Patterns of biofilm formation by members of Listeria, Salmonella, and Pseudomonas at various temperatures and the role of their synergistic interactions in the formation of biofilm communities

Full Text

Одной из форм выживания микроорганизмов является их способность к формированию биопленок. Активное изучение проблемы началось в конце XX века, когда стало понятно, что многие заболевания вызваны полимикробными биопленками. До сих пор это направление активно развивается главным образом только в медицине. Биопленки представляют собой сложные экосистемы, обычно состоящие из более чем одного вида микроорганизмов, погруженных во множество внеклеточных полимеров, в зависимости от взаимодействия между микробными клетками, поверхности фиксации и условий окружающей среды (Ferreira et al., 2014). По зарубежным оценкам перекрестное заражение в результате развития биопленок является риском, вызывающим 25% вспышек пищевых отравлений. Тем не менее до сих пор применяемые санитарные подходы на предприятиях по переработке продуктов питания не только позволяют биопленкам формироваться и созревать, но также не могут обеспечить их удаление с поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами. Такие структуры обеспечивают защиту, адаптивность и устойчивость микроорганизмов, состоящих в этой матрице, становясь источником загрязнения окружающей среды на пищевых предприятиях и продуктов питания (Kadam et al., 2013; Lee et al., 2017). Бактерии в биопленках, как правило, хорошо защищены от воздействия окружающей среды и антимикробных веществ, таких как антибиотики (Hoiby et al., 2010), дезинфицирующие средства, и, как следствие, их чрезвычайно трудно уничтожить (Burmolle et al., 2010). Особую устойчивость представляют поливидовые биопленки (Wicaksono et al., 2022). Это связано с тем, что они генерируют межвидовые взаимодействия для обмена метаболитами, производства сигнальных молекул и генетического обмена, которые повышают устойчивость (Burmolle et al., 2014; González-Rivas et al., 2018).

Образование биопленок патогенами пищевого происхождения представляет серьезную проблему в пищевой промышленности. Патогенные микроорганизмы способны образовывать биопленки и сохраняться в течение длительного времени, способствуя загрязнению пищевых продуктов. Salmonella sp. и Listeria monocytogenes являются одними из наиболее важных возбудителей болезней пищевого происхождения во многих странах (Margas et al., 2014). Биопленки L. monocytogenes на поверхностях, контактирующих с пищевыми продуктами, были идентифицированы как важный путь персистенции патогенов и последующего загрязнения продукта (Pažin et al., 2018; Rodríguez-Campos et al., 2019). Иногда в сообществах биопленок присутствуют ключевые виды, которые, независимо от их доли, часто участвуют в стимулировании образования биопленки у других видов, а также в защите других членов сообщества от внешних стрессоров (Parijs, Steenackers, 2018; Karki et al., 2021). Бактерии, вызывающие порчу, такие как представители рода Pseudomonas, образуют биопленки, которые обеспечивают защитную матрицу для выживших патогенных клеток, и могут перекрестно загрязнять поверхности на различных этапах производства пищевых продуктов (Lindsay et al., 2002). Важным аспектом, который пока еще не до конца изучен, являются межвидовые взаимодействия в биопленках, распространенных в пищевой промышленности. В этой связи углубленное изучение природы образования, обнаружения и синергетического взаимодействия между микроорганизмами имеет высокую значимость для снижения риска возникновения вспышек болезней пищевого происхождения, влияющих на здоровье населения (Jahid, Ha, 2012).

Большинство исследований, проведенных ранее, были сосредоточены на формировании биопленок патогенами при оптимальных для их роста температурах, которые не являются типичными для производственных помещений на пищевых предприятиях. Однако до сих пор недостаточно информации о способности микроорганизмов формировать биопленки при низких положительных температурах, характерных для пищевых производств, а также о синергетическом взаимодействии различных видов при таких условиях.

Целью исследования было оценить способности бактерий родов Salmonella, Pseudomonas и Listeria (в том числе патогенных L. monocytogenes) формировать биопленки на абиотических поверхностях при различных температурах, а также оценить роль синергетического взаимодействия исследуемых штаммов в формировании биопленочного сообщества.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследований были выбраны 46 штаммов различных видов микроорганизмов, выделенных с объектов производственной среды мясоперерабатывающего и птицеперерабатывающего предприятий и мясных продуктов. Из них 22 представителя рода Pseudomonas, 15 штаммов Listeria sp. (из них 12 штаммов Listeria monocytogenes, 2 штамма Listeria welshimeri и 1 штамм Listeria innocua), 9 штаммов бактерий рода Salmonella. Подробное описание источников выделения штаммов представлено в таблице.

