Bioinformatic and functional analysis of the pSID siderophore biosynthesis plasmid of  Rhodococcus pyridinivorans  5Ap

М. I. Mandryk; Мандрик М. И.; А. А. Vysotskaya; Высоцкая А. А.; Yu. V. Yahorava; Егорова Ю. В.; D. U. Surzhyk; Суржик Д. В.; А. Yu. Larchenka; Ларченко А. Ю.; S. L. Vasylenko; Василенко С. Л.

doi:10.31857/S0026365624040034

Биоинформационный и функциональный анализ плазмиды биосинтеза сидерофоров pSID бактерий Rhodococcus pyridinivorans 5Ap

Авторы: Мандрик М.И.¹, Высоцкая А.А.¹, Егорова Ю.В.¹, Суржик Д.В.¹, Ларченко А.Ю.¹, Василенко С.Л.¹
Учреждения:
1. Белорусский государственный университет
Выпуск: Том 93, № 4 (2024)
Страницы: 414-424
Раздел: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/272092
DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624040034
ID: 272092

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

В клетках бактерий R. pyridinivorans 5Ар в результате секвенирования полной последовательности генома выявлена плазмида pSID (CP063453.1) размером 250428 п.н. За репликацию данной плазмиды, по всей вероятности, отвечает ген dnaB. Гены, которые могут быть вовлечены в репликацию (dnaB, ssb) и разделение плазмид после репликации (parA), проявляют наибольшую степень сходства с детерминантами, расположенными на крупных (224‒343 т.п.н.) плазмидах родококков: unnamed1 R. pyridinivorans YF3, unnamed1 R. rhodochrous LH-B3, pRJH1 R. pyridinivorans YC-JH2, pRDE01 Rhodococcus sp. RDE2 и pRho-VOC14-C342 R. opacus VOC-14. На плазмиде pSID выявлено два локуса, ответственных за синтез вторичных метаболитов, один из которых определяет синтез поликетидного соединения (сходные последовательности выявлены на плазмидах родококков), а второй – предположительно, синтез сидерофора: гены биосинтеза (sid1–5) данного соединения проявляют наибольшую степень сходства (не более 75%) с последовательностями бактерий Streptomyces vilmorinianum YP1 (CP040244.1), S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1), Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1) и некоторых других стрептомицетов, но не обладают сходством с какими-либо известными генами биосинтеза сидерофоров у родококков. Локус плазмиды pSID, отвечающий за синтез сидерофора, имеет уникальную организацию, т.к. ген sid5 (iucC) транскрибируется во встречном направлении, тогда как у других бактерий он входит в состав оперона и располагается в начале или в конце. Установлено, что при инактивации гена sid1 снижается антагонистическая активность бактерий R. pyridinivorans 5Ар против фитопатогенных бактерий P. carotovorum 2.18, снижается устойчивость к ионам железа, кадмия и арсенатам, а также появляются фитотоксические свойства в отношении редиса красного, тогда как бактерии дикого типа обладают стимулирующей рост растений активностью.

Ключевые слова

Rhodococcus, плазмиды, сидерофоры, стимулирующая рост растений активность, антагонистическая активность, устойчивость к тяжелым металлам

Полный текст

Бактерии рода Rhodococcus широко известны как деструкторы органических соединений различной природы и в основном применяются в составе биопрепаратов для биоремедиации сред, загрязненных углеводородами. Такие среды характеризуются изменением физико-химических свойств почвы, нарушением состава микробиоценоза, а также растительного покрова. Результатом же биоремедиации должно стать не только разложение загрязнителя, но и восстановление всех характеристик почвы. Соответственно, наиболее перспективными будут те бактерии-деструкторы, которые не только разрушают загрязнители, но и способствуют росту растений, т.е. обладающие рост-стимулирующими и защитными свойствами. В этом плане родококки являются привлекательными объектами природоохранных биотехнологий, т.к. помимо углеводородов, способны разлагать токсины, в том числе микотоксины, продуцируемые фитопатогенными грибами (Kriszt et al. 2012; Cserháti et al., 2013; Ji et al., 2016), а также продуцируют ряд соединений с рост-стимулирующей активностью по отношению к растениям и антагонистической активностью по отношению к разным группам микроорганизмов, в том числе фитопатогенным (Kundu et al., 2016; Stevens et al., 2017; Kuhl et al., 2019; Iminova et al., 2022).

