Anaerobic oxidation of oil by microbial communities of bottom sediments of a natural oil seepage site (Bolshaya Zelenovskaya, Middle Baikal)

Full Text

Оз. Байкал – озеро тектонического происхождения в южной части Восточной Сибири, является крупнейшим природным резервуаром пресной воды. Три пресноводные озера в мире, включая оз. Байкал, а также рифтовое глубоководное озеро Танганьика и мелководное озеро Чапала, характеризуются природными выходами нефти. На оз. Байкал установлены два района естественных нефтепроявлений; один расположен в устье р. Большая Зеленовская (БЗ) и известен с конца XVIII века, второй – у м. Горевой Утес (ГУ) (открыт в 2005 г.) (Хлыстов и соавт., 2007).

Естественный выход нефти у устья реки Бол. Зеленовская, несмотря на свое более длительное существование, остается менее изученным в плане геологического строения донных отложений и рельефа дна в сравнении с нефтепроявлением ГУ. Разгрузка нефти в виде всплывающих нефтяных капель обнаруживается только на водной поверхности напротив устья реки Бол. Зеленовская на расстоянии ∼2 км от береговой линии (рис. 1).

 

Рис. 1. Карта-схема расположения районов нефтепроявлений в оз. Байкал (а); схема района нефтепроявления напротив устья реки Бол. Зеленовская: ○ – место отбора проб; △ – место расположения нефтегазового сипа. Серой линией показано направление подводного каньона (б).

 

Место выхода нефти на дне долгое время не было установлено. Опробование донных осадков, проведенное с целью уточнения места разгрузки нефти, выявило следы углеводородов в осадках подводного каньона, который является продолжением речной долины (БЗ_К) (рис. 1). Скопления нефти и газовых гидратов были установлены также в верхнем слое донных отложений, находящихся в 3.5 км от берега в районе устья р. Бол. Зеленовская на глубине 420 м, которые обозначены как холодный нефтегазовый сип “Зеленсип” (Хлыстов и соавт., 2022).

Образцы нефти, собранные как с поверхности озера в районе Бол. Зеленовской, так и в верхнем слое донных отложений “Зеленсип”, представляют собой биодеградированную ароматико-нафтеновую нефть (Хлыстов и соавт., 2022). В подводных каньонах, как и в осадках холодного нефтегазового сипа, где скопления углеводородов находятся длительное время и не поступают на поверхность водной толщи, может функционировать микробное сообщество, деятельность которого обусловливает высокую степень трансформации нефти в анаэробных условиях. В отсутствие кислорода нефтяные углеводороды могут окисляться микроорганизмами при использовании в качестве акцепторов электронов HCO₃^–, SO₄^2–, NO₃^– и Fe³⁺ (Zhang et al., 2019). Проведенные ранее исследования показали, что аэробные углеводородокисляющие микроорганизмы вносят значительный вклад в самоочищение озера от нефтяного “загрязнения” (Павлова и соавт., 2012). Вместе с тем, исследования микроорганизмов, участвующих в деградации нефти в анаэробной зоне осадочной толщи озера Байкал, находятся на начальном этапе (Pavlova et al., 2022).

Сравнение микробного разнообразия нефтяных коллекторов в разных частях мира показало корреляцию состава прокариотических сообществ с температурой и глубиной пласта и отсутствие влияния географического расстояния между нефтяными резервуарами. Показано, что основной микробиом включает три класса бактерий (Gammaproteobacteria, Clostridia и Bacteroidia) и класс архей (Methanomicrobia), повсеместно распространенных в нефтяных коллекторах (Sierra-Garcia et al., 2017). По результатам метагеномного анализа известно, что состав микробных сообществ и их потенциальная функциональная активность меняются в зависимости от физико-химических условий нефтяных пластов и степени воздействия при эксплуатации нефтяных месторождений (Hidalgo et al., 2021; Gittins et al., 2023). Библиотеки ампликонов гена 16S рРНК и метагеномные библиотеки микроорганизмов нефтяных резервуаров не содержали общих основных таксонов на уровне вида, рода, семейства или отряда. На уровне высших таксонов только представители филумов Pseudomonadota, Bacillota и Halobacteriota встречались наиболее часто (75% от всех ампликонов гена 16S рРНК) в основном микробиоме нефтяных резервуаров (Gittins et al., 2023).

Естественные нефтепроявления оз. Байкал не подвергаются антропогенному воздействию. Донные осадки оз. Байкал, ассоциированные с разгрузкой углеводородов, содержат автохтонное микробное сообщество, в котором ключевые участники деградации нефти могут быть отличными или схожими с микроорганизмами других нефтяных экосистем, не подвергшихся воздействию.

Цель исследования – изучить разнообразие и потенциальную функциональную активность микробного сообщества района нефтепроявления донных осадков в устье р. Большая Зеленовская (БЗ) в процессах анаэробного окисления нефти в присутствии различных акцепторов электронов.

Материалы и методы исследования

Отбор проб. Для исследования отобраны два образца донных осадков из керна St.4 GC. 6, полученного с помощью гравитационной трубы с борта НИС “Г.Ю. Верещагин” (∼1.4 км от берега, глубина водной толщи 320 м, Средний Байкал) в 2020 г. (рис. 1). Первый интегральный образец (К1) соответствовал глубине керна 30–50 см, второй (К2) – 250–270 см.

