Connection between Hexuronate Metabolism and the Ability of Escherichia coli to Adhesion and Biofilm Formation
- Authors: Bessonova T.A.1, Kuznetsova U.D.2, Magkaev A.T.3, Gelfand M.S.4,5, Ozoline O.N.1, Tutukina M.N.1,4,5
-
Affiliations:
- Institute of Cell Biophysics RAS (FSC PSCBS RAS)
- Pirogov Russian National Research Medical University
- HSE University
- Skolkovo Institute of Science and Technology
- Institute for Information Transmission Problems RAS
- Issue: Vol 93, No 4 (2024)
- Pages: 462-467
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/272177
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624040107
- ID: 272177
Cite item
Full Text
Abstract
The formation of bacterial biofilms is an important factor of the chronic infection development, which requires the search for effective ways to prevent it. Here, it was found that hexuronates did not affect the biofilm formation by the probiotic strain Escherichia coli Nissle 1917 and its adhesive properties but reduced the efficiency of biofilm formation by the E. coli K-12 MG1655 strain, enhancing its adhesion to human intestinal carcinoma cells. It was shown that the regulators of hexuronate metabolism, UxuR and YjjM, are involved, along with cAMP-CRP, in the control of motility, adhesion and biofilm formation of E. coli K-12 MG1655. In addition, untranslated RNAs encoded in the uxuR gene play an important role inhibiting the main sigma factor of motility.
Full Text
Формирование биопленок делает бактериальные клетки более защищенными от внешних факторов, что в случае патогенных бактерий приводит к развитию хронических заболеваний, трудно поддающихся антибиотикотерапии. Так, например, активно образующие биопленки уропатогенные штаммы Escherichia сoli являются причиной развития 80% инфекций мочеполового тракта (Kaper et al., 2004). При этом, хотя E. сoli является самой изученной бактерией, мы все еще не понимаем, что запускает процесс формирования биопленок. Для их развития E. coli должна обладать способностью не только к адгезии, но и к подвижности, обеспечивающей доступ к поверхностям (Wood et al., 2006). Транскрипция всех генов, кодирующих белки, вовлеченные в процессы подвижности, находится под контролем сигма-фактора подвижности FliA (RpoF, σ28) (Bertin et al., 1994). В регуляции образования биопленок часто задействован сигма-фактор стационарной фазы (RpoS, σ38), а также белок CsgD, контролирующий экспрессию генов белков, участвующих в сборке завитков (curli-пили), транспорте и синтезе структурных компонентов биопленки (Hammar et al., 1996). Усиленная подвижность, напротив, мешает колонизации, а адгезия бактерий к поверхности является важным начальным этапом образования биопленки, дальнейшее развитие которой зависит совсем от других факторов. За синтез фимбрий отвечают белки FliC и FliD, и при удалении их генов, как и генов белков-адгезинов (fimA, fimI, csgBA), происходит сильное угнетение роста биопленок E. coli (Pratt, Kolter, 1998). В переключении образа жизни бактерий от планктонного к биопленке могут быть задействованы метаболические регуляторы, например, CsrA (Jackson et al., 2002), CRP (Jackson et al., 2002b), BssS (YceP) и BssR (YliH) (Domka et al., 2006), и нетранслируемые РНК CsrB и CsrC, модулирующие функционирование CsrA (Gudapaty et al., 2001).
Важным фактором адгезии бактериальных клеток к различным поверхностям является присутствие тех или иных метаболитов. Например, D-манноза снижает образование биопленок E. coli K-12 MG1655, вероятно, за счет ее связывания с пилями первого типа и блокировки адгезии к эпителиальным клеткам (Rodrigues et al., 2009). Клинические исследования показали, что прием D-маннозы и повышение ее уровня в моче снижают частоту инфекций мочевыводящих путей (Mehta et al., 2018). На исход заболеваний, вызываемых E. coli и Citrobacter rodentium, влияет доступность сахаров пектина – гексуронатов – в рационе (Jimenez et al., 2019).