Одной из важных групп соединений с антагонистической и стимулирующей рост растений активностью являются сидерофоры (Глик, Пастернак, 2002). Родококки, как и другие бактерии, продуцируют в среду различные виды сидерофоров для эффективной добычи ионов железа, входящих в состав активных центров многочисленных оксигеназ ‒ ферментов, обеспечивающих окисление широкого спектра углеводородов. На этом участие сидерофоров в биодеградативной активности не заканчивается. Показано, что они способны индуцировать возникновение в средах активных форм кислорода, которые, в свою очередь, обеспечивают окисление органических загрязнителей (Roskovа et al., 2022). Сидерофоры, наряду с биосурфактантами, обеспечивают бактериям устойчивость к тяжелым металлам и металлоидам за счет неспецифического связывания с некоторыми из них (Presentato et al., 2020). Такое неспецифическое связывание играет важную роль при фитобиоремедиации загрязненных тяжелыми металлами сред, поскольку делает ионы тяжелых металлов более доступными для поглощения растениями (Saha et al., 2013). Кроме того, сидерофоры являются факторами антагонизма, обеспечивая своим продуцентам селективное преимущество в средах с дефицитом железа (Глик, Пастернак, 2002; Saha et al., 2013).

Положительное действие бактерий – продуцентов сидерофоров на растения обеспечивается за счет нескольких механизмов. Во-первых, бактериальные сидерофоры более активны по сравнению с грибными, поэтому бактерии выигрывают в конкурентной борьбе с фитопатогенными грибами в ризосфере растения (Глик, Пастернак, 2002). Во-вторых, показано, что сидерофоры способствуют выработке бактериальных ауксинов в ризосфере растения в условиях загрязнения тяжелыми металлами (Dimkpa et al., 2008). В-третьих, установлено, что сидерофоры обладают элиситорным воздействием и стимулируют иммунный ответ растения (Aznar et al., 2014).

Таким образом, бактерии рода Rhodococcus можно рассматривать не только как деструкторов опасных поллютантов, перспективных для использования при биоремедиации и фитобиоремедиации загрязненных сред, но и как перспективных агентов для защиты растений и продуцентов ценных биологически активных метаболитов.

Способность продуцировать биологически активные соединения, так же как и способность утилизировать различные трудно разлагаемые соединения, часто определяется мобильными генетическими элементами, в частности, плазмидами.

Целью данного исследования был анализ вклада плазмиды pSID в устойчивость, антагонистическую и стимулирующую рост растений активность бактерий Rhodococcus pyridinivorans 5Ap – деструкторов углеводородов нефти.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали бактерии R. pyridinivorans 5Ap (депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов под номером БИМ В-939 Г). Для клонирования фрагмента гена биосинтеза сидерофоров использовали суицидальный вектор pK18mob (Km^r, LacZ') (Schäfer et al., 1994). Для отбора рекомбинантных молекул ДНК и последующего их введения в клетки родококков использовали штаммы E. coli XL1-Blue (Bullock et al., 1987) и BW19851 (Metcaff et al., 1994). В качестве тест-культуры для проверки антагонистической активности использовали бактерии Pectobacterium carotovorum 2.18 (депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов под номером БИМ В-1640). Для определения стимулирующих рост растений свойств использовали семена редиса красного Raphanus sativus L. var. sativus сорта Гранат. Анализируемая нуклеотидная последовательность плазмиды pSID бактерий R. pyridinivorans 5Ap депонирована в GenBank NCBI под номером CP063453.1.

Среды и растворы. Для культивирования бактерий использовали пептонно-дрожжевую среду (жидкую – ПДБ: пептон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, NaCl – 8 г/л, рН 7.0–7.2; плотную ‒ ПДА – добавляли агар бактериологический – 7 или 15 г/л); среду Мейнелла с 2% мелаcсой (Мейнелл, Мейнелл, 1967), плотную минеральную среду М9 (Миллер, 1976) с добавлением глюкозы (0.2%), сукцината (0.2%) или нафталина (пары) в качестве единственного источника углерода. Для проращивания семян растений использовали 1% водный агар (агар бактериологический – 10 г/л).