Получение накопительных культур. Для получения накопительных культур образцы донных осадков асептически отбирали из центральной части керна и сразу помещали во флаконы объемом 116 мл, содержащие 50 мл стерильной анаэробной минеральной среды следующего состава (г/л): NaCl – 0.25, KCl – 0.1, NH₄Cl – 0.1, KH₂PO_{4 –} 0.1, MgCl₂ · 6H₂O – 0.2, CaCl₂ · 2H₂O – 0.1, NaHCO₃ – 1, Na₂S · 9H₂O – 0.5 мМ, резазурин – 0.001, раствор витаминов – 1 мл, раствор микроэлементов по Пфеннигу (Практикум…, 2005) – 1 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками, продували очищенным от кислорода азотом и встряхивали 15 мин при 160–180 об./мин на орбитальном шейкере (OS-20, “BioSan”, Рига, Латвия). Полученную суспензию с помощью шприца переносили во флаконы с минеральной средой (50 мл) указанного выше состава, содержащей различные акцепторы электронов: H₂ : CO₂ (80 : 10, об.); Na₂SO₄ (20 ммоль), газовая фаза N₂ : CO₂ (90 : 10, об.); NaNO₃ (2.3 ммоль), газовая фаза N₂ (100%, об.). Аморфный оксид Fe(III) (10 ммоль), полученный согласно (Slobodkin et al., 1997), вносили в минеральную среду, не содержащую восстанавливающих агентов, газовая фаза СО₂ (100%, об.). Таким образом, были получены 8 накопительных культур (таблица).

 

Таблица. Условные обозначения полученных накопительных культур

Глубина отбора проб донных осадков/условное обозначение	Акцептор электронов
	H2 : СO2	SO42–	NO3–	Fe3+
St.4 GC.6, 30–50 см/К1	К1_HCO3	К1_SO4	К1_NO3	К1_Fe
St.4 GC.6, 250–270 см/К2	К2_HCO3	К2_SO4	К2_NO3	К2_Fe

 

В качестве источника углерода использовали 50 мкл (38 мг, ρ = 760 мкг/мкл) нефти (“Ангарская нефтехимическая компания”, Россия), стерилизованной фильтрованием через фильтр-насадку (0.2 мкм, Minisart, “Sartorius Stedim”). Эксперименты проводили в трех повторностях при температуре 10°C в темноте без перемешивания. В качестве отрицательного контроля использовали стерильную среду с нефтью без добавления проб осадков.

Аналитические методы. Газообразные углеводороды в экспериментальных флаконах и донных осадках определяли модифицированным методом фазово-равновесной дегазации; погрешность определения концентрации метана составляла ±5% (Большаков, Егоров, 1987). Содержание полициклических ароматических углеводородов и н-алканов в модельных экспериментах определяли согласно (Pavlova et al., 2022). Химический состав поровых вод донных отложений определяли, как описано ранее (Pogodaeva et al., 2017). Исследования проведены на базе приборного центра коллективного пользования физико-химического ультрамикро-анализа ЛИН СО РАН (ЦКП “Ультрамикроанализ”).

Выделение ДНК, амплификация и секвенирование гена 16S рРНК. Выделение ДНК, амплификацию, секвенирование и биоинформатический анализ проводили согласно (Lomakina et al., 2023). Полученные препараты ДНК использовали для амплификации V2−V3 участка гена 16S рРНК бактерий с использованием праймеров 16S_BV2f (50-AGTGGCGGACGGGTGAGTAA-30) и 16S_BV3r (50-CCGCGGCTGCTGGCAC-30) (Sahm et al., 2013) и V5−V6 участка гена 16S рРНК архей с использованием праймеров Arch-0787f (50-ATTAGATACCCSBGTAGTCC-30) и Arch-1059r (50-GCCATGCACCWCCTCT-30) (Yu et al., 2005). Библиотеки секвенировали с использованием стандартного набора Illumina MiSeq v.3 (“Illumina”) в ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология“ ФГБНУ ВНИИСХМ. Таксономия приведена согласно геномной базе GDTB (https://gtdb.ecogenomic.org/). Уровень покрытия для всех библиотек фрагментов гена 16S рРНК был почти максимальным (от 98.08 до 99.9%), что подтверждалось низкими значениями индекса Chao1, и свидетельствовало о полной репрезентативности библиотек (табл. S1). Полученные нуклеотидные последовательности доступны в базе данных NCBI в рамках проекта PRJNA1056780.

Для сравнения разнообразия сообществ донных осадков и накопительных культур на уровне филума и рода построены пузырьковые диаграммы для операционных таксономических единиц с относительной численностью ≥1% хотя бы в одной библиотеке с использованием программных пакетов ggplot2 и reshape2 для языка R (R Core Team, 2022) в среде Rstudio (https://www.R-project.org/). Программа iVikodak позволяет на основании таксономического состава исследуемых бактериальных сообществ предсказывать их функциональные характеристики, используя геномные базы данных. С использованием базы данных KEGG (Kanehisa, Goto, 2000) с помощью PICRUSt2 алгоритма (Douglas et al., 2020) был выполнен поиск ближайшего гомологичного аннотированного референсного генома для каждой ОТЕ_0.03. Визуализация полученных результатов в виде тепловой карты выполнена с использованием программных пакетов сluster, vegan и pheatmap в R. Все ресурсоемкие операции выполнены с использованием высокопроизводительного кластера “Академик В.М. Матросов“ Центра коллективного пользования “Иркутский суперкомпьютерный центр СО РАН”.