У E. coli гексуронаты, D-галактуронат и его оптический изомер D-глюкуронат, метаболизируются до 2-кето-3-деоксиглюконата через шунт Эшвелла, а затем до пирувата по пути Энтнера‒Дудорова (Peekhaus, Conway 1998). Способность к их утилизации играет важную роль в колонизации E. coli организма млекопитающих (Peekhaus, Conway 1998; Fabich et al., 2008). Мутации в генах, кодирующих ключевые ферменты превращения галактуроната, приводят к снижению эффективности колонизации кишечника мыши (Fabich et al., 2008), что было подтверждено в более позднем исследовании (Jimenez et al., 2019).
Транскрипция генов всех ферментов и транспортеров пути Эшвелла контролируется белком UxuR, который может образовывать гетеродимеры с ExuR; в регуляцию также вовлечены YjjM и cAMP-CRP (Suvorova et al., 2011; Tutukina et al., 2016). Интересно, что с гена uxuR, помимо основного белкового продукта, синтезируются РНК, способные ингибировать fliA (Tutukina et al., 2023).
Целью исследования была оценка степени участия регуляторов пути Эшвелла в адгезии и формировании биопленок бактериями штамма E. coli K-12 MG1655 и влияния гексуронатов на эффективность этих процессов. Кроме того, мы исследовали роль LeuO, который является регулятором подвижности и способности к колонизации бактерий рода Salmonella (Guadarrama et al., 2014).
Штаммы и условия культивирования. В работе был использован стандартный лабораторный штамм Escherichia coli K-12 substr. MG1655 (U00096.3), его производные с удаленными генами yjjM, crp, uxuR, exuR, leuO, штамм c выключенной трансляцией белка UxuR (K-12 ΔuxuR-tr) и пробиотический штамм E. coli Nissle 1917, чистая культура которого была выделена из препарата “Мутафлор”. Эффективность формирования биопленок оценивали как описано в (Fuentes et al., 2015). Посевным материалом служила 18-часовая культура, выращенная при 37°С и перемешивании 121 об./мин на среде LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт “Oxoid”, Великобритания; 1% NaCl “Хеликон”, Россия). Поскольку одной из целей исследования была оценка влияния источников углерода на формирование биопленок, культуры растили на минимальной среде M9 (48 мM Na2HPO4, 22 мМ KH2PO4, 8.5 мМ NaCl, 18.7 мМ NH4Cl, 2 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2 (все “Amresco”, “Хеликон”, Россия) с добавлением 5% LB и 0.2% источника углерода (D-глюкозы, D-маннозы (“NeoFroxx”, Германия), D-глюкуроната или D-галактуроната (“Sigma”, США). Среды стерилизовали в течение 20 мин при 121°C с помощью автоклава Tuttnauer MK2450 (Израиль). Источники углерода фильтровали через 0.22 мкм PES фильтры (“Millipore”, США). Формирование биопленок оценивали после роста культуры в 96-луночных планшетах (“Sarstedt”, Германия) в течение 48 ч в микроаэробных условиях, для создания которых были использованы пакеты AnaeroGen™ (1 пакет на контейнер объемом 4.8 л; “Oxoid”, Великобритания). Оптическую плотность измеряли при λ = 600 нм на Synergy H1 (“BioTek”, США).
Оценка подвижности, эффективности адгезии и образования биопленок. Подвижность оценивали на чашках Петри с 0.3% LB-агаром, как описано ранее (Fuentes et al., 2015). Адгезию к клеткам линии карциномы кишечника человека CaCo-2 оценивали по протоколу, описанному в работе (Verma et al., 2016). Интенсивность формирования биопленок оценивали после окрашивания кристаллическим фиолетовым (Fuentes et al., 2015) при λ = 570 нм на Synergy H1 (“BioTek”, США).