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) тяжелых металлов и металлоидов. Исследуемые бактерии культивировали в среде ПДБ с аэрацией (140 об./мин) в течение 24 ч при 28°С. Полученной культурой (20 мкл) инокулировали среду ПДБ (3 мл) с различными концентрациями тяжелых металлов и металлоидов, вносимых в виде солей: NiCl₂ (0.1; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 2; 3; 4; 5 ммоль/л), ZnSO₄ (0.5; 0.6; 0.75; 0.9; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 ммоль/л), CoCl₂ (0.5; 0.75; 1; 1.25; 1.5 ммоль/л), CuCl₂ (0.1; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 1.6; 1.7; 1.8; 1.9; 2; 4; 6; 8; 10 ммоль/л), CdCl₂ (0.1; 0.2; 0.5; 0.75; 1; 1.5 ммоль/л), Hg(NO₃)₂ (0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.5; 1 ммоль/л), Pb(NO₃)₂ (0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 ммоль/л), FeCl₃ (0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 4; 5 ммоль/л), Na₃AsO₃ (0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 ммоль/л). Инкубировали с аэрацией (140 об./мин) в течение 48 ч при 28°С. Визуально оценивали рост культур и производили измерение ОП₆₀₀ (положительный результат регистрировали при достижении значения ОП₆₀₀0.2). За МИК принимали концентрацию, следующую за той, при которой наблюдался рост.

Антагонистическую активность оценивали с помощью метода отсроченного антагонизма. На поверхность агаризованной среды (ПДА, М9 с глюкозой (0.2%), М9 с сукцинатом (0.2%) или М9 с нафталином (пары)) в чашке Петри медальонами засевали штаммы исследуемых бактерий, культивировали при температуре 28°С в течение 48 ч. Ночную культуру фитопатогенных бактерий Pectobacterium carotovorum 2.18 выращивали с аэрацией при 28°С. В 5 мл 0.7% ПДА добавляли 100 мкл культуры фитопатогенных бактерий. Далее наслаивали 0.7% ПДА на чашку Петри с медальонами и инкубировали при температуре 28°С. Размер зоны задержки роста тест-штамма вокруг медальонов замеряли через 24 ч культивирования от края медальона до начала роста тест-культуры.

Стимулирующую рост растений активность оценивали на растениях редиса красного сорта Гранат. Ночную культуру исследуемых штаммов выращивали в среде Мейнелла при температуре 28°C в течение 24 или 48 ч. Семена редиса предварительно замачивали в течение 30 мин в культуральной жидкости каждого штамма, среде Мейнелла и воде (контроли). Помещали семена на поверхность 1% водного агара, инкубировали при комнатной температуре. Через 7 сут определяли морфометрические показатели (длина гипокотиля, длина корня).

Трансформацию E. coli осуществляли по методике, описанной в руководстве (Маниатис и соавт., 1984).

Тотальную ДНК бактерий выделяли саркозиловым методом (te Riele et al., 1986).

Выделение плазмидной ДНК. Для выделения плазмидной ДНК использовали набор реактивов Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit (“Jena Bioscience”, Германия).

ПЦР проводили с использованием набора реактивов производства Thermoscientific (EC), ОДО “Праймтех” (РБ) и праймеров производства ОДО “Праймтех” (РБ). Реакцию проводили в объеме 25–50 мкл. Реакционная смесь содержала 1× буфер с ионами Mg²⁺ для соответствующей ДНК-полимеразы, смесь дНТФ (0.2 ммоль/л каждого нуклеотида), 0.5 мкмоль/л каждого праймера, 1.25–2.5 ед. ДНК-полимеразы (Taq или Pfu).

Амплификацию фрагмента плазмидного гена sid проводили при режимах: 95°С – 3 мин (1 цикл); 95°С – 1 мин, 57°С – 1 мин, 72°С – 1 мин (30 циклов); 72°С – 5 мин (1 цикл). Использовали праймеры Sid-fw (AGGAGCAGGCCACCACTTAC) и Sid-rev (AGGAGGTTAGAGAGCGATCC), размер получаемого фрагмента составил 562 п.н.