 

Таблица. Характеристика объектов выделения штаммов микроорганизмов, использованных в исследовании

Тип предприятия/ пищевой продукт	Производственное помещение	Объект выделения	Микроорганизм
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Лента транспортера	Listeria monocytogenes (L1)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Внутрицеховая тара	Listeria welshimeri (L2)
Мясоперерабатывающее	Машинное отделение	Клипсатор	Listeria monocytogenes (L3)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Напольная тележка № 1	Listeria monocytogenes (L4)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Напольная тележка № 2	Listeria monocytogenes (L5)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Напольная тележка № 3	Listeria monocytogenes (L6)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Конвейер	Listeria monocytogenes (L7)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Конвейер	Listeria monocytogenes (L8)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Конвейер	Listeria monocytogenes (L9)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Конвейер	Listeria monocytogenes (L10)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Стол из нержавеющей стали (боковая поверхность)	Listeria welshimeri (L11)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Стол из нержавеющей стали (боковая поверхность)	Listeria monocytogenes (L12)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Колесо напольной тележки № 1	Listeria monocytogenes (L13)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Колесо напольной тележки № 2	Listeria monocytogenes (L14)
Мясоперерабатывающее	Сырьевой цех	Колесо напольной тележки № 3	L. innocua (L15)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из свинины (фарш)	Salmonella sp. (S3)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из свинины (фарш)	Salmonella sp. (S10)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из свинины (фарш)	Salmonella sp. (S12)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из свинины и говядины (пельмени)	Salmonella sp. (S17)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из мяса птицы (голень)	Salmonella sp. (S22)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из мяса птицы (филе куриное)	Salmonella sp. (S24)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из свинины (котлета)	Salmonella sp. (S30)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из мяса птицы (голень)	Salmonella sp. (S31)
Пищевой продукт	Цех реализации	Полуфабрикат из свинины (стейк)	Salmonella sp. (S38)
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Внутрицеховая тара	Pseudomonas gessardii
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Металлическая цепь конвейера	Pseudomonas azotoformans
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Лента конвейера упаковочной линии	Pseudomonas mandelii
Птицекомбинат	Цех убоя и первичной обработки тушек, участок потрошения	Цепь конвейера субпродуктов	Pseudomonas marginalis
Птицекомбинат	Цех убоя и первичной обработки тушек, участок удаления пера	Кафельная стена на участке удаления пера	Pseudomonas mendocina
Птицекомбинат	Цех убоя и первичной обработки тушек,	Кафельная стена на участке удаления пера	Pseudomonas mosselli
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Внутрицеховая тара	Pseudomonas orientalis
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Металлическая цепь конвейера	Pseudomonas proteolytica
Птицекомбинат	Цех убоя и первичной обработки тушек	Участок потрошения, машина перенавески (станина)	Pseudomonas putida
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Лента конвейера упаковочной линии	Pseudomonas savastanoi ssp savastanoi
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Машина для обвалки бедра (конденсат с поверхности машины, не контактирующей с продуктом)	Pseudomonas synxantha
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Машина для обвалки бедра (конденсат с поверхности машины, не контактирующей с продуктом)	Pseudomonas tolaasii
Птицекомбинат	Цех убоя и первичной обработки тушек	Кафельная стена на участке удаления пера	Pseudomonas aeroginosa
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Внутрицеховая тара	Pseudomonas azotoformans
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Стена рядом с ванной охлаждения	Pseudomonas brenneri
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Колесо напольной тележки для транспортирования сырья	Pseudomonas fluorescens
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Машина для обвалки бедра (станина)	Pseudomonas fragi
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Стена рядом с ванной охлаждения	Pseudomonas fuscovaginae
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Лента конвейера упаковочной линии	Pseudomonas gessardii
Птицекомбинат	Участок охлаждения парных тушек	Металлическая цепь конвейера	Pseudomonas grimonti
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Машина для обвалки бедра (конденсат с поверхности машины, не контактирующей с продуктом)	Pseudomonas koreensis
Птицекомбинат	Цех разделки и упаковки мяса птицы	Машина для обвалки бедра (конденсат с поверхности машины, не контактирующей с продуктом)	Pseudomonas libanensis