Анализ экспрессии генов. РНК выделяли с помощью TriZol (“Invitrogen”, США) из всего содержимого лунки (планктонная культура вместе с биопленкой). Для обратной транскрипции было взято 50 нг РНК (с учетом выделения из одной лунки планшета, это максимально возможное количество). Реакцию проводили с геноспецифическими праймерами (табл. 1) в соответствии с протоколом производителя.
Таблица 1. Праймеры для ОТ-ПЦР в реальном времени
Название праймера | Последовательность нуклеотидов |
hns_PCR | 5ꞌ-CGCAGGCAAGAGAATGTAC-3ꞌ |
hns_RT | 5ꞌ-GCAGTTCGTTCGGGTCAATA-3ꞌ |
fliA_PCR | 5ꞌ-CTATGCTGGATGAACTCGCA-3ꞌ |
fliA_RT | 5ꞌ-GCGTTGCGGCCAAGTTCCTG-3ꞌ |
csgD_F | 5ꞌ-CTTTGCAGGCGACAGCTCTC-3ꞌ |
csgD_R | 5ꞌ-TCCTGCTCAAAGTATCCTGC-3ꞌ |
csrC_F | 5ꞌ-CCATAGAGCGAGGACGCT-3ꞌ |
csrC_R | 5ꞌ-ACGGGTCTTACAATCCTTG-3ꞌ |
Реакцию количественной ПЦР проводили на амплификаторе DT-lite (“ДНК-Технология”, Россия) с использованием qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”, Россия), как описано в работе (Bessonova et al., 2023). В качестве отрицательного контроля использовали пробы с РНК, проведенные через реакцию обратной транскрипции без добавления фермента. В качестве house-keeping референса использовали hns (Tutukina et al., 2016). Количественный анализ уровня экспрессии проводили при помощи метода 2–ΔΔCt относительно дикого типа (wt) варианта K-12.
Статистическую обработку проводили в Microsoft Excel с использованием непарного критерия Стьюдента (различия считали значимыми при p ≤ 0.05). Каждый эксперимент проводили не менее чем в трех биологических и четырех технических повторах.
Влияние источников углерода и исследуемых факторов транскрипции на способность E. coli к адгезии к клеткам кишечной карциномы человека CaCo-2. На первом этапе мы оценили влияние делеции генов, кодирующих потенциальные регуляторы процессов адгезии и формирования биопленок, на эффективность прикрепления клеток E. coli штамма K-12 MG1655 к клеткам кишечного эпителия человека. Делеция leuO немного увеличивала эффективность адгезии (рис. 1а), что согласуется с данными группы А. Ишихамы (Shimada et al., 2011). В мутантах по генам регуляторов uxuR и exuR статистически значимого изменения эффективности адгезии не происходило, и мы наблюдали очень большие разбросы в результатах.
Рис. 1. а – Оценка влияния удаления leuO, uxuR, crp, exuR, yjjM на адгезию E. coli K-12 к клеткам кишечного эпителия CaCo-2; б – подвижность клеток E. coli K-12 в 0.3% LB агаре; в – адгезия E. coli K-12 MG1655 и E. coli Nissle 1917 к клеткам CaCo-2 в присутствии 0.2% D-галактуроната, D-глюкуроната или D-маннозы.
Статистически достоверное снижение прикрепления происходило при удалении гена глобального регулятора CRP и, особенно, при удалении гена одного из регуляторов метаболизма гексуронатов YjjM (рис. 1а). Оказалось, что делеция yjjM существенно увеличивает подвижность E. coli K-12 MG1655 (рис. 1б), а комплементация плазмидой pLAX_YjjM приводит к возврату подвижности на уровень дикого типа.