ПЦР-анализ результатов инсерционного мутагенеза осуществляли с использованием пары праймеров M13 Forward (CACGACGTTGTAAAACGAC) или M13 Reverse (GGATAACAATTTCACACAGG) и Sid-fw и режимов: 94°С – 5 мин; 94°С – 30 с, 48°С – 1 мин, 72°С – 1 мин (5 циклов); 94°С – 30 с, 50°С – 1 мин, 72°С – 1 мин (25 циклов); 72°С – 10 мин.

Инактивация гена sid1 в опероне биосинтеза сидерофоров была осуществлена с помощью направленного инсерционного мутагенеза (Чернявская, 2016). Полученные на среде ПДА с рифампицином (100 мкг/мл) и канамицином (25 мкг/мкл) клоны рассевали на среде М9 с канамицином (25 мкг/мкл) и нафталином (пары) в качестве единственного источника углерода.

Инструменты биоинформационного анализа. Для анализа нуклеотидных последовательностей и построения генетической карты использовали программу SnapGene Viewer 5.0.8 и онлайн ресурс https://proksee.ca/ (Grant et al., 2023). Поиск фрагментов, которые были приобретены в результате горизонтального переноса, производили с помощью инструмента Alien Hunter (Vernikos, Parkhill, 2006). Для идентификации кластеров генов биосинтеза вторичных метаболитов использовали онлайн ресурс antiSMASH, версии 7.0.1 (https://antismash.secondarymetabolites. org) (Blin et al., 2023). Уровень синтении генов биосинтеза сидерофора оценивали с помощью ресурса SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/synttax/) (Oberto, 2013).

Статистический анализ проводили с использованием пакета статистики MS Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Плазмида pSID размером 250428 п.н. (рис. 1) была выявлена в клетках бактерий R. pyridinivorans 5Ар в результате секвенирования полной последовательности генома (Мандрик и соавт., 2024).

Рис. 1. Генетическая карта плазмиды Psid. INP – обозначение белок-кодирующих последовательностей, HGT Region – участок, который, предположительно, был привнесен в результате горизонтального переноса.

При аннотации плазмиды pSID не было выявлено генов rep, кодирующих специфические белки инициации репликации. В целом, далеко не все плазмиды обладают данными генами (в частности, плазмиды тета-типа репликации групп В и Е грамотрицательных и грамположительных бактерий) (Титок, 2004). В составе репликона выявлены гены dnaB (INP59_27530) и ssb (INP59_27510), располагающиеся в пределах области размером 5265 п.н. и разделенные 3 генами, кодирующими неизвестные белки; а также единственный ген parA (INP59_26825), локализованный на большом расстоянии от вышеупомянутых генов.

DnaB – это хеликаза, обеспечивающая расплетение ДНК в точке начала репликации. Как правило, при репликации плазмид используется хозяйский белок DnaB, кодируемый хромосомными генами. Однако есть отдельные группы плазмид (Turner et al., 2002), несущие эти гены в своем составе. В частности, на плазмиде pQBR55 (NZ_LN713927.1) вблизи точки начала репликации локализуются два гена dnaB (PQBR55_RS00220 и PQBR55_RS00225). S.L. Turner et al. (2002) показали, что, по крайней мере, второй из них необходим для репликации. Белковые продукты этих генов сходны между собой на 64% (на 79% с учетом синонимичных замен). Сравнение белков DnaB, кодируемых плазмидами pSID (QOW01910.1, 441 а.к.о.) и pQBR55 (для сравнения использовали последовательность белка, участие которого в репликации было установлено экспериментально, WP_011031943.1, 464 а.к.о.), выявило сходство по аминокислотному составу 31% (46% с учетом синонимичных замен).

Известно также, что плазмидный ген dnaB входит в состав мини-репликона линейной плазмиды SLP2 бактерий Streptomyces lividans 1326 (Ahsan, Kabir, 2013). Кодируемый плазмидным геном белок DnaB (AAO61160.1, 451 а.к.о.) проявляет сходство 26% (44% с учетом синонимичных замен) с белком исследуемых бактерий, в то время как гены не обнаруживают значимого сходства.

