825), локализованный на большом расстоянии от вышеупомянутых генов.
DnaB – это хеликаза, обеспечивающая расплетение ДНК в точке начала репликации. Как правило, при репликации плазмид используется хозяйский белок DnaB, кодируемый хромосомными генами. Однако есть отдельные группы плазмид (Turner et al., 2002), несущие эти гены в своем составе. В частности, на плазмиде pQBR55 (NZ_LN713927.1) вблизи точки начала репликации локализуются два гена dnaB (PQBR55_RS00220 и PQBR55_RS00225). S.L. Turner et al. (2002) показали, что, по крайней мере, второй из них необходим для репликации. Белковые продукты этих генов сходны между собой на 64% (на 79% с учетом синонимичных замен). Сравнение белков DnaB, кодируемых плазмидами pSID (QOW01910.1, 441 а.к.о.) и pQBR55 (для сравнения использовали последовательность белка, участие которого в репликации было установлено экспериментально, WP_011031943.1, 464 а.к.о.), выявило сходство по аминокислотному составу 31% (46% с учетом синонимичных замен).
Известно также, что плазмидный ген dnaB входит в состав мини-репликона линейной плазмиды SLP2 бактерий Streptomyces lividans 1326 (Ahsan, Kabir, 2013). Кодируемый плазмидным геном белок DnaB (AAO61160.1, 451 а.к.о.) проявляет сходство 26% (44% с учетом синонимичных замен) с белком исследуемых бактерий, в то время как гены не обнаруживают значимого сходства.
Все вышеперечисленное дает основания предполагать, что в репликации плазмиды pSID участвует белок DnaB, а вблизи его гена можно ожидать наличие сайта начала репликации oriV. Поиск повторов, потенциально составляющих DnaA-боксы, вблизи гена dnaB не дал результатов. Однако известно, что не всем плазмидам они свойственны. В частности, у плазмид групп В и С они отсутствуют, как и АТ-богатые области (Титок, 2002).
Выше гена dnaB на плазмиде pSID расположена ОРС (INP59_27525), 3ꞌ-конец которой перекрывается с 5ꞌ-концом гена dnaB. Сравнение их нуклеотидных последовательностей выявило сходство 90.48%, однако белковые продукты сходства не проявляют. Очевидно, в первом гене могли произойти мутации, в результате которых он утратил свою функциональность.
SSB-белки выполняют при репликации функцию стабилизации одноцепочечных участков ДНК. Обычно они кодируются хромосомными генами: сходство с хромосомным геном (INP59_23825, 519 п.н.) составляет 85.29%. В то же время на некоторых плазмидах гены ssb обнаруживаются рядом с точкой начала конъюгационного переноса oriT (а с противоположной стороны локализованы гены tra), хотя их значимое участие в конъюгации не показано (Howland et al., 1989). Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ssb плазмид pSID и ColIb-P9 (M25505.1, 528 п.н.) не выявило значимого сходства, тогда как аминокислотные последовательности белков сходны на 29.55% (47% с учетом синонимичных замен). Генов, непосредственно связанных с конъюгационным переносом плазмиды pSID, вблизи гена ssb не выявлено. Близкое расположение гена ssb к гену dnaB позволяет предполагать его участие в процессе репликации плазмиды pSID.
Продукт гена parA в клетках бактерий отвечает за разделение плазмид после репликации. Как правило, он работает в паре с белком ParB, являющимся продуктом гена, входящего в состав одного оперона с parA. Однако известна плазмида pSK1 бактерий Staphylococcus aureus, за распределение которой отвечает лишь один белок Par (AAF63251.1, 245 а.к.о.), ген которого расположен рядом с rep-геном и транскрибируется в противоположном направлении (Chan et al., 2022). Сравнение белка ParА (QOW01990.1, 384 а.к.о.) исследуемых бактерий с белком Par S. aureus pSK1 не выявило гомологии. Вблизи гена parA не выявлено ОРС, обладающих сходством с известными rep-генами. Сравнение последовательностей плазмидного и хромосомного (QOV96885.1, 327 а.к.о.) белков ParА выявило сходство 25% (42% с учетом синонимичных замен).
Сходные нуклеотидные последовательности генов dnaB, ssb и parA были выявлены только в составе плазмид бактерий рода Rhodococcus (табл. 1).