Результаты

Литолого-химическая характеристика донных осадков. Донные осадки керна St.4 GC.6 представлены восстановленными с поверхности глинами с Eh –146…–216 мВ. Окисленный слой отсутствовал. На глубине 50 и 250 см присутствовали песчаные прослои со следами нефти. Осадки характеризовались низкой газонасыщенностью, концентрация метана составляла 0.08 мг/л осадка на глубине 10 см и 5.2–9.4 мг/л осадка на глубине 50–250 см. Гомологи метана в газе в глубинных слоях осадка представлены этаном в следовых количествах.

Поровые воды отложений у поверхности пресные гидрокарбонатно-кальциевые первого типа меняются с глубиной на пресные гидрокарбонатно-натриевые первого типа. Минерализация у поверхности осадка (105 мг/л) схожа с фоновой в Среднем Байкале (90–180 мг/л) (Pogodaeva et al., 2017). С глубиной она аномально нарастает на порядок (до 1030 мг/л на 250 см). Концентрация ионов гидрокарбоната увеличивается с глубиной от 73 мг/л, достигая максимальных значений 700 мг/л на глубине 250 см. Концентрация ионов хлора увеличивается от 0.6 до 86 мг/л на глубине 270 см (рис. S1а). Нитрат-ионы варьируют от 0.2 до 0.6 мг/л по всему профилю керна. Наибольшая концентрация сульфатов выявлена в поверхностном осадке (6.6 мг/л); по глубине керна она снижалась от 0.9 до 0.3 мг/л. Исследуемые осадки обогащены ионами Mn(II) и Fe(II), максимальные концентрации которых отмечены на глубине 50 см (1.3 и 6.7 мг/л соответственно) (рис. S1б).

Деградация углеводородов в условиях эксперимента. Накопительные культуры, полученные на средах с разными акцепторами электронов и нефтью, в течение одного года показали различную степень конверсии н-алканов и ПАУ (рис. 2).

 

Рис. 2. Убыль н-алканов (а, б) и ПАУ (в, г) в накопительных культурах, содержащих подповерхностные и глубинные осадки, обогащенные гидрокарбонат-, сульфат-, нитрат- ионами и Fe(III).

 

В культурах, полученных путем заражения сред подповерхностным осадком K1, наибольшая убыль н-алканов (32–36%) отмечена в среде с нитратом и H₂:СO₂ в газовой фазе. В этих культурах содержание Σ_алк в нефти снизилось до 3.3–3.5 мг в сравнении с контролем (5.2 мг). В сульфатредуцирующей (К1_SO₄) и железоредуцирующей культуре (К1_Fe) содержание алкановой фракции уменьшилось на 17–20%. В культурах из глубинного осадка (K2) максимальная конверсия н-алканов (48%) отмечена в среде с Fe³⁺. В присутствии других акцепторов электронов ( HCO₃^–, SO₄^2–, NO₃^–) биодеградация н-алканов составляла 27–29% (рис. 2а, 2б).

Деградация ПАУ (55–65%) была сопоставима в накопительных культурах K1 и K2 (рис. 2в, 2г). Наибольшая конверсия полициклических ароматических углеводородов (64–65%) зафиксирована в культурах К1_NO₃ и К2_HCO₃, где отмечено снижение Σ_ПАУ с 0.4 мг в контроле до 0.14–0.15 мг в эксперименте. Среди индивидуальных полициклических углеводородов наибольшая степень конверсии (55–79%) отмечена для нафталина, 1-метилнафталина, 2-метилнафталина, флуорена, антрацена, бензо[а]антрацена, бензо[b]флуорена, бензо[k]флуорена, бензо[а]пирена и бензо[ghi]перилена в культурах K1 и K2, вне зависимости от присутствующих в среде акцепторов электронов. Наименьшей деградации (1–14%) подверглись 1-метилфенантрен, 9-метилфенантрен, пирен и бензо[е]пирен в накопительных культурах K1. Добавление нитрат-иона увеличивало степень конверсии до 25%. В культурах K2 деградация этих соединений составила 12–29%.

В накопительной культуре К1_HCO₃ выявлено образование метана. Концентрация метана в начале эксперимента составляла 0.04 мг/л осадка. Через двенадцать месяцев культивирования содержание метана увеличилось до 37.9 мг/л. К концу эксперимента концентрация CH₄ составляла 27.2 мг/л (рис. 3а). В накопительных культурах К2_HCO₃ концентрация метана в течение всего эксперимента оставалась практически неизменной (0.02–0.05 мг/л осадка), что свидетельствует об отсутствии метаногенеза (рис. 3б).

 

Рис. 3. Динамика образования метана и этана в накопительных культурах, содержащих подповерхностные (а) и глубинные (б) осадки, обогащенных гидрокарбонат-ионом.

 

Образование этана выявлено в накопительных культурах как с подповерхностным, так и с глубинным осадком (рис. 3). В культуре К1_HCO₃ через 6 мес. культивирования концентрация С₂Н₆ увеличилась в 7 раз в сравнении с исходной (0.002 мг/л осадка) и составила 0.014 мг/л осадка. К концу эксперимента содержание этана снизилось до 0.003 мг/л. В культуре К2_HCO₃ концентрация этана увеличилась в 2 раза. Максимальное его содержание (0.02 мг/л осадка) зафиксировано по истечении 6 мес. от начала эксперимента. К концу эксперимента концентрация этана в накопительных культурах К1_HCO₃ и К2_HCO₃ составляла 0.003–0.01 мг/л осадка соответственно.