Все вышеперечисленное дает основания предполагать, что в репликации плазмиды pSID участвует белок DnaB, а вблизи его гена можно ожидать наличие сайта начала репликации oriV. Поиск повторов, потенциально составляющих DnaA-боксы, вблизи гена dnaB не дал результатов. Однако известно, что не всем плазмидам они свойственны. В частности, у плазмид групп В и С они отсутствуют, как и АТ-богатые области (Титок, 2002).

Выше гена dnaB на плазмиде pSID расположена ОРС (INP59_27525), 3ꞌ-конец которой перекрывается с 5ꞌ-концом гена dnaB. Сравнение их нуклеотидных последовательностей выявило сходство 90.48%, однако белковые продукты сходства не проявляют. Очевидно, в первом гене могли произойти мутации, в результате которых он утратил свою функциональность.

SSB-белки выполняют при репликации функцию стабилизации одноцепочечных участков ДНК. Обычно они кодируются хромосомными генами: сходство с хромосомным геном (INP59_23825, 519 п.н.) составляет 85.29%. В то же время на некоторых плазмидах гены ssb обнаруживаются рядом с точкой начала конъюгационного переноса oriT (а с противоположной стороны локализованы гены tra), хотя их значимое участие в конъюгации не показано (Howland et al., 1989). Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ssb плазмид pSID и ColIb-P9 (M25505.1, 528 п.н.) не выявило значимого сходства, тогда как аминокислотные последовательности белков сходны на 29.55% (47% с учетом синонимичных замен). Генов, непосредственно связанных с конъюгационным переносом плазмиды pSID, вблизи гена ssb не выявлено. Близкое расположение гена ssb к гену dnaB позволяет предполагать его участие в процессе репликации плазмиды pSID.

Продукт гена parA в клетках бактерий отвечает за разделение плазмид после репликации. Как правило, он работает в паре с белком ParB, являющимся продуктом гена, входящего в состав одного оперона с parA. Однако известна плазмида pSK1 бактерий Staphylococcus aureus, за распределение которой отвечает лишь один белок Par (AAF63251.1, 245 а.к.о.), ген которого расположен рядом с rep-геном и транскрибируется в противоположном направлении (Chan et al., 2022). Сравнение белка ParА (QOW01990.1, 384 а.к.о.) исследуемых бактерий с белком Par S. aureus pSK1 не выявило гомологии. Вблизи гена parA не выявлено ОРС, обладающих сходством с известными rep-генами. Сравнение последовательностей плазмидного и хромосомного (QOV96885.1, 327 а.к.о.) белков ParА выявило сходство 25% (42% с учетом синонимичных замен).

Сходные нуклеотидные последовательности генов dnaB, ssb и parA были выявлены только в составе плазмид бактерий рода Rhodococcus (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительный анализ систем репликации плазмиды pSID с известными

Штамм	Источник	Плазмида	Размер (п.н.)	Номер в базе данных GeneBank NCBI	Степень сходства, %			Наличие других детерминант, связанных с репликацией и сегрегацией
Штамм	Источник	Плазмида	Размер (п.н.)	Номер в базе данных GeneBank NCBI	гена dnaB	гена ssb	гена parA
R. pyridinivorans YF3	Денитрифицирующий биореактор, разлагающий хинолин, Китай	Unnamed1	337 275	CP040720.1	99.92	100.00	99.74	Не аннотирована
R. rhodochrous LH-B3	Загрязненная нефтепродуктами почва, Китай	Unnamed1	300 219	CP120357.1	98.57	99.80	99.74	Не аннотирована
R. pyridinivorans YC-JH2	Почва, Шеньянг, Китай	pRJH1	327 914	CP050179.1	98.57	99.80	99.74	‒
Rhodococcus sp. RDE2	Япония	pRDE01	224 658	AP025187.1	86.74	99.22	99.65	‒
R. opacus VOC-14	Дерново-подзолистая почва, загрязненная сольвентом, Минск, Беларусь	pRho-VOC14-C342	342 121	CP130954.1	84.33	86.32	73.18	‒
R. opacus 9	Грунтовые воды, загрязненные нитрофенолом и трихлорэтиленом, Австралия	Unnamed1	139 990	CP095405.1	‒	‒	73.57	parB (локализован далеко от parA)
R. opacus PD630	Завод в 10 км от Геттингена, Германия	pRoPD630_2	167 985	CP080956.1	‒	‒	73.11	parB (локализован далеко от parA)
Rhodococcus sp. USK10	Аллювиальные осадки, Китай	Unnamed1	117 483	CP076046.1	‒	‒	73.84	parAB (локализован рядом с отдельно стоящим parA)

Примечание. “‒” ‒ детерминанты не выявлено.