YjjM контролирует метаболизм L-галактоната, в частности, его превращение в D-тагатуронат, который также может образовываться из D-галактуроната в пути Эшвелла. Данные, полученные в работе (Jimenez et al., 2019), свидетельствовали о способности гексуронатов усиливать адгезивные свойства клеток дикого типа, но особенно интересно было оценить их влияние на способность к прикреплению мутантных штаммов. Как видно из рис. 1в, добавление гексуронатов, действительно, на несколько порядков повышало количество клеток штамма K-12 MG1655, прикрепленных к эпителию кишечника человека, а манноза, как и предполагалось, на адгезию практически не влияла. В отсутствие uxuR и yjjM активаторного эффекта гексуронатов на адгезию E. coli K-12 MG1655 либо не наблюдалось, либо он был существенно ниже (рис. 1в).
Таким образом, YjjM ингибирует подвижность и активирует способность клеток E. coli K-12 MG1655 к адгезии, а также, наряду с UxuR, необходим для активации адгезии в присутствии гексуронатов. При этом прикрепление к клеткам эпителия кишечника пробиотического штамма Nissle 1917 не зависело от присутствия в среде гексуронатов (рис. 1в).
Влияние источников углерода и исследуемых факторов транскрипции на способность E. coli к образованию биопленок. Как и в случае с адгезией, удаление leuO и exuR не приводило к существенным изменениям эффективности формирования биопленок бактериями E. coli K-12 MG1655, а при удалении uxuR наблюдался сильный разброс полученных значений (рис. 2а). Удаление crp и yjjM существенно снижало образование биопленок, что подтверждает их способность активировать данный процесс. При добавлении к среде субстрата гликолиза, D-глюкозы, рост биопленок также значительно снижался (рис. 2б), что было ожидаемо вследствие снижения потребности в источнике питания (Jackson et al., 2002b).
Рис. 2. а – Формирование биопленок (данные по трем планшетам в одном эксперименте). Штаммы описаны в легенде; б – влияние источника углерода на эффективность образования биопленок E. coli K-12 MG1655 и E. coli Nissle 1917; в ‒ схема участков гена uxuR, удаленных в штаммах E. coli K-12 MG1655 ΔuxuR и ΔuxuR_tr. По оси ординат отложены скоры PlatProm, отражающие вероятность инициации транскрипции в конкретной точке. Место синтеза регуляторных РНК выделено розовым; г – динамика экспрессии генов csgD, fliA и csrC в E. coli K-12 MG1655 при удалении uxuR, crp и yjjM.
Несмотря на то что гексуронаты являются менее энергодающими субстратами, эффект D-галактуроната оказался сравнимым с D-глюкозой. При добавлении D-глюкуроната образование биопленок уменьшалось до уровня, сопоставимого с их ростом в присутствии D-маннозы (рис. 2б), которая уже используется в качестве добавки при лечении хронических бактериальных заболеваний. На штамм E. coli Nissle 1917 гексуронаты не влияли.
Влияние CRP, YjjM, UxuR и малых РНК на экспрессию генов ключевых регуляторов подвижности и образования биопленок. На рис. 2г приведена динамика изменения экспрессии генов, кодирующих основные регуляторы процессов биопленкообразования (CsgD) и подвижности (FliA), а также малую РНК CsrC, в делеционных мутантах по генам uxuR, yjjM и crp. Эффекты от удаления leuO и exuR незначительны (данные не приведены), что согласуется с результатами экспериментов по адгезии и формированию биопленок. Поскольку ген uxuR кодирует не только фактор транскрипции, но и регуляторные РНК, ингибирующие подвижность бактерий за счет связывания с промоторной областью fliA (Tutukina et al., 2023), мы использовали два варианта мутантов ‒ с полностью удаленным геном (ΔuxuR) и с выключенной трансляцией белка (ΔuxuR-tr) (схема приведена на рис. 2в). При удалении uxuR наблюдалась сильная активация fliA, сопровождавшаяся сильной дисперсией, что согласуется с данными экспериментов по образованию биопленок. В трансляционном же мутанте эта активация пропадает и повышается уровень csgD-мРНК, что подтверждает ингибиторную роль закодированных в uxuR малых РНК в отношении подвижности кишечной палочки дикого типа. В мутанте по yjjM такой сильной дисперсии уже не наблюдается: почти во всех случаях происходит активация fliA, как и ожидалось по результатам других экспериментов. Кроме того, YjjM, по-видимому, напрямую активирует малую РНК CsrC: при удалении yjjM экспрессия ее гена ингибирована более, чем в 50 раз (рис. 2г). При удалении crp активируется сsgD, но ингибируется csrC, что согласуется с показанным ранее опосредованным влиянием CRP на образование биопленок.