Филогенетическое разнообразие микробного сообщества подповерхностного осадка и накопительных культур К1. В составе микробного сообществ донного осадка с глубины 30–50 см были обнаружены представители 41 филума домена Bacteria и 10 филумов домена Archaea, среди которых только 17 и 6 филумов, соответственно, включали более 1% последовательностей в составе библиотек. В сообществе доминировали бактерии филумов Chloroflexota, Pseudomonadota, Actinomycetota, Nitrospirota, Acidobacteriota, Bacteroidota и Desulfobacterota (рис. 4а).

 

Рис. 4. Относительная доля последовательностей фрагментов гена 16S рРНК Bacteria, представленных на уровне филумов (а) и родов (б) в библиотеках из донных осадков и накопительных культур. Перечислены таксоны, составляющие >1% хотя бы в одной из библиотек.

 

Культивирование подповерхностного осадка в присутствии разных акцепторов электронов привело к увеличению доли представителей некоторых таксонов, в частности, Bacillota и Pseudomonadota (рис. 4а). В контрольном осадке доля представителей Bacillota составляла 0.3% от всех последовательностей гена 16S рРНК, филум представлен не идентифицированными родами семейства Clostridiaceae. В культуре К1_HCO₃ доля Bacillota увеличивалась до 15.3%. Доминирующее положение в ней занимали представители родов Desulfosporosinus (2.5%), Gracilibacter (1%), Ruminiclostridium (1.4%) и неидентифицированные Clostridia (4.4%) (рис. 4б). В культуре К1_SO₄ доля бактерий рода Desulfosporosinus возрастала до 5.8% в сравнении с К1_HCO₃. В числе доминирующих ОТЕ выявлены последовательности бактерий родов Anaerosolibacter (3.6%), Alkaliphilus (3%), Lutispora (2.4%), неклассифицируемых бактерий семейства Lachnospiraceae (2.2%) и SRB2 (2%). В культуре К1_Fe доля Bacillota составляла 51.5% и была самой бо́льшей в сравнении с другими культурами K1. Наряду с последовательностями Anaerosolibacter и Desulfosporosinus выявлены последовательности бродильных бактерий рода Tissierella и неидентифицированных Lachnospiracea. Бактерии рода Anaerosolibacter способны осуществлять анаэробное дыхание, восстанавливая трехвалентное железо, сульфат, тиосульфат и элементную серу за счет окисления органических соединений (Hong et al., 2015). Сульфатвосстанавливающие бактерии рода Desulfosporosinus используют углеводы, короткоцепочечные жирные кислоты и ароматические соединения, способны расти хемолитотрофно, окисляя водород (Spring, Rosenzweig, 2006). Бактерии родов Gracilibacter, Ruminiclostridium, Alkaliphilus и Lutispora характеризуются как строго анаэробные хемоорганотрофные термотолерантные микроорганизмы. В культуре К1_NO₃ основную долю (19.5%) составляли последовательности строго анаэробных хемоорганотрофных бактерий рода Vulcanibacillus, использующих нитрат в качестве единственного акцептора электронов (L’Haridon et al., 2006).

Филум Pseudomonadota в контрольном осадке К1 был представлен неидентифицированными представителями класса Gammaproteobacteria и семейств Methylomonadaceae и Steroidobacteraceae. Культивирование осадка К1 с H₂ : СO₂ в газовой фазе привело к увеличению содержания сероокисляющих бактерий родов Sulfuricella, Sulfuriferula и ANPR. В базе данных рРНК SILVA последовательности, связанные с Allorhizobium, Neorhizobium, Pararhizobium и Rhizobium, помещены в отдельный род ANPR в пределах семейства Rhizobiaceae. Бактерии этого семейства характеризуются как хемоорганогетеротрофы, способные к биодеградации нефтяных углеводородов в почве (Wang et al., 2021). В накопительной культуре К1_NO₃ доля Pseudomonadota составляла 56%. Наиболее многочисленная ОТЕ (54%) отнесена к роду Thiobacillus и имела 97.2% сходства с геном 16S рРНК хемолитотрофной бактерии Thiobacillus denitrificans, сочетающей окисление соединений серы с денитрификацией (Robertson, Kuenen, 2006).

Филумы Acidobacteriota, Actinomycetota, Atribacterota, Chloroflexota, Nitrospirota и Desulfobacterota, как в контрольном осадке, так и накопительных культурах, были представлены одними и теми же родами бактерий. Наблюдались количественные изменения в составе доминирующих родов в накопительных культурах. Филум Acidobacteriota состоял из неидентифицированных представителей семейства Acidobacteriaceae и анаэробных, хемоорганогетеротрофных бактерий порядка Candidatus Aminicenantales (OP8), которые в настоящее время отнесены к Candidatus Aminicenantota (Oren, Goker, 2023). Последовательности Ca. Aminicenantota наиболее часто выявляются при анализе обогащенных углеводородами биотопов, включающих нефтяные резервуары, глубоководные морские гидротермальные экосистемы и др. (Kadnikov et al., 2019). ОТЕ из филума Actinomycetota в основном принадлежали бактериям группы OPB₄₁ и хемоорганотрофным бактериям рода Gaiella. Представители рода Pseudarthrobacter (Actinomycetota) выявлены только в культуре К1_HCO₃. Филотипы OPB₄₁ были обнаружены в нефтеносных, осадочных и подповерхностных средах. Культивируемые представители группы OPB₄₁ являются анаэробными литотрофами, фиксирующими CO₂ через восстановительный глициновый путь и использующими тиосульфат, элементную серу, либо Fe(III) в качестве акцепторов электронов (Khomyakova et al., 2022). Для психрофильных бактерий рода Pseudarthrobacter показана способность к биодеградации фенолов и других ПАУ (Asimakoula et al., 2023).