Таблица 1. Сравнительный анализ систем репликации плазмиды pSID с известными
Штамм | Источник | Плазмида | Размер (п.н.) | Номер в базе данных GeneBank NCBI | Степень сходства, % | Наличие других детерминант, связанных с репликацией и сегрегацией | ||
гена dnaB | гена ssb | гена parA | ||||||
R. pyridinivorans YF3 | Денитрифицирующий биореактор, разлагающий хинолин, Китай | Unnamed1 | 337 275 | CP040720.1 | 99.92 | 100.00 | 99.74 | Не аннотирована |
R. rhodochrous LH-B3 | Загрязненная нефтепродуктами почва, Китай | Unnamed1 | 300 219 | CP120357.1 | 98.57 | 99.80 | 99.74 | Не аннотирована |
R. pyridinivorans YC-JH2 | Почва, Шеньянг, Китай | pRJH1 | 327 914 | CP050179.1 | 98.57 | 99.80 | 99.74 | ‒ |
Rhodococcus sp. RDE2 | Япония | pRDE01 | 224 658 | AP025187.1 | 86.74 | 99.22 | 99.65 | ‒ |
R. opacus VOC-14 | Дерново-подзолистая почва, загрязненная сольвентом, Минск, Беларусь | pRho-VOC14-C342 | 342 121 | CP130954.1 | 84.33 | 86.32 | 73.18 | ‒ |
R. opacus 9 | Грунтовые воды, загрязненные нитрофенолом и трихлорэтиленом, Австралия | Unnamed1 | 139 990 | CP095405.1 | ‒ | ‒ | 73.57 | parB (локализован далеко от parA) |
R. opacus PD630 | Завод в 10 км от Геттингена, Германия | pRoPD630_2 | 167 985 | CP080956.1 | ‒ | ‒ | 73.11 | parB (локализован далеко от parA) |
Rhodococcus sp. USK10 | Аллювиальные осадки, Китай | Unnamed1 | 117 483 | CP076046.1 | ‒ | ‒ | 73.84 | parAB (локализован рядом с отдельно стоящим parA) |
Примечание. “‒” ‒ детерминанты не выявлено.
Причем все три гена (dnaB, ssb и parA) обнаруживались в составе более крупных плазмид (224‒343 т.п.н.), тогда как на плазмидах меньшего размера (117‒167 т.п.н.) обнаруживался только гомологичный ген parA. В то же время на плазмидах меньшего размера выявлены гены parB.
На плазмидах pRJH1, pRDE01, pRho-VOC14-C342 перед геном dnaB, так же как на плазмиде pSID, расположена перекрывающаяся с ним рамка считывания, но не проявляющая с ним какого-либо сходства. Для плазмид бактерий R. pyridinivorans YF3 и R. rhodochrous LH-B3 такой анализ не проведен, т.к. они не аннотированы. Гены ssb располагаются вблизи генов dnaB, тогда как гены parA обнаруживаются в ином локусе плазмид.
Анализ генома плазмиды на наличие генов, отвечающих за синтез вторичных метаболитов, позволил выявить два локуса (табл. 2), один из которых определяет биосинтез сидерофора (121628‒137136 п.н.), а второй – поликетидного соединения (209405‒250428 п.н.).