Причем все три гена (dnaB, ssb и parA) обнаруживались в составе более крупных плазмид (224‒343 т.п.н.), тогда как на плазмидах меньшего размера (117‒167 т.п.н.) обнаруживался только гомологичный ген parA. В то же время на плазмидах меньшего размера выявлены гены parB.

На плазмидах pRJH1, pRDE01, pRho-VOC14-C342 перед геном dnaB, так же как на плазмиде pSID, расположена перекрывающаяся с ним рамка считывания, но не проявляющая с ним какого-либо сходства. Для плазмид бактерий R. pyridinivorans YF3 и R. rhodochrous LH-B3 такой анализ не проведен, т.к. они не аннотированы. Гены ssb располагаются вблизи генов dnaB, тогда как гены parA обнаруживаются в ином локусе плазмид.

Анализ генома плазмиды на наличие генов, отвечающих за синтез вторичных метаболитов, позволил выявить два локуса (табл. 2), один из которых определяет биосинтез сидерофора (121628‒137136 п.н.), а второй – поликетидного соединения (209405‒250428 п.н.).

Таблица 2. Гены биосинтеза вторичных метаболитов

№ ОРС	Название продукта	Размер гена, п.н.	Размер белка, а.к.о.	Сходство нуклеотидной последовательности гена с известными: штамм, № в GenBank NCBI, %
Локус 1 – Биосинтез сидерофора
INP59_27105	Аминотрансфераза IV класса	921	306	‒
INP59_27110	Фосфотрансфераза	939	312	Rhodococcus sp. 2G plasmid p1 (CP018064.1, 74.51%)
INP59_27115	SAM-зависимая метилтрансфераза I класса	747	248	‒
INP59_27120	MFS-транспортер	1347	448	Nocardioides sp. TF02-7 (CP092535.1, 71.28%)
INP59_27125 (sid5)	Белок биосинтеза сидерофора семейства IucA/IucC*	1692	563	Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1, 68.86%)
INP59_27130 (sid4)	Монооксигеназа семейства SidA/IucD/PvdA**	1311	436	S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1, 75.25%)
INP59_27135 (sid3)	Ацетилтрансфераза**	555	184	Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1, 69.89%)
INP59_27140 (sid2)	Сидерофорсинтаза*	1800	599	S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1, 73.69%)
INP59_27145 (sid1)	Аминотрансфераза**	1512	503	S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1, 72.95%)
INP59_27150	Альфа/бета-гидролаза**	978	325	‒
INP59_27155	Гидролаза семейства HAD	687	228	‒
Локус 2 – Биосинтез поликетидного соединения
INP59_27520	Белок, содержащий SH3-домен	333	110	R. pyridinivorans YF3, плазмида unnamed1 (CP040720.1, 99.10%), R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 99.10%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 99.10%)
INP59_27530	АТФаза семейства ААА	1326	441	R. pyridinivorans YF3, плазмида unnamed1 (CP040720.1, 99.92%)
INP59_27585	Транскрипционный регулятор, содержащий домен wHTH	312	103	R. pyridinivorans YF3, плазмида unnamed1 (CP040720.1, 98.72%)
INP59_27605	Субстрат-связывающий белок АВС-транспортера	1584	527	R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 97.92%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 97.92%)
INP59_27610	Пермеаза АВС-транспортера	954	317	R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 97.17%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 97.17%)
INP59_27615	Пермеаза АВС-транспортера	837	278	Rhodococcus sp. GA1 (CP097186.1, 96.65%)
INP59_27620	АТФ-связывающий белок АВС-транспортера	933	310	R. rhodochrous LH-B3, плазмида unnamed1 (CP120357.1, 96.46%), R. pyridinivorans YC-JH2, плазмида pRJH1 (CP050179.1, 96.46%)
INP59_27625	Белок, содержащий АТФ-связывающую кассету	783	260	‒
INP59_27630	НАД(Ф)-зависимая оксидоредуктаза семейства SDR*	14484	4827	R. pyridinivorans P23 плазмида pB (CP113800.1, 96.25%)
INP59_27635	Белок, содержащий тиоэфирредуктазный домен**	2292	763	R. pyridinivorans Y6 плазмида unnamed4 (CP096039.1, 96.29%)
INP59_27640	Альфа/бета-гидролаза**	1074	357	R. pyridinivorans Y6 плазмида unnamed4 (CP096039.1, 96.28%)
INP59_27645	Кротонил-КоА-карбоксилаза/редуктаза**	1353	450	R. pyridinivorans Y6 плазмида unnamed4 (CP096039.1, 96.30%)