Филум Chloroflexota состоял из неклассифицируемых представителей семейств Anaerolineaceae и Dehalococcoidaceae. Микроорганизмы, отнесенные к этим семействам, обнаружены в широком диапазоне анаэробных сред обитания, включая донные отложения, горячие источники, анаэробные реакторы, экотопы, загрязненные углеводородами, где они способны осуществлять синтрофное окисление углеводородов (Anaerolineaceae) с образованием метана при участии метаногенных архей или восстановительное дехлорирование хлорированных углеводородов и галогенорганическое дыхание (Dehalococcoidia) (Liang et al., 2015; Loffler et al., 2015). Филум Bacteroidota представлен семейством VadinHA17, протеолитическими бактериями, ферментирующими углеводы с образованием летучих жирных кислот (Kampmann et al., 2012). ОТЕ, отнесенные к филуму Desulfobacterota, принадлежали анаэробным бактериям, окисляющим органические субстраты (Syntrophaceae, Syntrophobacteraceae) или ацетат (Desulfobacca) в процессе синтрофного роста с метаногенными археями. Нуклеотидные последовательности бактерий филума Nitrospirota составляли от 1 до 11% в анализируемых библиотеках образца К1 и принадлежали неклассифицированным бактериям класса Thermodesulfovibrionia, известным способностью восстанавливать сульфат до сульфида за счет окисления органических субстратов или водорода (Umezawa et al., 2021).

Архейная компонента контрольного осадка К1 была представлена филумами Halobacteriota, Methanobacteriota, Thermoproteota, Thermoplasmatota, Nanoarchaeota и Ca. Hadarchaeota (рис. 5а).

 

Рис. 5. Относительная доля последовательностей фрагментов гена 16S рРНК Achaea, представленных на уровне филумов (а) и родов (б) в библиотеках из донных осадков и накопительных культур. Перечислены таксоны, составляющие >1% хотя бы в одной из библиотек.

 

Доминирующее положение в контрольном осадке и в накопительных культурах К1_SO₄, К1_NO₃ и К1_Fe занимали гидрогенотрофные археи рода Methanoregula (Halobacteriota), где они составляли от 37.8 до 51.7% от состава сообщества, за исключением К1_HCO₃ (3.9%) (рис. 5б). Культивирование осадка К1 с H₂:СO₂ в газовой фазе привело к увеличению доли гидрогенотрофных архей родов Methanobacterium (Methanobacteriota, ранее Euryarchaeota) (20.1%), Methanosphaerula (64.7%) и Methanocella (2.3%) (Halobacteriota) в сравнении с контрольным осадком (до 0.2%). В накопительных культурах К1_SO₄, К1_NO₃ и К1_Fe их доля не превышала 0.3–1.1%. В К1_SO₄ и К1_NO₃ филум Halobacteriota был представлен ацетокластическими археями рода Methanothrix (7.0–9.5%), метанол, моно-, ди- и триметиламин-использующими археями рода Methanomethylovorans (1.3–3.8%) и археями рода Methanosarcina (0.4–1.4%), осуществляющими все известные пути метаногенеза. Среди ОТЕ, отнесенных к филуму Halobacteriota, также выявлены последовательности, принадлежащие Ca. Methanoperedens – археям, осуществляющих анаэробное окисление метана (АОМ) в сочетании с восстановлением нитратов, железа и марганца (Haroon et al., 2013; Cai et al., 2018; Leu et al., 2020). Их представленность была наибольшей в накопительной культуре К1_Fe – 5.2%, наименьшей в К1_HCO₃ – 0.2%.

Филум Thermoproteota (ранее Crenarchaeota) представлен классами Bathyarchaeia, Nitrososphaeria (род Nitrosopumilus) и неклассифицируемыми представителями класса Thermoprotei. Наибольшая доля Bathyarchaeia выявлена в культуре К1_Fe – 32.7%, наименьшая в К1_HCO₃ – 2.8%. В контрольном осадке, К1_SO₄ и К1_NO₃ их доля варьировала от 17.1 до 21.9%. На основе анализа геномов, космополитным археям Bathyarchaeia предсказана способность осуществлять ацетогенез, метаногенез и брожение (Zhou et al., 2018; Hou et al., 2023). Анализ фенотипических и геномных свойств первого культивируемого штамма M17C^Ts, отнесенного к Candidatus Bathyarchaeum tardum gen. nov., sp. nov., показал его способность к использованию сложных белковых субстратов и метоксилированных ароматических соединений (Khomyakova et al., 2023). В накопительных культурах К1_SO₄ и К1_NO₃ выявлена наибольшая доля (5.5–5.9%) последовательностей архей рода Nitrosopumilus, окисляющих аммиак и осуществляющих автотрофную фиксацию углерода через 3-гидроксипропионат/4-гидроксибутиратный путь (Liu et al., 2021).