Таблица 2. Гены биосинтеза вторичных метаболитов
№ ОРС | Название продукта | Размер гена, п.н. | Размер белка, а.к.о. | Сходство нуклеотидной последовательности гена с известными: штамм, № в GenBank NCBI, % |
Локус 1 – Биосинтез сидерофора | ||||
INP59_27105 | Аминотрансфераза IV класса | 921 | 306 | ‒ |
INP59_27110 | Фосфотрансфераза | 939 | 312 | Rhodococcus sp. 2G plasmid p1 (CP018064.1, 74.51%) |
INP59_27115 | SAM-зависимая метилтрансфераза I класса | 747 | 248 | ‒ |
INP59_27120 | MFS-транспортер | 1347 | 448 | Nocardioides sp. TF02-7 (CP092535.1, 71.28%) |
INP59_27125 (sid5) | Белок биосинтеза сидерофора семейства IucA/IucC* | 1692 | 563 | Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1, 68.86%) |
INP59_27130 (sid4) | Монооксигеназа семейства SidA/IucD/PvdA** | 1311 | 436 | S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1, 75.25%) |
INP59_27135 (sid3) | Ацетилтрансфераза** | 555 | 184 | Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1, 69.89%) |
INP59_27140 (sid2) | Сидерофорсинтаза* | 1800 | 599 | S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1, 73.69%) |
INP59_27145 (sid1) | Аминотрансфераза** | 1512 | 503 | S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1, 72.95%) |
INP59_27150 | Альфа/бета-гидролаза** | 978 | 325 | ‒ |
INP59_27155 | Гидролаза семейства HAD | 687 | 228 | ‒ |
Локус 2 – Биосинтез поликетидного соединения | ||||
INP59_27520 | Белок, содержащий SH3-домен | 333 | 110 | R. pyridinivorans YF3, плазмида unnamed1 (CP040720.1, 99.10%), R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 99.10%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 99.10%) |
INP59_27530 | АТФаза семейства ААА | 1326 | 441 | R. pyridinivorans YF3, плазмида unnamed1 (CP040720.1, 99.92%) |
INP59_27585 | Транскрипционный регулятор, содержащий домен wHTH | 312 | 103 | R. pyridinivorans YF3, плазмида unnamed1 (CP040720.1, 98.72%) |
INP59_27605 | Субстрат-связывающий белок АВС-транспортера | 1584 | 527 | R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 97.92%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 97.92%) |
INP59_27610 | Пермеаза АВС-транспортера | 954 | 317 | R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 97.17%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 97.17%) |
INP59_27615 | Пермеаза АВС-транспортера | 837 | 278 | Rhodococcus sp. GA1 (CP097186.1, 96.65%) |
INP59_27620 | АТФ-связывающий белок АВС-транспортера | 933 | 310 | R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 96.46%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 96.46%) |
INP59_27625 | Белок, содержащий АТФ-связывающую кассету | 783 | 260 | ‒ |
INP59_27630 | НАД(Ф)-зависимая оксидоредуктаза семейства SDR* | 14484 | 4827 | R. pyridinivorans P23 плазмида pB (CP113800.1, 96.25%) |
INP59_27635 | Белок, содержащий тиоэфирредуктазный домен** | 2292 | 763 | R. pyridinivorans Y6 плазмида unnamed4 (CP096039.1, 96.29%) |
INP59_27640 | Альфа/бета-гидролаза** | 1074 | 357 | R. pyridinivorans Y6 плазмида unnamed4 (CP096039.1, 96.28%) |
INP59_27645 | Кротонил-КоА-карбоксилаза/редуктаза** | 1353 | 450 | R. pyridinivorans Y6 плазмида unnamed4 (CP096039.1, 96.30%) |
*Основные гены биосинтеза. **Вспомогательные гены биосинтеза.
Многие детерминанты локуса 2 (INP59_27520–INP59_27620), определяющие синтез поликетидного соединения, проявляют высокую степень сходства с гомологичными генами, локализованными на плазмидах unnamed1 R. pyridinivorans YF3, unnamed1 R. rhodochrous LH-B3, pRJH1, pRDE01 и немного меньшую с плазмидными генами pRho-VOC14-C342, для которых было установлено сходство детерминант, определяющих репликацию, конъюгацию и распределение по дочерним клеткам. Это может говорить об общем происхождении данных плазмид. В то же время основные биосинтетические детерминанты (INP59_27630–INP59_27645) проявляют наибольшую степень подобия с гомологичными генами, расположенными на других плазмидах: pB R. pyridinivorans P23 (CP113800.1), unnamed4 R. pyridinivorans Y6 (CP096039.1), unnamed2 R. pyridinivorans YF3 (CP040721.1).
Больший интерес представляет локус 1 (табл. 2), т.к. гены биосинтеза сидерофора проявляют наибольшую степень сходства (хотя она и не превышает 75%) с последовательностями бактерий S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1), S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1), Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1) и некоторых других стрептомицетов, но не обладают сходством с какими-либо известными генами биосинтеза сидерофоров у родококков. Данный локус расположен на фрагменте плазмиды, который, предположительно, приобретен в результате горизонтального переноса (рис. 1).
В локусе 1 гены sid1–4, по всей видимости, образуют оперон, а ген sid5 транскрибируется во встречном направлении. Такая организация является уникальной для плазмиды pSID, т.к. у известных бактерий ген sid5 (iucC) транскрибируется в том же направлении и находится либо в начале, либо в конце оперона (рис. 2).