 

Все штаммы были протестированы на их способность образовывать биопленки в монокультуре на полистирольных поверхностях. Образование биопленки бактериями рода Salmonella и Listeria оценивали при 37°C, оптимальной температуре роста исследуемых микроорганизмов, а также при 4°C – низкой положительной температуре, характерной для помещений на пищевых предприятиях. Образование биопленки бактериями рода Pseudomonas оценивали при 4°C.

Для изучения синергетического взаимодействия были сформированы многовидовые биопленки: Pseudomonas tolaasii + Salmonella sp., S31; Pseudomonas tolaasii + Listeria monocytogenes 12; Listeria monocytogenes 12 + Salmonella sp., S31; Pseudomonas tolaasii + Listeria monocytogenes 12 + Salmonella sp., S31.

Определение способности образовывать биопленки. Способность к образованию биопленок изучали in vitro в микротитровальных планшетах. Для этого ночную бульонную культуру бактерий разводили в соотношении 1: 100 в LB бульоне (“Becton Dickinson”, США) и вносили по 150 мкл в лунки 96-луночного плоскодонного полистиролового планшета (“Corning”, США). После инкубации в термостате (“Binder”, Германия) при 37°С во влажной камере, интенсивность роста культуры оценивали в фотометре (Multiskan FC, “Thermo Scientific”, США) при длине волны 540 нм. Затем удаляли планктонные клетки и в лунки вносили по 150 мкл 0.1% раствора кристаллического фиолетового (“Servicebio”, Китай) с экспозицией 1 ч для окраски сформировавшихся биопленок. После окраски биопленки трижды промывали дистиллированной водой с последующим внесением 150 мкл 96% этанола для экстракции связавшегося с биопленками красителя. По истечении 1 ч оптическую плотность красителя, экстрагированного спиртом, измеряли на фотометре при длине волны 540 нм. Контролем служили лунки, заполненные стерильным бульоном. Превышение оптической плотности кристаллического фиолетового над контролем свидетельствовало об образовании бактериями биопленок. Способность штаммов к образованию биопленок (соответственно, и штаммы как продуценты биопленок) классифицировали с использованием следующей шкалы: нет биопленкообразования (OD₅₄₀ = 0) → очень слабое (0 < OD₅₄₀ < 0.2) → слабое (0.2 < OD₅₄₀ < 0.4) → сильное (0.4 < OD₅₄₀ < 1.0) → очень сильное (OD₅₄₀ > 1.0).

Изучение способности формировать биопленки на различных абиотических поверхностях. Для изучения in vitro способности микроорганизмов формировать биопленки на твердых поверхностях заранее подготавливали стерильные образцы подложек (кафель, сталь, серый пластик и белый пластик) размером 0.05 × 0.05 мм и переносили в стерильные пробирки. Ночную бульонную культуру исследуемых бактерий разводили в соотношении 1: 100 LB бульоне (“Becton Dickinson”, США) и вносили в пробирки с подложками в таких объемах, чтобы жидкость полностью покрывала образцы подложек; инкубирование проводили в термостате (ХТ-3/70; ЗАО “Пять Океанов”, Россия) при 4°С. Для визуализации подложки с бактериями, после инкубации и промывания несколько раз физиологическим раствором, окрашивали флуоресцентными красителями Live/Dead Biofilm Viability Kit (“Thermo Fisher”, США) согласно инструкции и проводили микроскопию на микроскопе с флуоресцентным объективом (ВХ43F; “Olympus”, Япония). Живые клетки выявляли по флуоресценции зеленного цвета, а мертвые – красного.