Филум Thermoplasmatotа был представлен археями рода Methanomassiliicoccus и Marine Benthic Group D (MBG-D), восстанавливающих метанол и окисляющих водород, характеризующихся как космополиты донных осадков, со специфическим миксотрофным метаболизмом, включающим гетеротрофию и автотрофную фиксацию CO₂ (Zhou et al., 2019). Наибольшая доля Methanomassiliicoccus выявлена в К1 (9.4%), К1_SO₄ (3.5%) и К1_Fe (6.7%); MBG-D – в К1_SO₄ (2.9%). Филум Nanoarchaeota состоял, в основном, из ОТЕ, отнесенных к семействам GW2011_GWC1_47_15 и Woesearchaeales – археям, выявленным в различных средах обитания, среди которых нефтяные резервуары и серные источники. Эти археи являются частью консорциума с бактериями, где бактерии участвуют в круговороте углерода, а археи – в фиксации азота, денитрификации и восстановлении сульфата в анаэробных условиях (Liu et al., 2021; Köhler et al., 2023). Их наибольшая доля выявлена в К1 (6.4%), наименьшая – в К1_HCO₃ – 0.4%.

Филогенетическое разнообразие микробного сообщества глубинного осадка и накопительных культур К2. В составе микробного сообществ донного осадка с глубины керна 250 см обнаружены представители 27 филумов домена Bacteria и 10 филумов домена Archaea. Последовательности архей, составляющие более 1% в составе библиотек, выявлены в 11 высших таксонах домена Bacteria и 5 филумах Archaea (рис. 4, 5). Доминирующее положение занимали представители филумов Atribacterota (41.5%) и Chloroflexota (32%). Около 2.2–3.6% последовательностей принадлежало представителям Actinomycetota, Acidobacteriota, Caldisericota, Bacteroidota и Pseudomonadota. Доля Elusimicrobiota, Spirochaetota, Sva0485 и неклассифицируемых Bacteria не превышала 1.6%. Архейная компонента представлена филумами Thermoproteota, Halobacteriota, Thermoplasmatota, Nanoarchaeota и Ca. Hadarchaeota. Филум Thermoproteota представлен классом Bathyarchaeia (44%) и неклассифицируемыми представителями класса Thermoprotei (12%); филум Halobacteriota – родом Methanoregula (13%), Ca. Methanoperedens (3.3%) и родом Methanosaeta (2%); филум Thermoplasmatota – неидентифицированными Methanomassiliicoccaceae (8%) и MBG-D (1.3%). Последовательности филума Ca. Hadarchaeota составляли 2.8–4.3% от общего числа последовательностей в каждой из библиотек К2, в сравнении с библиотеками из образцов К1, где доля этих архей не превышала 0.8%.

Несмотря на различные условия культивирования, накопительные культуры К2, содержащие сульфат- и нитрат-ионы, не отличались значительно по составу бактерий, варьировало соотношение микроорганизмов различных таксономических групп. Общими для этих накопительных культур были последовательности бактерий порядка Aminicenantales (Acidobacteriota), группы WCHB1-81 (Actinomycetota) и рода Caldisericum (Caldisericota). В трех накопительных культурах (К2_HCO₃, К2_SO₄, К2_NO₃) присутствовали Atribacterota (3.1–32%); неидентифицированные представители филума Chloroflexota, семейств Dehalococcoidiacea и Anaerolineaceae (1.65–13.5%) и филума Bacillota, род Herbinix (6.2–27.4%). Представители группы OPB₄₁ (Actinomycetota) и рода Fonticella (Bacillota) выявлены только в культуре К2_HCO₃, а неклассифицируемые бактерии семейства Clostridiaceae, рода Gracilibacter и группы SRB_2 – только в культурах К2_SO₄ и К2_Fe. Последовательности бактерий родов Desulfosporosinus (2.8–74.5%) и Lutispora (1.8–2.3%), обнаружены в библиотеках накопительных культур К2_SO₄ и К2_HCO₃. В накопительных культурах, содержащих железо, доминирующее положение занимали представители родов Gracilibacter, Lachnoclostridium и неклассифицированные Lachnospiraceae. Как и в случае с бактериальной компонентой, культивирование осадка К2 в присутствии различных акцепторов электронов незначительно повлияло на состав архей в накопительных культурах в сравнении с природным осадком. Варьировала доля представителей различных таксонов. Доминирующее положение в библиотеках всех четырех накопительных культур занимали последовательности представителей класса Bathyarchaeia, которые составляли 48.5–67.7% от общего количества прочтений в каждой библиотеке. Филум Thermoproteota также был представлен неклассифицируемыми представителями класса Thermoprotei (8–12.4%). Метаногенные археи были представлены родами Methanoregula, Methanosaeta, Methanomassiliicoccus и неклассифицируемыми представителями семейства Methanomicrobiaceae. Последовательности Woesearchaeales и MBG-D составляли 0.62–1.4% в K2 библиотеках.