Рис. 2. Организация кластера биосинтеза сидерофоров у различных бактерий: 1 – плазмида pSID R. pyridinivorans 5Ар; 2 – Paenactinomyces guangxiensis s-10 (NZ_JACEIQ000000000.1); 3 – Streptomyces ficellus NRRL 8067 (CP034279.1); 4 – Myxococcus hansupus mixupus (CP012109.1).
Для оценки вклада сидерофора, за синтез которого отвечает локус 1, в биологическую активность бактерий R. pyridinivorans 5Ар был проведен инсерционный мутагенез первого гена в опероне ‒ sid1. Полученный мутантный вариант бактерий обозначили R. pyridinivorans 5Ар RifR sid::pK18mob.
При инактивации гена sid1 у исследуемых бактерий снижается устойчивость к железу, кадмию и арсенатам (табл. 3). Это согласуется с данными об участии сидерофоров во внеклеточной биосорбции мышьяка, железа, свинца, цинка, кадмия и др. (Presentato, 2020).
Антагонистическая активность мутантных бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям P. carotovorum 2.18 снижается (табл. 4), что говорит об антимикробной активности продуцируемого соединения.
Однако способность подавлять рост тест-штамма не исчезает полностью, что говорит либо о синтезе соединения с более низкой активностью (т.к. ген sid1 относится к вспомогательным генам биосинтеза, а один из основных биосинтетических генов sid5 и вовсе не входит в состав оперона), либо о синтезе других соединений с антимикробной активностью (в частности, локус 2 определяет синтез поликетидного соединения). Интересно и то, что синтез антимикробных метаболитов происходит на полноценной среде (ПДА) и минеральной среде с глюкозой, в то время как на средах с сукцинатом или нафталином бактерии R. pyridinivorans 5Ар таких метаболитов не производят.
Бактерии R. pyridinivorans 5Ар обладают стимулирующим воздействием на корни редиса красного (рис. 3), в то время как мутантный вариант R. pyridinivorans 5Ар RifR sid::pK18mob по какой-то причине вызывает достоверное уменьшение длины корней проростков.
Рис. 3. Влияние бактерий рода Rhodococcus на морфометрические показатели проростков редиса красного. К1 – вода; К2 – среда Мейнелла; 1 – 24-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар; 2 – 48-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар; 3 – 24-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар RifR sid::pK18mob; 4 – 48-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар RifR sid::pK18mob. * ‒ Отличия от К1 достоверны при р ≤ 0.05; ** ‒ отличия от К2 достоверны при р ≤ 0.05; *** ‒ отличия от дикого типа достоверны при р ≤ 0.05. Высота столбцов отражает среднее значение, планки погрешностей – среднеквадратичное отклонение.
На рост гипокотиля негативное влияние оказывала сама среда Мейнелла, в то время как при обработке культурой (как 24-, так и 48-часовой) бактерий R. pyridinivorans 5Ар, а также 24-часовой культурой R. pyridinivorans 5Ар RifR sid::pK18mob значения длины гипокотиля не отличаются о контрольных с водой. 48-часовая культура мутантных бактерий R. pyridinivorans 5Ар RifR sid::pK18mob оказывает угнетающее, по сравнению с водой, воздействие. Вероятно, инактивация гена sid1 приводит к образованию соединения, обладающего фитотоксичностью.
Таким образом, в результате полногеномного секвенирования в клетках бактерий R. pyridinivorans 5Ар была выявлена плазмида pSID размером 250428 п.н. За репликацию данной плазмиды, по всей вероятности, отвечает ген dnaB, хотя вблизи него не выявлено характерных для oriV структур (повторов, DnaA-боксов, АТ-богатых участков). Гены, которые могут быть вовлечены в репликацию (dnaB, ssb) и разделение плазмид после репликации (parA), проявляют наибольшую степень сходства с детерминантами, расположенными на крупных (224‒343 т.п.н.) плазмидах родококков: unnamed1 R. pyridinivorans YF3, unnamed1 R. rhodochrous LH-B3, pRJH1 R. pyridinivorans YC-JH2, pRDE01 Rhodococcus sp. RDE2 и pRho-VOC14-C342 R. opacus VOC-14.