*Основные гены биосинтеза. **Вспомогательные гены биосинтеза.

Многие детерминанты локуса 2 (INP59_27520–INP59_27620), определяющие синтез поликетидного соединения, проявляют высокую степень сходства с гомологичными генами, локализованными на плазмидах unnamed1 R. pyridinivorans YF3, unnamed1 R. rhodochrous LH-B3, pRJH1, pRDE01 и немного меньшую с плазмидными генами pRho-VOC14-C342, для которых было установлено сходство детерминант, определяющих репликацию, конъюгацию и распределение по дочерним клеткам. Это может говорить об общем происхождении данных плазмид. В то же время основные биосинтетические детерминанты (INP59_27630–INP59_27645) проявляют наибольшую степень подобия с гомологичными генами, расположенными на других плазмидах: pB R. pyridinivorans P23 (CP113800.1), unnamed4 R. pyridinivorans Y6 (CP096039.1), unnamed2 R. pyridinivorans YF3 (CP040721.1).

Больший интерес представляет локус 1 (табл. 2), т.к. гены биосинтеза сидерофора проявляют наибольшую степень сходства (хотя она и не превышает 75%) с последовательностями бактерий S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1), S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1), Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1) и некоторых других стрептомицетов, но не обладают сходством с какими-либо известными генами биосинтеза сидерофоров у родококков. Данный локус расположен на фрагменте плазмиды, который, предположительно, приобретен в результате горизонтального переноса (рис. 1).

В локусе 1 гены sid1–4, по всей видимости, образуют оперон, а ген sid5 транскрибируется во встречном направлении. Такая организация является уникальной для плазмиды pSID, т.к. у известных бактерий ген sid5 (iucC) транскрибируется в том же направлении и находится либо в начале, либо в конце оперона (рис. 2).

Рис. 2. Организация кластера биосинтеза сидерофоров у различных бактерий: 1 – плазмида pSID R. pyridinivorans 5Ар; 2 – Paenactinomyces guangxiensis s-10 (NZ_JACEIQ000000000.1); 3 – Streptomyces ficellus NRRL 8067 (CP034279.1); 4 – Myxococcus hansupus mixupus (CP012109.1).

Для оценки вклада сидерофора, за синтез которого отвечает локус 1, в биологическую активность бактерий R. pyridinivorans 5Ар был проведен инсерционный мутагенез первого гена в опероне ‒ sid1. Полученный мутантный вариант бактерий обозначили R. pyridinivorans 5Ар Rif^R sid::pK18mob.

При инактивации гена sid1 у исследуемых бактерий снижается устойчивость к железу, кадмию и арсенатам (табл. 3). Это согласуется с данными об участии сидерофоров во внеклеточной биосорбции мышьяка, железа, свинца, цинка, кадмия и др. (Presentato, 2020).

Антагонистическая активность мутантных бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям P. carotovorum 2.18 снижается (табл. 4), что говорит об антимикробной активности продуцируемого соединения.