Анализ потенциальных функциональных характеристик микробных сообществ с использованием базы данных KEGG (рис. S2) показал, что, бактерии, входящие в сообщество подповерхностного донного осадка K1, обладали потенциальной способностью осуществлять основные пути метаболизма углеводов, липидов и энергетического метаболизма, а также деградацию бифенола, стероидов, толуола, этилбензола и аминобензоата. Изменение условий, в частности, культивирование микробного сообщества в присутствии H₂ : CO₂, привело к экспрессии генов, участвующих в метаболизме серы и азота, а также ответственных за деградацию ПАУ, ксенобиотиков, стирола, солей бензойной кислоты, нафталина и хлорированных углеводородов, в дополнение к функциональным характеристикам, приведенным выше. У архей, входящих в исследуемые сообщества, предсказано наличие ферментов метаболизма метана, фиксации углерода, цикла азота и серы, деградации стеранов, ксилола, ксенобиотиков, толуола, хлоралканов, нафталина, хлорциклогексана, хлорбензола и фторбензоата. Бактерии из глубинного осадка К2 характеризовались, в основном, присутствием генов “домашнего хозяйства” и отсутствием потенциальной способности деградировать углеводороды. Для архей предсказаны функции деградации бензоата, этилбензола, бутирата. Потенциальная способность осуществлять деградацию ксилола, диоксинов, хлоралканов, хлоралкенов и нитротолуола выявлена у бактерий, культивируемых в присутствии H₂ : CO₂ (рис. S2).

Обсуждение

Состав нефти в водной толще и донных осадках исследуемого района указывает на ее биотрансформацию и может быть обусловлен деятельностью микробных сообществ. Об этом свидетельствуют результаты культуральных исследований, показавших биодеградацию компонентов нефти 35% (для н-алканов) и 65% (для ПАУ) анаэробными углеводородокисляющими сообществами, а также молекулярно-экологический анализ филогенетического и функционального разнообразия микробных сообществ. В подповерхностном осадке К1 доминирующее положение занимали микроорганизмы, способные хемогетеротрофно использовать различные соединения посредством аэробного и анаэробного дыхания (Actinomycetota, Acidobacteriota, Nitrospirota, Sva0485, MBNT15), анаэробно окислять метан (Methylomonadaceae, Ca. Methanoperedens), а также синтрофно окислять углеводороды нефти (бактерии филумов Bacillota, Chloroflexiota, Desulfobacterota, Bacteroidota и археи Halobacteriota и Methanobacteriota). Культивирование подповерхностного осадка в различных условиях приводило к увеличению доли бактерий некоторых таксонов, в частности, Bacillota, Pseudomonadota и Actinomycetota в составе накопительных культур. Исследуемый керн К1 имел повышенную минерализацию за счет гидрокарбонат-, сульфат-, нитрат-ионов и ионов хлора (рис. S1). Компонентный состав поровых вод исследуемого керна, вероятно, нивелировал действие добавленных акцепторов электронов в накопительные культуры, что выражалось в доминировании микроорганизмов, сочетающих окисление соединений серы с денитрификацией (Thiobacillus denitrificans) в культурах, содержащих нитрат-ион, или доминирование восстанавливающих соединения азота микроорганизмов в культурах, содержащих сульфат-ион или железо. Об этом свидетельствует обнаружение Ca. Methanoperedens – архей, первоначально описанных, как анаэробно окисляющие метан в сочетании с восстановлением нитрата (Haroon et al., 2013). В настоящее время показано, что в геномах этих архей присутствуют гены, кодирующие путь “обратного метаногенеза”, мультигемовые цитохромы C-типа, которые, как предполагается, способствуют диссимиляционному восстановлению Fe(III), а также гены для окисления водорода и восстановления сульфата при синтрофном взаимодействии с Desulfobacterota (Cai et al., 2018; Bell et al., 2022).

Несмотря на то, что бактерии глубинного осадка К2 характеризовались отсутствием потенциальной способности деградировать углеводороды, сырая нефть, добавленная в накопительные культуры, подвергалась биодеградации, о чем свидетельствует убыль н-алканов и ПАУ. Значимое влияние на биодеградацию н-алканов имело только добавление Fe³⁺. В накопительных культурах, содержащих H₂ : CO₂, SO₄^2– и NO₃^–, степень конверсии н-алканов была одинаковой, так же как и состав микробных сообществ, отличающийся незначительным варьированием процентного содержания микроорганизмов различных систематических групп. В глубинном осадке конверсия углеводородов, вероятно, может проходить при участии представителей филумов Bacillota, Atribacterota, Chloroflexota и класса Bathyarchaeia (Thermoproteota). В настоящее время, на основе метаболической реконструкции геномов Atribacterota и Bathyarchaeia показано, что микроорганизмы могут осуществлять не только ферментацию углеводов, но и окислять короткоцепочечные н-алканы и ароматические соединения до жирных кислот, которые затем потребляются вторичными деструкторами. Окисление н-алканов происходит путем гидроксилирования, добавления фумарата к углеводородам, а также деградации анаэробных ароматических соединений с использованием бензоил-КоА-редуктазы I класса (Dong et al., 2019; Liu et al., 2019; Zhang et al., 2021). В библиотеках генов 16S рРНК из образца К2 в значимых количествах (1.8–4.3%), выявлены последовательности представителей филумов Elusimicrobiota и Ca. Hadarchaeota, которые обычно составляют менее 1% в составе микробных сообществ и являются представителями “редкой биосферы” или “микробной темной материи” (Pascoal et al., 2021). На основании реконструкции геномов этих прокариот показано, что бактерии обладают ферментативным метаболизмом, магнитотаксисом и участвуют в круговороте железа и серы, в то время как археи являются автотрофами, способными осуществлять фиксацию углерода через восстановительный ацетил-КоА путь, метаногенез и метаболизм алканов (Hua et al., 2019; Wang et al., 2019; Uzun et al., 2023). Термофильные облигатные анаэробные гетеротрофы филума Caldisericota, восстанавливающие соединения серы, также входили в число доминирующих таксонов в глубинных осадках. В настоящее время последовательности бактерий этого филума выявляются при анализе гидротермальных экосистем, водоносных горизонтов, загрязненных углеводородами, содовых озер, биореакторов и т.д. (Mori et al., 2009).