Статистический анализ. Все исследования проводили в двукратной повторности; каждый повтор включал два параллельных опыта. При измерении значения оптической плотности средние значения и экспериментальные ошибки определяли, используя среднее отклонение экспериментальных значений от функции среднего значения с помощью Microsoft Office Excel 2010. Различия между значениями считались значимыми, если они превышали уровень экспериментальной ошибки (обычно 20% или менее), в соответствии с t-критерием Стьюдента для p = 0.05. Результаты были рассчитаны как “среднее значение ± стандартная ошибка”.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В общей сложности 46 бактериальных штаммов, циркулирующих в мясной и птицеперерабатывающей промышленности на объектах производственной среды и различных пищевых продуктах, были протестированы на их способность образовывать биопленки в монокультуре на полистирольных поверхностях. Образование биопленки изолятами оценивали при 37°C ‒ оптимальной температуре роста исследуемых микроорганизмов. В результате оценки биопленкообразующей способности при температуре 37°C среди представителей бактерий рода Listeria установлено, что все штаммы Listeria sp. формировали слабые или сильные биопленки в течение 24 ч культивирования (рис. 1). Такой способностью обладали не только непатогенные виды листерий, такие как Listeria welshimeri и Listeria innocua, но и патогенные ‒ L. monocytogenes.

 

Рис. 1. Формирование биопленок при температуре 37°C бактериями рода Listeria, циркулирующими в мясной промышленности: a – 24 ч инкубирования, b – 72 ч инкубирования; 1 – Listeria monocytogenes (L1), 2 – L. welshimeri (L2), 3 – L. monocytogenes (L3), 4 – L. monocytogenes (L4), 5 – L. monocytogenes (L5), 6 – L. monocytogenes (L6), 7 – L. monocytogenes (L7), 8 – L. monocytogenes (L8), 9 – L. monocytogenes (L9), 10 – L. monocytogenes (L10), 11 – L. welshimeri (L11), 12 – L. monocytogenes (L12), 13 – L. monocytogenes (L13), 14 – L. monocytogenes (L14), 15 – L. innocua (L15), 16 – контроль.

 

Было отмечено, что при 37^оС время инкубирования напрямую влияло на интенсивность формирования биопленок. Адгезия микроорганизмов увеличивалась с увеличением времени культивирования. По истечении 72 ч все 15 штаммов листерий продемонстрировали сильную способность к образованию биопленок.

Salmonella sp. являются одним из наиболее важных возбудителей болезней пищевого происхождения во многих странах, включая Россию. Биопленкообразующая способность штаммов Salmonella sp. также зависела от времени инкубирования (рис. 2). При скрининге 9 штаммов Salmonella sp. в планшетах для микротитрования было обнаружено, что значения OD₅₄₀ варьировало через 24 ч от 0.292 до 0.490, через 48 ч от 0.351 до 0.634 и через 96 ч ‒ от 0.489 до 1.512.

 

Рис. 2. Формирование биопленок при температуре 37°C бактериями рода Salmonella, циркулирующими в мясной промышленности: а – 24 ч инкубирования, b – 48 ч инкубирования, с – 96 ч инкубирования; 1 – Salmonella sp. (S3), 2 – Salmonella sp. (S10), 3 – Salmonella sp. (S12), 4 – Salmonella sp. (S17), 5 – Salmonella sp. (S22), 6 – Salmonella sp. (S24), 7 – Salmonella sp. (S30), 8 – Salmonella sp. (S31), 9 – Salmonella sp. (S38), 10 – контроль.

 

Увеличение времени инкубирования приводило к большему накоплению биомассы культуры. Среди сальмонелл были выделены 3 штамма S10, S12 и S22 с очень сильной биопленкообразующей способностью (оптическая плотность через 96 ч выращивания ‒ более 1.0). Было отмечено, что среди большинства штаммов Salmonella sp. максимальный скачок в накоплении биомассы биопленок происходил после 48 ч культивирования.

Влияние температуры на скорость формирования биопленки. Немаловажное значение в формировании биопленок играет температура. Обычно температура в производственных цехах по переработке мяса, в том числе мяса птицы, составляет не выше 12°C. На многих предприятиях, в целях увеличения сроков годности конечной продукции, в производственных помещениях, где проводятся операции по переработке сырья, температура воздуха снижена до 4‒8°С. Изучение возможности формирования биопленок при низких положительных температурах вносит вклад в понимание механизмов выживания и распространения патогенных микроорганизмов по цепочке производства пищевой продукции. В этой связи способность к образованию биопленки у исследуемых микроорганизмов была оценена при температуре 4°C, имитируя условия окружающей среды на мясоперерабатывающих предприятиях и птицекомбинатах.