Плазмида pSID определяет способность бактерий R. pyridinivorans 5Ар синтезировать биологически активное соединение, обладающее антагонистической активностью против фитопатогенных бактерий P. carotovorum 2.18, стимулирующей рост активностью в отношении редиса красного и определяющее устойчивость к ионам железа, кадмия и арсенатам. Нарушение гена sid1 (одного из вспомогательных биосинтетических генов, первого гена в опероне sid1–4) приводит к снижению антагонистической активности бактерий и появлению у них фитотоксических свойств. Гены биосинтеза (sid1–5) данного соединения (предположительно, сидерофора) проявляют наибольшую степень сходства (не более 75%) с последовательностями бактерий S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1), S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1), Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1) и некоторых других стрептомицетов, но не обладают сходством с какими-либо известными генами биосинтеза сидерофоров у родококков. Кроме того, данный локус плазмиды pSID имеет уникальную организацию, т.к. ген sid5 (iucC) транскрибируется во встречном направлении, тогда как у других бактерий он входит в состав оперона и располагается в начале или в конце.
ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ
Работа выполнена при финансировании в рамках грантов БРФФИ Б18М-075, Б22МВ-029 и задания 3.6.2 ГПНИ “Биотехнологии” (2021–2023 гг.).
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы подтверждают, что конфликты интересов отсутствуют.
About the authors
М. I. Mandryk
Belarusian State University
Author for correspondence.
Email: charnymi@bsu.by
Belarus, Minsk
А. А. Vysotskaya
Belarusian State University
Email: charnymi@bsu.by
Belarus, Minsk
Yu. V. Yahorava
Belarusian State University
Email: charnymi@bsu.by
Belarus, Minsk
D. U. Surzhyk
Belarusian State University
Email: charnymi@bsu.by
Belarus, Minsk
А. Yu. Larchenka
Belarusian State University
Email: charnymi@bsu.by
Belarus, Minsk
S. L. Vasylenko
Belarusian State University
Email: charnymi@bsu.by
Belarus, Minsk
References
- Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М: Мир, 2002. 589 c.
- Мандрик М. И., Охремчук А. Э., Валентович Л. Н., Трушлис Э. В., Ларченко А. Ю., Василенко С. Л. Характеристика генетических локусов, определяющих деградацию фенола, в геноме бактерий Rhodococcus pyridinivorans 5Ap // Экспериментальная биология и биотехнология. 2024. №1. С. 27–40.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.
- Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М.: Мир, 1967. 320 c.
- Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 436 с.
- Титок М. А. Плазмиды грамположительных бактерий. Минск: Изд-во БГУ, 2004. 120 с.
- Чернявская М. И. Характеристика штаммов нафталинутилизирующих бактерий рода Rhodococcus // Труды БГУ: Микробиология. 2016. Т. 11. Ч. 1. С. 190–197.
- Ahsan S., Kabir M. S. Linear plasmids and their replication // Stamford J. Microbiol. 2013. V. 2. P. 1‒5.
- Aznar A., Chen N. W., Rigault M., Riache N., Joseph D., Desmaële D., Mouille G., Boutet S., Soubigou-Taconnat L., Renou J. P., Thomine S., Expert D., Dellagi A. Scavenging iron: a novel mechanism of plant immunity activation by microbial siderophores // Plant Physiol. 2014. V. 164. P. 2167‒2183.
- Blin K., Shaw S., Augustijn H.E, Reitz Z. L., Biermann F., Alanjary M., Fetter A., Terlouw B. R., Metcalf W. W., Helfrich E. J.N., van Wezel G. P., Medema M. H., Weber T. antiSMASH 7.0: New and improved predictions for detection, regulation, chemical structures and visualization // Nucl. Acids Res. 2023. V. 51. P. W46‒W50. https://doi.org/10.1093/nar/gkad344
- Bullock W. O. XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection // BioTechniques. 1987. V. 5. P. 376–378.
- Chan H. Y., Jensen S. O., LeBard R.J., Figgett W. A., Lai E., Simpson A. E., Brzoska A. J., Davies D. S., Connolly A. M., Cordwell S. J., Travis B. A., Salinas R., Skurray R. A., Firth N., Schumacher M. A. Molecular analysis of pSK1 par: a novel plasmid partitioning system encoded by staphylococcal multiresistance plasmids // J. Mol. Biol. 2022. V. 434. Art. 167770.
- Cserháti M., Kriszt B., Krifaton Cs., Szoboszlay S., Háhn J., Tóth Sz., Nagy I., Kukolya J. Mycotoxin-degradation profile of Rhodococcus strains // Int. J. Food Microbiol. 2013. V. 166. P. 176‒185.