Биодеградация нефти накопительными культурами сопровождалась образованием метана в значимых количествах (37.9 мг/л CH₄ = 2.37 ммоль/л CH₄ = 54 мл/л CH₄), что было сравнимо с диапазоном концентрации метана в донных осадках оз. Байкал (от нескольких мкл/л до 20 мл/л) (Pogodaeva et al., 2017). Образование метана при биодеградации нефти показано во многих нефтяных резервуарах (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003; Назина и соавт., 2006; Jones et al., 2008). Расширение геохимической базы данных о газах и нефтях из неглубоких нефтяных скоплений и естественных нефтепроявлений привело к признанию того, что газы, ранее считавшиеся имеющими первичное микробное происхождение, на самом деле образовались из нефти в ходе вторичного метаногенеза (Milkov, 2011).

Схожие процессы образования углеводородных газов происходят и в донных осадках озера Байкал, где в настоящее время установлено более 60 участков, содержащих газогидраты, расположенных в южной и центральной котловине озера (Khlystov et al., 2022). Газ, образующийся в донных осадках озера Байкал, на основе характеристик молекулярного и изотопного состава, отнесен к трем основным типам: термогенный газ, образуемый из сырой нефти, в некоторых случаях сопровождаемый вторичным микробным газом; термогенный газ, поднимающийся из глубоких осадочных слоев через разломы, смешанный с микробным газом в неглубоких слоях; микробный газ, образовавшийся в неглубоких осадочных слоях. Из 60 участков в 21 выявлены газогидраты, содержащие микробный этан (Hachikubo et al., 2023). На эмпирической диаграмме, основанной на классификации Милкова и Этиопа (Milkov, Etiope, 2018), газ из района Бол. Зеленовская имеет ^δ13С С₁…− 45‰ и ^δ2H С₁ − 308‰ и находится за пределами термогенной зоны с соотношением C₁/(C₂ + C₃) равным 274 и небольшим содержанием C₂ и C₃, что указывает на влияние вторичного микробного газа, который образуется при анаэробной биодеградации более тяжелых углеводородов (Hachikubo et al., 2023).

Образование углеводородных газов в экспериментальных условиях установлено не только для осадков из районов нефтепроявлений (Pavlova et al., 2022). В накопительных культурах, содержащих микробное сообщество донных осадков метанового сипа Посольская Банка (Средний Байкал), доля образовавшегося этана в пересчете на углеводородные газы составляла от 1.5 до 26.8% (Павлова и соавт., 2014). Экспериментально доказано образование вторично-микробного газа при разложении углей Танхойской свиты олигоцен-плиоценового возраста, находящихся вдоль южного берега озера Байкал и погружающихся под его Южную котловину, в которой обнаружено несколько зон разгрузки углеводородных флюидов (Крылов и соавт., 2023).

Таким образом, микробное сообщество донных осадков, функционирующее в анаэробных условиях в длительно существующем районе нефтепроявления Бол. Зеленовская, является важным звеном в процессах самоочищения озера от нефтяного “загрязнения”. Микробное сообщество донных осадков представлено бактериями и археями, специализирующимися на процессах разложения широкого спектра субстратов, включая углеводы, пептиды, жирные кислоты и нефтяные углеводороды. В числе основных участников деградации нефти в донных осадках оз. Байкал могут быть синтрофно окисляющие углеводороды нефти бактерии (Bacillota, Gammaproteobacteria, Chloroflexota, Actinomyceota, Desulfobacterota) и археи (Halobacteriota, Bathyarchaeia), входящие в “ядро углеводородокисляющего микробиома”, сходное по составу с микроорганизмами-деструкторами в нефтяных экосистемах в разных частях мира. Генерация метана и этана при биодеградации нефти в экспериментальных условиях может объяснить нахождение газа из района Бол. Зеленовская за пределами термогенной зоны на эмпирической диаграмме по изотопным данным углерода и водорода (Hachikubo et al., 2023) за счет добавления вторичного микробного газа к термогенному.

Финансирование работы

Работа выполнена в рамках темы госзадания № 0279-2021-0006 (121032300223-1).

Соблюдение этических стандартов

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием людей и животных в качестве объектов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

O. N. Pavlova

Limnological Institute SB RAS

Author for correspondence.
Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

S. V. Bukin

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

O. N. Izosimova

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

S. M. Chernitsyna

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

V. G. Ivanov

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

A. V. Khabuev

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

T. V. Pogodaeva

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

I. S. Elovskaya

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

A. G. Gorshkov

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

T. I. Zemskaya

Limnological Institute SB RAS

Email: pavlova@lin.irk.ru
Russian Federation, 664033, Irkutsk

References

Supplementary files