Низкая положительная температура (4°C) не являлась ограничивающим фактором в способности образовывать биопленки. Через 24 ч инкубирования представители бактерий рода Listeria, в том числе патогенные Listeria monocytogenes, формировали стойкие биопленки при низкой положительной температуре (рис. 3).

 

Рис. 3. Формирование биопленок при температуре 4°C бактериями рода Listeria, циркулирующими в мясной промышленности: a – 24 ч инкубирования, b – 48 ч инкубирования; 1 – Listeria monocytogenes (L1), 2 – L. welshimeri (L2), 3 – L. monocytogenes (L3), 4 – L. monocytogenes (L4), 5 – L. monocytogenes (L5), 6 – L. monocytogenes (L6), 7 – L. monocytogenes (L7), 8 – L. monocytogenes (L8), 9 – L. monocytogenes (L9), 10 – L. monocytogenes (L10), 11 – L. welshimeri (L11), 12 – L. monocytogenes (L12), 13 – L. monocytogenes (L13), 14 – L. monocytogenes (L14), 15 – L. innocua (L15), 16 – контроль.

 

В первые сутки культивирования при 4°C все штаммы формировали слабые или сильные биопленки, при этом 4 штамма показали себя сильными продуцентами биопленок, в соответствии с выше представленной шкалой. У трех штаммов Listeria monocytogenes 10, L. monocytogenes 11 и L. monocytogenes 15 скорость формирования биопленки была выше при 4°C, чем при 37°C.

Listeria monocytogenes, один из основных патогенов пищевой промышленности, вызывает озабоченность в отношении безопасности пищевых продуктов из-за его способности образовывать биопленку и сохраняться как на объектах пищевой промышленности, так и в пищевых продуктах. Способность L. monocytogenes формировать биопленки при низких температурах, соответствующих условиям внешней среды при переработке и хранении пищевых продуктов, повышает вероятность перекрестного загрязнения. Фенотип биопленки листерий характеризуется повышенной устойчивостью к воздействию окружающей среды, включая устойчивость к антибиотикам и другим дезинфицирующим средствам, что вызывает ряд проблем в здравоохранении, пищевой промышленности и других областях. Проведенные исследования показали, что L. monocytogenes способна формировать биопленки уже за сутки при температуре всего 4°С.

На предприятиях пищевой промышленности потенциальными источниками загрязнения L. monocytogenes являются абиотические поверхности производственной среды, такие как стены и пол, системы очистки воздуха, вспомогательное оборудование (Ciccio et al., 2012). На формирование биопленки L. monocytogenes влияет множество условий: температура окружающей среды (Bonaventura et al., 2008; Moltz, Martin, 2005), характер адгезионной поверхности и ее гидрофобность (Midelet et al., 2006). В аналогичном исследовании Di Bonaventura et al. (2008) проанализировали образование биопленки 44 различными изолятами L. monocytogenes на разных поверхностях при четырех температурах (4, 12, 22 и 37°C). Согласно полученным результатам, L. monocytogenes были способны образовывать биопленки при 4 и 12°C с более высокой интенсивностью на стекле по сравнению с более гидрофобной нержавеющей сталью и полистиролом. С другой стороны, Bonsaglia et al. (2014) наблюдали образование биопленки при температурах, подобных температуре холодильных камер (4°C) на разных поверхностях, с более высоким уровнем биопленкообразования на нержавеющей стали и стекле по сравнению с полистиролом. Также Norwood, Gilmour (2001) сообщили о двух изолятах L. monocytogenes, которые обладали одинаковой способностью к адгезии при 4 и 30°C.

Исследованные штаммы бактерий рода Salmonella sp. обладали способностью формировать биопленки при 4°С, в целом, незначительно уступавшей способности, продемонстрированной при 37°C (рис. 4).

 

Рис. 4. Формирование биопленок при температуре 4°C бактериями рода Salmonella, циркулирующими в мясной промышленности: а – 24 ч инкубирования, b – 48 ч инкубирования, с – 96 ч инкубирования; 1 – Salmonella sp. (S3), 2 – Salmonella sp. (S10), 3 – Salmonella sp. (S12), 4 – Salmonella sp. (S17), 5 – Salmonella sp. (S22), 6 – Salmonella sp. (S24), 7 – Salmonella sp. (S30), 8 – Salmonella sp. (S31), 9 – Salmonella sp. (S38), 10 – контроль.