Таким образом, гексуронаты влияют на процессы адгезии дикого типа E. coli K-12 MG1655 и ее способность к формированию биопленок. Поскольку D-глюкуронат, усиливая адгезию дикого типа E. coli, одновременно снижал формирование им биопленок (рис. 1) и не влиял на пробиотический штамм E. coli Nissle 1917 (рис. 1в и 2б), его можно рассматривать в качестве потенциальной пребиотической добавки. YjjM и глобальный регулятор cAMP-CRP являются активаторами процессов формирования биопленок и адгезии, а ключевой регулятор пути Эшвелла UxuR и закодированные в гене uxuR нетранслируемые РНК необходимы для нормального функционирования этих процессов. Полученные нами данные полностью подтверждают то, что метаболизм гексуронатов по пути Эшвелла и Энтнера‒Дудорова играет важную роль в успешной колонизации E. coli кишечника хозяев.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы благодарны А. Шатровой и И. Ларичевой за помощь в проведении экспериментов.
ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ
Работа выполнена при поддержке РФФИ АНФ-а 20-54-14005 и Госзадания № 075-00957-23-01.
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Данная статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы данной статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.
About the authors
T. A. Bessonova
Institute of Cell Biophysics RAS (FSC PSCBS RAS)
Author for correspondence.
Email: tatianabessonova66@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290
U. D. Kuznetsova
Pirogov Russian National Research Medical University
Email: tatianabessonova66@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117997
A. T. Magkaev
HSE University
Email: tatianabessonova66@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117418
M. S. Gelfand
Skolkovo Institute of Science and Technology; Institute for Information Transmission Problems RAS
Email: tatianabessonova66@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 121205; Moscow, 127051
O. N. Ozoline
Institute of Cell Biophysics RAS (FSC PSCBS RAS)
Email: tatianabessonova66@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290
M. N. Tutukina
Institute of Cell Biophysics RAS (FSC PSCBS RAS); Skolkovo Institute of Science and Technology; Institute for Information Transmission Problems RAS
Email: tatianabessonova66@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290; Moscow, 121205; Moscow, 127051
References
- Bertin P., Terao E., Lee E. H., Lejeune P., Colson C., Danchin A., Collatz E. The H-NS protein is involved in the biogenesis of flagella in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 5537–5540.
- Bessonova T. A., Rybina A. A., Marakulina D. A., Kaznadzey A. D., Gelfand M. S., Ozoline O. N., Tutukina M. N. Phylogeny and cross-regulation of the YjjM and LeuO transcription factors translated as multiple protein forms from one gene in Escherichia coli // Math. Biol. Bioinforma. 2023. V. 18. P. 1–14.
- Domka J., Lee J., Wood T. K. YliH (BssR) and YceP (BssS) Regulate Escherichia coli K-12 biofilm formation by influencing cell signaling // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 2449–2459.
- Fabich A. J., Jones S. A., Chowdhury F. Z., Cernosek A., Anderson A., Smalley D., McHargue J.W., Hightower G. A., Smith J. T., Autieri S. M., Leatham M. P., Lins J. J., Allen R. L., Laux D. C., Cohen P. S., Conway T. Comparison of carbon nutrition for pathogenic and commensal Escherichia coli strains in the mouse intestine // Infect. Immun. 2008. V. 76. P. 1143‒1152.