- Dimkpa C. O., Svatoš A., Dabrowska P., Schmidt A., Boland W., Kothe E. Involvement of siderophores in the reduction of metal-induced inhibition of auxin synthesis in Streptomyces spp. // Chemosphere. 2008. V. 74. P. 19‒25.
- Grant J. R., Enns E., Marinier E., Mandal A., Herman E. K., Chen C., Graham M., Van Domselaar G., Stothard P. Proksee: in-depth characterization and visualization of bacterial genomes // Nucl. Acids Res. 2023. V. 51. P. W484‒W492. https://doi.org/10.1093/nar/gkad326
- Howland C. J., Rees C. E., Barth P. T., Wilkins B. M. The ssb gene of plasmid ColIb-P9 // J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 2466–2473.
- Iminova L., Delegan Y., Frantsuzova E., Bogun A., Zvonarev A., Suzina N., Anbumani S., Solyanikova I. Physiological and biochemical characterization and genome analysis of Rhodococcus qingshengii strain 7B capable of crude oil degradation and plant stimulation // Biotech. Rep. 2022. V. 35. Art. e00741.
- Ji C., Fan Yu, Zhao L. Review on biological degradation of mycotoxins // Animal Nutr. 2016. V. 2. P. 127‒133.
- Kriszt R., Krifaton C., Szoboszlay S., Cserháti M., Kriszt B., Kukolya J., Czéh Á., Fehér-Tóth S., Török L., Szőke Z., Kovács K. J., Barna T., Ferenczi S. New zearalenone biodegradation strategy using non-pathogenic Rhodococcus pyridinivorans K408 strain // PLoS One. 2012. V. 7. Art. e43608.
- Kuhl T., Felder M., Nussbaumer T., Fischer D., Kublik S., Chowdhury P. S., Schloter M., Rothballer M. De novo genome assembly of a plant-associated Rhodococcus qingshengii strain (RL1) isolated from Eruca sativa Mill. and showing plant growth-promoting properties // Microbiol. Res. Announc. 2019. V. 8. Art. e01106-19. https://doi.org/10.1128/mra.01106-19
- Kundu D., Hazra C., Chaudhari A. Biodegradation of 2,6-dinitrotoluene and plant growth promoting traits by Rhodococcus pyridinivorans NT2: identification and toxicological analysis of metabolites and proteomic insights // Biocat. Agricul. Biotech. 2016. V. 8. P. 55‒65.
- Metcaff W. W., Jiang W., Wanner B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kgamma origin plasmids at different copy numbers // Gene. 1994. V. 138. P. 1–7.
- Oberto J. SyntTax: a web server linking synteny to prokaryotic taxonomy // BMC Bioinformatics. 2013. V. 14. https://doi.org/10.1186/1471-2105-14-4
- Presentato А., Piacenza E., Turner R. J., Zannoni D., Cappelletti M. Processing of metals and metalloids by Actinobacteria: cell resistance mechanisms and synthesis of metal (loid)-based nanostructures // Microorganisms. 2020. V. 8. Art. 2027.
- Roskova Z., Skarohlid R., McGachy L. Siderophores: an alternative bioremediation strategy? // Sci. Tot. Environ. 2022. V. 819. Art. 153144.
- Saha R., Saha N., Donofrio R. S., Bestervelt L L. Microbial siderophores: a mini review // J. Bas. Microbiol. 2013. V. 53. P. 303‒317.
- Schäfer A., Tauch A., Jäger W., Kalinowski J., Thierbach G., Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum // Gene. 1994. V. 145. P. 69–73.
- Stevens V., Thijs S., McAmmond B., Langill T., Van Hamme J., Weyens N., Vangronsveld J. Draft genome sequence of Rhodococcus erythropolis VSD3, a diesel fuel-degrading and plant growth-promoting bacterium isolated from Hedera helix leaves // Gen. Announc. 2017. V. 5. https://doi.org/10.1128/genomea.01680-16
- te Riele H., Michel B., Ehrlich S. D. Single-stranded plasmid DNA in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 2541–2545.
- Turner S. L., Lilley A. K., Bailey M. J. Two dnaB genes are associated with the origin of replication of PQBR55, an exogenously isolated plasmid from the rhizosphere of sugar beet // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 42. P. 209–215.
- Vernikos G. S., Parkhill J. Interpolated variable order motifs for identification of horizontally acquired DNA: revisiting the Salmonella pathogenicity islands // Bioinf. 2006 V. 22. P. 2196‒2203.
Supplementary files