 

Способность к образованию биопленки Salmonella sp. в зависимости от времени инкубирования варьировала от слабой до сильной. Через 48 ч инкубирования только два штамма ‒ Salmonella sp. S12 и Salmonella sp. S22 ‒ были отнесены к сильным продуцентам биопленок. Однако к 96 ч инкубирования только один штамм S30 оставался слабым продуцентом биопленки. Оставшиеся штаммы продемонстрировали прирост биомассы и являлись сильными и очень сильными продуцентами биопленок. Было отмечено, что для формирования биопленок бактериями рода Salmonella необходимо более длительное время. Снижение температуры инкубации может уменьшить рост бактерий, но также может способствовать образованию биопленки, поскольку штаммы способны экспрессировать компоненты, которые не были продуцированы в других благоприятных условиях, однако для этого может быть необходимо более длительное время (Stepanović et al., 2003; Lianou, Koutsoumanis, 2012).

Несмотря на медленное формирование биопленочных сообществ штаммами Salmonella sp., другими авторами также была установлена способность сальмонелл образовывать биопленки при низких положительных температурах. Так, показана возможность формирования биопленки у 39.5% исследуемых штаммов при 3°C – температуре, соответствующей холодильному хранению пищевых продуктов (Borges et al, 2018).

Способность к адгезии на различных поверхностях проявляют не только патогенные микроорганизмы, но и условно-патогенные, например, представители рода Pseudomonas. Бактерии рода Pseudomonas легко образуют биопленки на различных типах поверхностей (Masák et al., 2014). В проведенном исследовании все штаммы Pseudomonas sp. проявляли сильную способность к адгезии на абиотической поверхности через 48 ч (рис. 5). Значение OD₅₄₀ варьировало от 0.495 до 0.997. Увеличение времени культивирования проводило к дальнейшему формированию и нарастанию биопленки. После 72 ч инкубирования 4 представителя Pseudomonas показали способность к очень сильному образованию биопленок (OD₄₅₀ > 1.0).

 

Рис. 5. Формирование биопленок при температуре 4°C бактериями рода Pseudomonas, циркулирующими в мясной промышленности: а – 48 ч инкубирования, b – 72 ч инкубирования; 1 – Pseudomonas gessardii, 2 – P. azotoformans, 3 – P. mandell, 4 – P. marginalis, 5 – P. mendocina, 6 – P. mosselli, 7 – P. orientalis, 8 – P. proteolytica, 9 – P. putida, 10 – P. savastanoi spp, 11 – P. synxantha, 12 – P. tolaasii, 13 – P. aeruginosa, 14 – P. azotoformans, 15 – P. brenneri, 16 – P. fluorescens, 17 – P. fragi, 18 – P. fuscovaginae, 19 – P. gessardii, 20 – P. grimonti, 21 – P. koreensis, 22 – P. libanensis, 23 – контроль.

 

Увеличение времени инкубирования до 72 ч не у всех исследуемых штаммов сопровождалось увеличением биомассы. У 9 видов Pseudomonas gessardii, P. mandell, P. marginalis, P. mendocina, P. mosselli, P. orientalis, P. proteolytica, P. putida, P. savastanoi spp., P. synxantha, P. tolaasii, P. aeruginosa, P. azotoformans, P. brenneri, P. fluorescens, P. fragi, P. fuscovaginae с 48 до 72 ч культивирования прирост биомассы происходил не более, чем на 0.1 единицу оптической плотности. В то же время у двух штаммов P. aeroginosa и P. azotoformans значение оптической плотности увеличилось более, чем в 2 раза, что свидетельствовало об интенсивном формировании биопленок. Тем не менее все исследуемые представители Pseudomonas sp. были отнесены к сильным продуцентам биопленок.

Для подтверждения формирования биопленок были сформированы биопленки при 4°С на стеклянной поверхности с дальнейшим окрашиваем флуоресцентными красителями, позволяющими дифференцировать живые и мертвые клетки. С помощью флуоресцентной микроскопии было подтверждено, что изучаемые микроорганизмы формировали биопленки на стеклянной поверхности (рис. 6).

 

Рис. 6. Биопленки микроорганизмов на поверхности стекла, сформированные в течение 24 ч при 4°С. Флуоресцент ная микроскопия, краситель SYTO© 9. Масштабная линейка ‒ 50 мкм.