- Fuentes D. N., Calderón P. F., Acuña L. G., Rodas P. I., Paredes-Sabja D., Fuentes J. A., Gil F., Calderón I. L. Motility modulation by the small non-coding RNA SroC in Salmonella typhimurium // FEMS Microbiol. Lett. 2015. V. 362. Art. fnv135.
- Guadarrama C., Villasenor T., Calva E. The subtleties and contrasts of the LeuO regulator in Salmonella typhi: implications in the immune response // Front. Immunol. 2014. V. 5. Art. 581.
- Gudapaty S., Suzuk, K., Wang X., Babitzke P., Romeo T. Regulatory interactions of Csr components: the RNA binding protein CsrA activates csrB transcription in Escherichia coli // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 6017–6027.
- Hammar M., Bian Z., Normark S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 6562–6566.
- Jackson D. W., Suzuki K., Oakford L., Simecka J. W., Hart M. E., Romeo T. Biofilm formation and dispersal under the influence of the global regulator CsrA of Escherichia coli // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 290–301.
- Jackson D. W., Simecka J. W., Romeo T. Catabolite repression of Escherichia coli biofilm formation // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 3406–3410.
- Jimenez A. G., Ellermann M., Abbott W., Sperandio V. Diet-derived galacturonic acid regulates virulence and intestinal colonization in enterohaemorrhagic Escherichia coli and Citrobacter rodentium // Nat. Microbiol. 2019. V. 5. P. 368–378.
- Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L.T. Pathogenic Escherichia coli // Nat. Rev. Microbiol. 2004. V. 2. P. 123–140.
- Mehta I., Zimmern P., Reitzer L. Enzymatic assay of D-mannose from urine // Bioanalysis. 2018. V. 10. P. 1947‒1954.
- Peekhaus N., Conway T. What’s for dinner?: Entner‒Doudoroff metabolism in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 3495‒502.
- Pratt L. A., Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili // Mol. Microbiol. 1998. V. 30. P. 285–293.
- Rodrigues D. F., Elimelech M. Role of type 1 fimbriae and mannose in the development of Escherichia coli K12 biofilm: from initial cell adhesion to biofilm formation // Biofouling. 2009. V. 25. P. 401‒411.
- Suvorova I. A., Tutukina M. N., Ravcheev D. A., Rodionov D. A., Ozoline O. N., Gelfand M. S. Comparative genomic analysis of the hexuronate metabolism genes and their regulation in gammaproteobacteria // J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 3956‒3963.
- Shimada T., Bridier A., Briandet R., Ishihama A. Novel roles of LeuO in transcription regulation of E. coli genome: antagonistic interplay with the universal silencer H-NS // Mol. Microbiol. 2011. V. 82. P. 378‒397.
- Tutukina M. N., Potapova A. V., Cole J. A., Ozoline O. N. Control of hexuronate metabolism in Escherichia coli by the two interdependent regulators, ExuR and UxuR: derepression by heterodimer formation // Microbiology (Reading). 2016. V. 162. P. 1220–1231.
- Tutukina M. N., Dakhnovets A. I., Kaznadzey A. D., Gelfand M. S., Ozoline O. N. Sense and antisense RNA products of the uxuR gene can affect motility and chemotaxis acting independent of the UxuR protein // Front. Mol. Biosci. 2023. V. 10. Art. 1121376.
- Verma R., Rojas T. C.G., Maluta R. P., Leite J. L., Da Silva L. P.M., Nakazato G., Dias Da Silveira W. Fimbria-encoding gene yadC has a pleiotropic effect on several biological characteristics and plays a role in avian pathogenic Escherichia coli pathogenicity // Infect. Immun. 2016. V. 84. P. 187–193.
- Wood T. K., González Barrios A. F., Herzberg M., Lee J. Motility influences biofilm architecture in Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 361–367.
Supplementary files