Однако способность подавлять рост тест-штамма не исчезает полностью, что говорит либо о синтезе соединения с более низкой активностью (т.к. ген sid1 относится к вспомогательным генам биосинтеза, а один из основных биосинтетических генов sid5 и вовсе не входит в состав оперона), либо о синтезе других соединений с антимикробной активностью (в частности, локус 2 определяет синтез поликетидного соединения). Интересно и то, что синтез антимикробных метаболитов происходит на полноценной среде (ПДА) и минеральной среде с глюкозой, в то время как на средах с сукцинатом или нафталином бактерии R. pyridinivorans 5Ар таких метаболитов не производят.

Бактерии R. pyridinivorans 5Ар обладают стимулирующим воздействием на корни редиса красного (рис. 3), в то время как мутантный вариант R. pyridinivorans 5Ар Rif^R sid::pK18mob по какой-то причине вызывает достоверное уменьшение длины корней проростков.

Рис. 3. Влияние бактерий рода Rhodococcus на морфометрические показатели проростков редиса красного. К1 – вода; К2 – среда Мейнелла; 1 – 24-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар; 2 – 48-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар; 3 – 24-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар Rif^R sid::pK18mob; 4 – 48-часовая культура бактерий R. pyridinivorans 5Ар Rif^R sid::pK18mob. * ‒ Отличия от К1 достоверны при р ≤ 0.05; ** ‒ отличия от К2 достоверны при р ≤ 0.05; *** ‒ отличия от дикого типа достоверны при р ≤ 0.05. Высота столбцов отражает среднее значение, планки погрешностей – среднеквадратичное отклонение.

На рост гипокотиля негативное влияние оказывала сама среда Мейнелла, в то время как при обработке культурой (как 24-, так и 48-часовой) бактерий R. pyridinivorans 5Ар, а также 24-часовой культурой R. pyridinivorans 5Ар Rif^R sid::pK18mob значения длины гипокотиля не отличаются о контрольных с водой. 48-часовая культура мутантных бактерий R. pyridinivorans 5Ар Rif^R sid::pK18mob оказывает угнетающее, по сравнению с водой, воздействие. Вероятно, инактивация гена sid1 приводит к образованию соединения, обладающего фитотоксичностью.

Таким образом, в результате полногеномного секвенирования в клетках бактерий R. pyridinivorans 5Ар была выявлена плазмида pSID размером 250428 п.н. За репликацию данной плазмиды, по всей вероятности, отвечает ген dnaB, хотя вблизи него не выявлено характерных для oriV структур (повторов, DnaA-боксов, АТ-богатых участков). Гены, которые могут быть вовлечены в репликацию (dnaB, ssb) и разделение плазмид после репликации (parA), проявляют наибольшую степень сходства с детерминантами, расположенными на крупных (224‒343 т.п.н.) плазмидах родококков: unnamed1 R. pyridinivorans YF3, unnamed1 R. rhodochrous LH-B3, pRJH1 R. pyridinivorans YC-JH2, pRDE01 Rhodococcus sp. RDE2 и pRho-VOC14-C342 R. opacus VOC-14.

Плазмида pSID определяет способность бактерий R. pyridinivorans 5Ар синтезировать биологически активное соединение, обладающее антагонистической активностью против фитопатогенных бактерий P. carotovorum 2.18, стимулирующей рост активностью в отношении редиса красного и определяющее устойчивость к ионам железа, кадмия и арсенатам. Нарушение гена sid1 (одного из вспомогательных биосинтетических генов, первого гена в опероне sid1–4) приводит к снижению антагонистической активности бактерий и появлению у них фитотоксических свойств. Гены биосинтеза (sid1–5) данного соединения (предположительно, сидерофора) проявляют наибольшую степень сходства (не более 75%) с последовательностями бактерий S. vilmorinianum YP1 (CP040244.1), S. ficellus NRRL 8067 (CP034279.1), Streptomyces sp. NBC00162 (CP102509.1) и некоторых других стрептомицетов, но не обладают сходством с какими-либо известными генами биосинтеза сидерофоров у родококков. Кроме того, данный локус плазмиды pSID имеет уникальную организацию, т.к. ген sid5 (iucC) транскрибируется во встречном направлении, тогда как у других бактерий он входит в состав оперона и располагается в начале или в конце.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансировании в рамках грантов БРФФИ Б18М-075, Б22МВ-029 и задания 3.6.2 ГПНИ “Биотехнологии” (2021–2023 гг.).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.