 

Поскольку биопленки могут присутствовать на абиотических поверхностях пищевых производств, была изучена способность формирования биопленки (на примере патогенной Listeria monocytogenes 12) на материалах, разрешенных для производственной среды предприятий и широко применяемых для изготовления разделочных досок, столешниц, раковин, технологического и вспомогательного оборудования и пр. В качестве таких материалов были выбраны кафель, нержавеющая сталь и два вида пластика (белый и серый). Снимки, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии и подтверждающие формирование биопленок, представлены на рис. 7.

 

Рис. 7. Биопленки Listeria monocytogenes 12, сформированные на различных абиотических поверхностях в течение 24 ч при 4°С. Масштабная линейка ‒ 50 мкм.

 

Как показано на рис. 7, биопленки, сформированные Listeria monocytogenes 12, демонстрировали зеленую флуоресценцию, что свидетельствовало о наличии “живых” микроорганизмов. Клетки равномерно распределялись на различных абиотических поверхностях через 24 ч после начала образования биопленки.

Роль синергического взаимодействия различных штаммов в формировании биопленочного сообщества. В природе биопленки обычно состоят из нескольких видов бактерий, включая как патогены пищевого происхождения, так и условно-патогенные микроорганизмы. Лучшее понимание синергетического взаимодействия между видами и того, как эффективно удалять биопленки смешанных видов с абиотических поверхностей на предприятиях пищевой промышленности, может помочь снизить риск загрязнения пищевых продуктов. Было изучено образование биопленок смешанных видов представителей родов Listeria (b), Salmonella (с) и Pseudomonas (а) при 4°С (рис. 8).

 

Рис. 8. Синергетические взаимодействия при формировании биопленок трех видов штаммов при температуре 4°C: 1 – 24 ч инкубирования, 2 – 48 ч инкубирования; A – Pseudomonas tolaasii; B – Salmonella sp. (S31); C – Listeria monocytogenes (L12).

 

Развитие биопленки при совместном культивировании представителей родов Pseudomonas и Salmonella значительно усиливалось, особенно через 48 ч (рис. 8). Вероятнее всего, это связано с более интенсивной способностью Pseudomonas как к росту, так и к формированию биопленки. Смешанные биопленки, в состав которых входит Pseudomonas sp., развивались быстрее и достигали больших значений OD₅₄₀, чем моновидовые биопленки патогенных микроорганизмов. Через 24 ч инкубирования наибольшая синергия (увеличение массы биопленки) в биопленках наблюдалась в комбинации AB, AC и ABC, в состав которых входил Pseudomonas tolaasii, который был способен быстро образовывать сильную биопленку в монокультуре. При увеличении времени инкубирования до 48 ч, по-прежнему наибольший синергический эффект наблюдался в тех же комбинациях. Смешанная биопленка Salmonella sp., S31 + Listeria monocytogenes 12 обладала наименьшей синергией, как через 24, так и через 48 ч культивирования. Биопленка из комбинации двух патогенных микроорганизмов была более интенсивна по сравнению с их монобиопленками, однако комбинации патогенного микроорганизма и представителя рода Pseudomonas значительно отличались по интенсивности формирования биопленок. Это указывает на значимость этого вида в синергетическом взаимодействии среди микроорганизмов в процессе образования биопленок.

Изучение синергетических и негативных взаимодействий в биопленках ведется постоянно. Недавние исследования показали, как присутствие определенных видов бактерий в сообществе значительно влияет на потенциал формирования биопленки или на рост других видов либо в результате кооперативного, либо конкурентного взаимодействия. Например, было показано, что присутствие антагонистических веществ, продуцируемых штаммами B. cereus, негативно влияло на рост Listeria monocytogenes в двухвидовых биопленках (Alonso et al., 2020). В другом исследовании сообщалось, что Pseudomonas putida, вид бактерий, обитающий в системах питьевой воды на птицефермах, ингибирует рост и образование биопленки Salmonella java в смешанной культуре (Maes et al., 2020). Штаммы L. monocytogenes пищевого происхождения демонстрируют значительные различия в конкурентном росте в различных условиях биопленки со смешанными видами (Heir et al., 2018). Наши результаты показали, что синергетические взаимодействия в многовидовых биопленках зависят от видового состава. Sadiq et al. (2023) при исследовании многовидовых биопленок, образованных изолятами, полученными из производственной среды мясоперерабатывающих предприятий, установили, что P. azotoformans способствовал образованию синергетической биопленки чаще, чем другие, поскольку он являлся частью всех четырех видовых комбинаций биопленок, демонстрирующих более высокий синергизм (Sadiq et al., 2023).

Выявленная способность к формированию биопленок у всех исследуемых штаммов может привести к усилению патогенности и провоцировать проблемы с безопасностью пищевых продуктов. В проведенном исследовании было отмечено, что на образование биопленки исследуемыми микроорганизмами влияли как температура инкубации, так и время. Биопленки патогенных Salmonella sp. и Listeria monocytogenes с OD₅₄₀ > 0.4 могут быть получены при 4°C уже через 24 ч инкубации. L. monocytogenes и представители бактерий рода Salmonella способны образовывать биопленки и сохраняться в течение длительного времени, способствуя загрязнению пищевых продуктов (Doijad et al., 2015; Borges et al., 2018). Смешанные биопленки, включая патогенные и непатогенные виды, проявляют большую устойчивость к воздействию физических и химических факторов (Li et al., 2021). Для контроля присутствия и образования такой устойчивой формы патогенов должны применяться эффективные стратегии предотвращения или уничтожения биопленок.

Помимо использования оптических методов, в данном исследовании были использованы и микроскопические методы (флуоресцентная микроскопия) оценки возможности формирования биопленок на нержавеющей стали, стекле и пластике. Таким образом, в результате двух подходов была показана возможность формирования биопленок на абиотических поверхностях из различных материалов, применяемых в пищевой промышленности.

Все комбинации биопленок, продемонстрировавшие заметную синергию, имели в составе представителя рода Pseudomonas, что может указывать на наличие ключевых отраслевых видов бактерий, которые стимулируют синергию или антагонизм, и это может иметь значение для контроля биопленок в соответствующих отраслях пищевой промышленности.

Полученные данные по способности исследованных штаммов к формированию биопленок в течение 24 ч при низкой положительной температуре показали, что для объективной характеристики микробного сообщества производственной среды пищевых предприятий необходимо, наряду с отбором и изучением планктонной микрофлоры, проводить отбор и исследование биопленочных форм.

В результате исследований подтверждено образование биопленок всеми штаммами родов Listeria, Salmonella и Pseudomonas, выделенными из производственной среды мясоперерабатывающих и птицеперерабатывающих предприятий, а также из мясной продукции. Определено влияния времени инкубирования при низких положительных температурах на скорость образования и оптическую плотность биопленок у исследованных штаммов микроорганизмов. Показано, что Listeria monocytogenes, Salmonella sp. и Pseudomonas sp. способны формировать биопленки в монокультуре при низкой положительной температуре (4°С). Установлена значимость представителя рода Pseudomonas в синергетическом взаимодействии микроорганизмов при формировании многовидовых биопленок. Результаты проведенных исследований имеют высокую значимость для пересмотра гигиенических планов предприятий и повышения микробиологической безопасности мясной продукции, в том числе, изготовленной из мяса птицы.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Yu. K. Yushina

Federal Scientific Center for Food Systems named after V.M. Gorbatov RAS

Author for correspondence.
Email: yu.yushina@fncps.ru
Russian Federation, 109316, Moscow

E. V. Zaiko

Federal Scientific Center for Food Systems named after V.M. Gorbatov RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru
Russian Federation, 109316, Moscow

M. A. Grudistova

Federal Scientific Center for Food Systems named after V.M. Gorbatov RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru
Russian Federation, 109316, Moscow

A. A. Semenova

Federal Scientific Center for Food Systems named after V.M. Gorbatov RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru
Russian Federation, 109316, Moscow

A. A. Makhova

Federal Scientific Center for Food Systems named after V.M. Gorbatov RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru
Russian Federation, 109316, Moscow

D. S. Bataeva

Federal Scientific Center for Food Systems named after V.M. Gorbatov RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru
Russian Federation, 109316, Moscow

E. V. Demkina

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, 119071, Moscow

Yu. A. Nikolaev

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” RAS

Email: yu.yushina@fncps.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, 119071, Moscow

References

Supplementary files